金精三羧酸在制備靶向趨化因子受體的藥物中的用途
【專利摘要】本發明涉及金精三羧酸（ATA）作為非選擇性趨化因子受體抑制劑的用途。ATA可以抑制CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6等趨化因子受體介導的細胞信號轉導及細胞遷移。此外，本發明還提供了ATA在制備用于預防和/或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。本發明提供的趨化因子受體抑制劑ATA可用于治療包括多發性硬化癥、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡和炎癥性腸病等在內的多種自身免疫性疾病。
【專利說明】金精三羧酸在制備靶向趨化因子受體的藥物中的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，具體而言，涉及金精三羧酸在制備靶向趨化因子受體的藥物中的用途，進而涉及金精三羧酸在制備預防和/或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]多發性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)是一種發生在中樞神經系統中的自身免疫性疾病，表現為中樞神經系統的脫髓鞘及神經退行性病變。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)的病理特征與 MS 相似，是研究 MS 的理想動物模型。被廣泛接受的觀點認為，CD4+T細胞的過度活化，尤其是輔助型T細胞I (Thelper-lcell，Th-l)或者輔助型T細胞17 (T helper_17cell，Th_17)兩種亞群的過度活化，是導致這種疾病的直接原因。在EAE動物模型中，血腦屏障的完整性被破壞，外周致炎性CD4+T細胞向中樞神經系統中浸潤，并引起其他免疫細胞的聚集，激活小膠質細胞，最終導致神經髓鞘脫落，軸突損傷，影響神經沖動的傳導并可致癱瘓。
[0003]T細胞的活化和分化需要抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells, APCs)的參與。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是專職的抗原遞呈細胞，其在EAE的發病過程中發揮了非常重要的作用。外周組織中的未成熟DC，尤其是與周圍環境接觸的組織，像皮膚和黏膜中的DC，一旦遇到抗原，未成熟DC即會將它們撲捉，加工成小肽，由主要組織相容性復合物分子將其遞呈到細胞表面。同時，來自病原體或炎癥因子的信號啟動DC的成熟過程，進一步加強它們的抗原遞呈能力。成熟DC攜帶抗原，從組織中遷出，到達次級淋巴器官。在這里，DC通過細胞與細胞的接觸和細胞因子的分泌，刺激T細胞的增殖和分化，從而啟動抗原特異性免疫反應。
[0004]成熟DC細胞向次級淋巴器官的遷移以及致病性T細胞向中樞神經系統的遷移很大程度上受趨化因子的調控。趨化因子可被廣泛的分為兩大類:誘導表達的趨化因子和組成性表達的趨化因子。組成性表達的趨化因子誘導基本的白細胞遷移轉運，形成次級淋巴器官的構成體系，而誘導表達的趨化因子主要招募白細胞對生理應激產生反應，刺激炎性細胞向炎癥組織的遷移。許多研究已經證明，在EAE的過程中多種趨化因子的表達會上調。通過趨化因子的特異抗體干預其功能后，能很好地抑制或緩解EAE的病情。趨化因子根據其N末端非常保守的半胱氨酸殘基被分為四類:CXC，因其臨近的兩個半胱氨酸殘基之間有一個氨基酸殘基；CC，兩個保守的半胱氨酸殘基緊鄰；CX3C，兩個保守的半胱氨酸殘基之間被3個氨基酸殘基隔開；C，此類趨化因子N末端只有一個保守的半胱氨酸殘基。其中，CXC和CC是兩類最主要的趨化因子家族。因此，本發明人以這兩類趨化因子的受體作為主要的研究對象。趨化因子通過趨化因子受體來發揮其功能，一種趨化因子可以成為多個趨化因子受體的配體，一個趨化因子受體也可以有多個趨化因子配體。趨化因子受體是一類具有七次跨膜結構的G蛋白偶聯受體，且大部分與Gai偶聯，其轉導的信號可被百日咳毒素所抑制。趨化因子受體，在很多細胞中表達，如T細胞、中性粒細胞、單核細胞、單核細胞來源的巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞等參與炎癥和免疫反應的細胞，不僅如此，在小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元和內皮細胞等中樞神經系統的細胞中也有表達。不同的免疫細胞，其表面特異性高表達的趨化因子受體也有所不同，如成熟DC高表達CCR7，Thl細胞高表達CCR5和CXCR3，而Thl7細胞特異性高表達CCR6。因此，可以通過干預這些趨化因子受體的功能，抑制相應的細胞向炎癥部位的遷移，達到緩解EAE病情的目的。

