載cxcr4小分子rna聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種載CXCR4小分子RNA聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒及其制備方法，其特征在于以聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物為載體，CXCR4小分子RNA與聚酰胺樹枝狀聚合物按1∶0.73(質量比)，形成聚酰胺樹枝狀聚合物CXCR4小分子RNA交聯復合物，微球粒徑在25℃時平均粒徑為176.5納米。所得納米微粒粒徑小，對小分子RNA包裹率高，攜帶量大，增加細胞轉染率，具有小分子干擾技術高效、特異的優點。疾病治療中用于抗腎癌治療，提高基因抗腎癌治療效果。
【專利說明】
載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種新型藥物劑型，具體為載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物 納米微粒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 基質細胞衍生因子-1 (stromal ceU-derived factorl, SDF-1)是趨化因子家族 的一個新成員，其唯一受體趨化因子受體4(chemokine receptor4, CXCR4)廣泛表達在許 多組織和器官上。近幾年來國內外有關研究表明SDF-1/CXCR4生物學軸在腎癌細胞的轉 移、調亡等方面發揮著重要的作用。CXCR4的過度表達，可W促進腎癌細胞的增殖，而抑制 CXCR4的表達則可W起到誘導腎癌細胞調亡的效果，并對腎癌的轉移起到抑制的作用。
[0003] 反義技術是近年腫瘤治療研究的一種有效基因治療手段，對于封閉有害基因表 達，阻斷腫瘤發生發展具有重要價值。在各種反義手段中，新近出現的核糖核酸干擾（RNA interference, RNAi)技術尤其引人注目，是指由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平關閉相應序列基因表達的過程，具有特異、高效的特點，作為新興的基因 阻斷技術，將在人類基因功能研究、基因治療方面具有巨大的應用前景。而shRNA是核糖核 酸干擾技術中最關鍵的效應分子。
[0004] 納米技術作為一口新興學科已交叉滲透到其它眾多學科領域，在生物醫藥領域的 最突出表現在于其作為藥物載體具有廣闊的應用前景。最近國外采用聚醜胺-胺型樹枝狀 聚合物（PAMAM den化imers)較W往采用的聚乳酸-居基己酸共聚物（PLGA)等納米載體比 較具有攜帶量更大、透膜能力更強、緩釋性更好、對人體無害等多方面的優點，但迄今國內 外均未見聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物攜帶CXCR4小分子RNA的報道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于W 7代佑7)的聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物作為載體，將其與 CXCR4小分子RNA相結合，制備出載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒。該納 米微粒可較大的提高小分子RNA的攜帶量、轉染率，增強小分子RNA的祀向特異性，且對人 體無毒，較好的提高了 CXCR4小分子RNA抗腎癌治療效果。
[0006] 本發明提出的上述載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒具體制備步 驟如下：
[0007] 精密提取1 0D小分子RNA離必，用45微升的超純水稀釋，得到溶液A ;取15微升 7代聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物（G,代PAMAM demlrimers)溶液用30微升超純水稀釋得溶 液B ;取B溶液1微升稀釋到15微升得溶液C ;取A溶液1微升，C溶液5微升，加入15微升 無血清培養基中，使CXCR4小分子RNA與聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物的質量比為1 : 0. 73， 在室溫下賠育10分鐘，即得載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒。
[0008] 本發明的納米藥物是W聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物為載體，與CXCR4小分子RNA 相互交聯形成納米微粒。該種納米微粒平均粒徑在25°C為176. 5納米，且在體外可較好的 保護小分子RNA免受破壞。
[0009] 上述微粒的載體為7代聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物。
[0010] 上述微粒的攜帶物為CXCR4小分子RNA。
[0011] 上述納米微粒具有攜帶RNA量大，保護性好等優點，可提高小分子RNA的轉染率。
[0012] 本發明中，所用的納米載體可W是各代聚醜胺樹形分子其中的一種（包括Gi、G2、 G3、G4、Gs、G6 等）。
[0013] 本發明中，所用的媒介為無血清培養液。
[0014] 本發明研制的載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒，其平均粒徑在 25°C為 176. 5 納米。
[0015] 本發明研制的載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒，其攜帶RNA 的量可通過調節CXCR4小分子RNA與聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物的質量比進行調整，W 1 : 0.73的比例可達到完全包裹。