【發明內容】

[0005]本發明人致力于研究自身免疫性疾病的發病原因和機理，以及趨化因子受體抑制劑在治療自身免疫性疾病中的用途。在化合物篩選中，發明人發現金精三羧酸(Aurintricarboxylic acid,ATA)可以抑制多種趨化因子受體介導的細胞信號轉導及細胞遷移，這些趨化因子受體包括 CCR2，CCR4，CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5，CXCR6。ATA是一種蛋白-核酸相互作用的抑制劑，因此能夠抑制許多涉及DNA或RNA的酶類。其銨鹽被稱作鋁試劑，用來檢測水、生物組織和食物中的鋁含量。此外，ATA被發現可通過阻斷HIV外殼蛋白gpl20和CD4分子的結合發揮抗HIV活性。本發明中，發明人發現ATA能顯著減輕小鼠EAE模型的臨床癥狀及病理改變。炎癥細胞的過度激活及對組織的浸潤是許多自身免疫疾病(包括多發性硬化癥、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、炎癥性腸病等)的共同特征。機制研究顯示，ATA并不直接影響致病性Thl或Thl7細胞的分化，而是通過抑制抗原遞呈的DC細胞向脾臟內的遷移聚集，從而減少T細胞的活化和分化；ATA還能抑制致病性T細胞向中樞神經系統中的遷移浸潤，從而緩解疾病。
[0006]因此，本發明的一個目的是提供ATA或含有ATA的藥物組合物在制備靶向趨化因子受體的藥物中的用途。
[0007]本發明的另一個目的是提供ATA或含有ATA的藥物組合物在制備用于預防和/或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
[0008]本發明中，優選地`，所述趨化因子受體包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4, CXCR5, CXCR6。
[0009]本發明中，優選地，所述趨化因子受體為選自CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4, CXCR5和CXCR6中的一種或多種。
[0010]本發明中，優選地，金精三羧酸同時靶向3個以上的所述趨化因子受體。
[0011]本發明中，優選地，所述自身免疫性疾病包括多發性硬化癥、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)。
[0012]此外，本發明還提供了一種預防和/或治療自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的對象施用治療有效量的ATA或含有ATA的藥物組合物。
[0013]本發明中，優選地，所述含有ATA的藥物組合物包含治療有效量的金精三羧酸和任選的可藥用載體。
[0014]本發明與現有趨化因子抑制劑相比，具有如下優點；
[0015]ATA 可同時靶向包括 CCR2，CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR6 等在內的多個趨化因子，同時抑制DC細胞向二級淋巴器官的遷移及致病性T細胞向中樞神經系統的遷移，在自身免疫病發病的多個環節同時起到抑制作用，與靶向單個趨化因子的藥物相比，可能具有更好的療效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1顯示ATA抑制趨化因子受體的功能。其中:
[0017]A為顯示ATA的分子結構式的圖。
[0018]B為顯示ATA抑制趨化因子激起的鈣流反應的圖。穩定表達Ga 16及各個受體(CCR6、CCR7、CXCR4、SlPU KOR 或 β 2AR)的 ΗΕΚ293 或 CHO 細胞系，與染料 fluo4_AM 孵育45分鐘后，先和ATA預孵育10分鐘，然后再用相應配體(30nM)刺激，記錄鈣信號。數據來自三次獨立實驗，每次實驗三復孔，表示為平均值土標準誤差(mean土SEM)。
[0019]C為顯示ATA抑制趨化因子誘導的細胞趨化的圖。分離自雌性C57/B6小鼠的脾細胞，用?ο μ g/ml LPS刺激48小時后加入到TnmswdlK穿膜小室夾層培養體系的上層小室內，上下層小室以帶微孔的膜隔開；SDF-1、CCL19、CCL20或SlP (均為30nM)等能誘導細胞遷移的因子加入到下層小室內；不同濃度的ATA被加入到上層及下層小室。3小時后，從上層小室遷移到下層小室的細胞通過流式細胞儀計數。數據來自三次獨立實驗，每次實驗三復孔，表示為平均值土標準誤差。
[0020]D為顯示ATA抑制趨化因子受體內吞的圖。表達CXCR4、CCR6或SlPl受體的細胞在ATA存在或不存在的情況下，以相應的配體刺激后，進行受體免疫熒光染色，觀察其定位情況。無尾箭頭所指為受體定位于膜上，有尾箭頭所指為受體內吞后進入胞內形成的內吞點。
[0021 ] 圖2顯示ATA減輕EAE的臨床癥狀及組織損傷。其中:
[0022]用M0G35_55免疫雌性C57/B6小鼠誘導EAE，從免疫后第3天(A)、第12天(C)起每天一次腹腔給藥至實驗結束；或從第3天開始，給藥至第12天(B);對照組給予磷酸緩沖液，每天記錄臨床評分。數據表示為平均值土標準誤差(每組為6只小鼠)。.ρ < 0.001，#p
<0.05 (雙方向方差檢驗(two-way ANOVA test));與對照組相比，*p < 0.05，**p < 0.01(曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test))。D和E為正常或免疫后對照組及ATA給藥組(20mg/kg，第3天給藥，至實驗結束)的小鼠腰髓組織石蠟切片的H&E染色(D)及快藍染色(E)圖片。F為正常或免疫后對照組及ATA給藥組(20mg/kg，第3天給藥，至實驗結束)的小鼠腰髓組織冰凍切片的CD45+細胞免疫熒光染色圖片，圖片中左下角的圖片為中央方框的放大圖像。G-1為對D-F中細胞浸潤總數、脫髓鞘面積及CD45+細胞浸潤數目進行的定量分析，數據以平均值土標準誤差表示。每組取3只小鼠，每只小鼠脊髓取10塊切片進行分析，與對照組比較，***P < 0.001 (史蒂頓特氏t檢驗(Student，st-test))。 [0023]圖3顯示ATA抑制體內但不影響體外T細胞分化。其中:
[0024]A:EAE免疫后第12天，對照組及ATA給藥組(20mg/kg/天，第3天給藥至第12天)小鼠脾臟中CD4+T細胞、CDllc+DC、Thl (IFNi )細胞和Thl7 (IL-17+)細胞比例的流式分析；B:EAE免疫后第12天，對照組及ATA給藥組(20mg/kg/天，第3天給藥至第12天)小鼠的脾細胞用M0G35_55重刺激48小時后收集上清，用ELISA檢測IL_17a、IFN- y、IL-6和TNF- α的含量；數據表示為平均值土標準誤差(每組為6只小鼠)，與對照組比較，*ρ < 0.05，**ρ
<0.01, ***ρ < 0.001 (史蒂頓特氏t檢驗)；C和D:在分化因子及各種濃度ATA存在下，來源于6-8周齡小鼠脾內幼稚型⑶4+T細胞在體內向Thl (C)或Thl7 (D)分化的狀況，數據來自三次獨立實驗，表示為平均值土標準偏誤差；E:向分離自8-10周齡小鼠脾內的DC加入不同濃度的ATA或喜樹堿(0-30 μ Μ),培養18小時，annexin V/碘化丙啶(PI)染色，流式分析其凋亡情況。數據來自三次獨立實驗，每次實驗三復孔，表示為平均值土標準誤差。
[0025]圖4顯示ATA抑制趨化因子介導的DC的遷移，但不影響DC的其他功能。其中:
[0026]A:將分離自EAE免疫后第12天的小鼠脾內的DC加入到Tmnsweir穿膜小室夾層培養體系的上層小室內，上下層小室以帶微孔的膜隔開；將30nM CCL19加入到下層小室內JflOyM ATA加入到上層及下層小室。3小時后，從上層小室遷移到下層小室的細胞通過流式細胞儀計數。數據來自三次獨立實驗，每次實驗三復孔，表示為平均值土標準誤差。與CCL19未處理組比較，###p〈0.001 ;與ATA未處理組比較，***ρ < 0.001 (史蒂頓特氏t檢驗)。