[0016] 目前，國際上攜帶小分子RNA的研究多偏重于W脂質體、病毒為載體，本發明研制 的納米微球具有W下優點；1、新型納米載體聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物屬于非生物材料， 對人體細胞無毒，也沒有免疫原性，不會引起機體免疫反應；2、與病毒載體不同，無遺傳毒 性與細胞毒性；3、由于其特殊的樹枝狀結構（具有極大的比表面），攜帶小分子RNA量大； 4、納米載體與小分子RNA相結合后，可較好的保護小分子RNA片斷不被RNA酶降解；5、新型 納米載體可明顯提高小分子RNA轉染率，提高胞內濃度；6、小分子RNA技術具有特異、高效 的特點，可明顯抑制生存素基因的表達；7、該載體系統可緩慢的釋放藥物，維持有效的藥物 濃度；8、與質粒、病毒等介導的載藥體系比較，具有較好的體外可操控性。
【具體實施方式】
[0017] W下通過試驗進一步闡明本發明所述藥物的有益效果。
[0018] 試驗例1.載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒對腎癌細胞（A498) 的抑制作用
[0019] 采用Μ?Τ法觀察載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒對腎癌細胞增 殖的抑制作用。本實驗共分Η組：第1組CXCR4小分子RNA溶液（其濃度分別為0. 1、1. 0、 10 μ mol/L)，第2組載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒溶液（其CXCR4小 分子RNA實際濃度與第1組對應相同），第3組聚醜胺樹枝狀聚合物溶液（其質量與第2 組對應相同），每組設3復孔，W不加藥物組為空白對照。分別在加藥后2地，4她，7化加 入MTT溶液繼續培養4h后，去除上清液后，加入DMS0 150 μ 1/孔，震蕩、溶解，于570皿波 長處測定吸光度值（Α570)，并計算抑制率，抑制率=(1-實驗組平均Α570/對照組平均 Α570)Χ100%。結果見表 1。
[0020] 表1不同濃度的CXCR4小分子RNA及載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物 納米微粒對腎癌Α498細胞生長的影響
[0021]
[0022] 通過MTT實驗可W表明，載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒可W 明顯抑制A498細胞的增殖，且隨著藥物作用時間的延長，藥物濃度的增加，其抑制效果越 明顯。此外，在相同的藥物濃度及同樣的作用時間下，載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚 合物納米微粒對A498細胞的抑制作用要超過CXCR4小分子RNA組。
[0023] 試驗例2. RT-PCR檢測載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒轉染后 A498細胞CXCR4 mRNA的表達
[0024] 采用RT-PCR法觀察載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒轉染A498 細胞后對CXCR4 mRNA表達的抑制作用。將A498細胞按5 X 10^皿接種到培養皿內，在每 個培養皿內分別加入Η組藥物（第一組；lOumo/L的CXCR4小分子RNA溶液，第二組；含相 同CXCR4小分子RNA濃度的載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒溶液，第Η 組：與第二組同質量的聚醜胺樹枝狀聚合物完全培養液），經過4化培養后，收集細胞，提取 細胞總RNA及逆轉錄cDNA操作，數據采用儀器自帶軟件（ΑΒΙ Prism 7300)進行分析，每個 樣品的祀基因的相對mRNA表達水平按W下公式計算；相對mRNA表達=2 100%，Act 值=祀基因 Ct值-GAPDH Ct值。結果見表2。
[00巧]表2 Η組細胞CXCR4 mRNA表達的RT-PCR檢測結果 [0026]
[0027] RT-PCR檢測結果表明載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒組與 CXCR4小分子RNA組的mRNA表達分別為1. 24%和3. 06%，前者CXCR4 mRNA的表達為后者 的 40. 5%。
[0028] 本發明的目的在于W 7代佑7)的聚醜胺-胺型樹枝狀聚合物作為載體，將其與 CXCR4小分子RNA相結合，制備出載CXCR4小分子RNA聚醜胺樹枝狀聚合物納米微粒。該納 米微粒可較大的提高小分子RNA的攜帶量、轉染率，增強小分子RNA的祀向特異性，且對人 體無毒，較好的提高了 CXCR4小分子RNA抗腎癌治療效果。在疾病治療中可用于抗腎癌治 療，提高基因抗腎癌治療效果。
【主權項】
1. 一種載CXCR4小分子RNA聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒，其組成包括聚酰胺一胺 型樹枝狀聚合物、CXCR4小分子RNA，其特征在于以聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物為載體，使 CXCR4小分子RNA與聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物的質量比為1 : 0. 73,形成聚酰胺樹枝狀 聚合物生存素小分子RNA交聯復合物，微球粒徑在25°C時平均粒徑為176. 5納米。2. 根據權利要求1所述的一種載CXCR4小分子RNA聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒，其 特征在于由如下步驟制備： 取IOD CXCR4小分子RNA離心，用45微升的超純水稀釋，得到溶液A ; 取15微升第7代聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物溶液用30微升超純水稀釋得溶液B ; 取B溶液1微升稀釋到15微升得溶液C ; 取A溶液1微升，C溶液5微升，加入15微升無血清培養基中，使CXCR4小分子RNA與 聚酰胺一胺型樹枝狀聚合物的質量比為1 : 0.73,在室溫孵育lOmin，即得載CXCR4小分子 RNA聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒。3. 根據權利要求1所述的一種載CXCR4小分子RNA聚酰胺樹枝狀聚合物納米微粒在疾 病治療中用于抗腎癌治療。
【文檔編號】A61K47/48GK105879055SQ201410631214
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月11日
【發明人】董勤
【申請人】董勤