[0027]B和C:將分離自EAE免疫后第12天的未經ATA治療的小鼠脾臟的⑶4+T細胞用CFSE標記，在M0G35_55 (25 μ g/ml)存在或不存在的條件下，與分離自EAE免疫后第12天的對照組或ATA給藥組(20mg/kg/天,第3天給藥至第12天)的⑶IIc+DC共培養72小時,用流式檢測⑶4+T細胞的增殖(B)或用ELISA方法檢測上清中IL-17a、IFN- y、IL_6和TNF- α等細胞因子的含量(C)。
[0028]D-H:⑶4+Τ細胞和⑶IIc+DC均分離自EAE免疫后第12天的未經ATA治療的小鼠脾臟，CD4+T細胞用CFSE標記后，在M0G35_55 ( 25 μ g/ml)及ATA (10 μ Μ)存在或不存在條件下，共培養72小室，用流式測⑶4+Τ細胞的增殖(D)或ELISA測上清中IL_17a，IFN- Y、IL-6和TNF-α等細胞因子的 含量(E_H)。數據來自三次獨立實驗，表示為平均值土標準誤差。
[0029]圖5顯示ATA阻斷致炎性T細胞向中樞神經系統浸潤。其中:
[0030]A:用37-70%硅石膠態懸浮液(Percoil? )分離出EAE免疫后第18天小鼠(ATA20mg/kg/天,第3天給藥至第18天)的中樞神經系統浸潤細胞,并用流式儀分析CD4+T細胞、Thl (IFN-.Y)細胞和Thl7 (IL-17+)細胞的數目。數據表示為平均值土標準誤差(每組為5只小鼠)，與對照組比較，**p < 0.05 (史蒂頓特氏t檢驗)。
[0031]B:EAE免疫后第18天(ATA20mg/kg/天,第3天給藥至第18天),對照組和ATA給藥組小鼠血液中CD4+T細胞、CDllc+DC、Thl (IFN-.Y )細胞和Thl7 (IL-17+)細胞的比例流式分析結果。數據表示為平均值土標準誤差(每組為6只小鼠)，與對照組比較廣P < 0.05(史蒂頓特氏t檢驗)。
[0032]C:正常組或免疫后第18天對照組及ATA給藥組(20mg/kg/天，第3天給藥至第18天)小鼠腦部脈絡叢CD45+細胞免疫熒光染色圖片。
[0033]D:對C圖中⑶45+細胞浸潤數目進行的定量分析，數據以平均值土標準誤差表示。每組取3只小鼠，每只小鼠取5塊切片進行分析，與對照組比較，#P < 0.01 (史蒂頓特氏t檢驗)。
【具體實施方式】
[0034]在下文中，將參照附圖，結合舉例說明本發明的實施例來更加詳細地描述本發明，但其不以任何形式限制本發明。
[0035]實施例[0036]材料與方法
[0037]實驗動物:
[0038]C57BL/6雌鼠購自上海實驗動物中心(上海，中國)并飼養于上海藥物研究所實驗動物室SPF級實驗室，維持光-暗12小時循環交替，給以充足的食料和潔凈飲水，至8周齡開始實驗。所有實驗均獲得批準，并按照上海藥物研究所動物管理與使用委員會的指引進行。
[0039]試劑:
[0040]CCR2, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR6, SlPl， DOR, K0R,
β 2AR和G α 16質粒均購自Missouri S&T cDNA資源中心。金精三羧酸(ATA)，脂多糖，Hochest33342,福斯高林(forskolin)，GLP-1, U50488和異丙腎上腺素均購自Sigma-Aldrich0抗小鼠CD3 (145-2C11)單克隆抗體，抗小鼠CD28 (37.51)單克隆抗體和抗小鼠IFN-y (R4-6A2)單克隆抗體均購自BD Pharmingen0藻紅蛋白-藍色素7(Phycoerythrin-cyanine 7, PE_Cy7)抗小鼠 CD4 (RM4-5),別藻藍素(Allophycocyanin,APC)抗小鼠 CD8a (53-6.7)，別藻藍素(Allophycocyanin，APC)抗小鼠 IFN-y (XMG1.2)，藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)抗小鼠 CDllc (N418)和抗小鼠 CD45 (30-F11)購自eBiosciences。抗 myc 和抗 HA 單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology。AlexaFluor 488羊抗小鼠IgG抗體，Alexa Fluor 488羊抗大鼠IgG抗體和Fluo_4AM購自Invitrogen0 重組 MCP-1, TARC, RANTES, MIP-3 α，ΜΙΡ-3 β，TECK, SDF-1, CXCL13 和 CXCL16購自P印roTech。重組鼠IL-12，重組鼠IL-6，重組人TGF-β 1，重組鼠IL-1 β，重組鼠IL-23和重組鼠TNF-α購自R&D Systems。
[0041]細胞系:
[0042]實驗涉及的各種穩定表達受體和Ga 16的細胞系均由實驗室內部構建。具體步驟如下:HEK293或CHO細胞經胰酶消化后，離心，加入200 μ I電轉液(ATP 200g/L, MgCl2 *6H20120g/L, KH2PO4 12g/L, NaHCO3 1.2g/L)，以 100-200 萬細胞 /200 μ I 電轉液的濃度加入受體質粒和Ga 16質粒各2μ g，混勻，用Scientz-2C基因導入儀(寧波新芝生物科技有限公司)進行電擊。電擊后的細胞轉入培養板或培養皿中繼續培養細胞，24小時后即可以用于鈣流實驗進行檢測。培養皿中的細胞24小時后加入抗生素進行篩選，并挑選陽性克隆細胞，建立單克隆細胞系。
[0043]實施例1:EAE誘導及小鼠給藥
[0044]雌性C57BL/6 小鼠皮下注射 200 μ gMOG35_55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,購自吉爾生化)輔以完全弗氏佐劑及5mg/ml熱滅活結核桿菌(H37Ra菌株,購自DifcoLaboratories)。免疫當天為第O天。第O天及第2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200ng (Calbiochem)。每天為小鼠評分，評分按“5分制”標準如下:0分，無臨床癥狀；1分，尾部癱瘓；2分，后肢輕度癱瘓(單側或雙側后肢無力，不完全癱瘓);3分,截癱(雙側后肢完全癱瘓);4分,截癱并前肢無力或癱瘓；5分，瀕死狀態或死亡。
[0045]小鼠給藥:
[0046]EAE給藥組: 從免疫后第3天或第12天起經腹腔注射給予ATA( 10-20mg/kg)，直至實驗結束；或從免疫后第3天起給藥(經腹腔注射給予ATA(10-20mg/kg))至第12天。溶解ATA的溶劑為含有0.4%二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMS0)的磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline, PBS)。
[0047]EAE對照組:從免疫后第3天或第12天起經腹腔注射給予溶劑對照，即含有0.4%二甲亞砜的磷酸鹽緩沖液。
[0048]實施例2:組織病理與免疫熒光分析
[0049]將實施例1中EAE給藥組和EAE對照組的疾病小鼠麻醉，經PBS灌流及4%多聚甲醛灌流固定。取出的脊髓組織樣品在4%多聚甲醛中固定過夜。固定的脊髓組織樣品經石臘包埋后，用蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin, H&E)染色分析炎癥細胞浸潤,用快藍染色分析脊髓脫髓鞘現象。脊髓和腦的冰凍切片用抗小鼠CD45—抗及相應熒光二抗染色；細胞核用Hochest 33342室溫染色10分鐘，切片用熒光封片劑(Dako)封片。
[0050]實施例3:中樞神經系統浸潤細胞分離
[0051 ] 將實施例1中EAE給藥組和EAE對照組的疾病小鼠的脊髓及腦組織放在40 μ m濾網上碾碎，獲得的細胞懸液在4°C，500g離心10分鐘后，用8ml 37% PercoI'丨H式劑重懸，小心加入到4ml 70%percolf試劑中，在25°C 780g條件下離心25分鐘。收集位于37%~70%percoll?中間層細胞并進行流式檢測。
[0052]實施例4:流式細胞檢測
[0053]將取自實施例1中EAE給藥組和EAE對照組的疾病小鼠的脾細胞或取自實施例3中的浸潤到小鼠中樞神經系統的細胞進行表面染色。細胞與熒光標記的抗小鼠CD4，CDllc抗體，4°C孵育30分鐘。對于胞內染色，細胞先與12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽(phorbol12-myristate 13-acetate) (50ng/ml; Sigma)、伊屋諾霉素(ionomycin) (750ng/ml; Sigma)和布雷菲德菌素A(brefeldin A) (3.0 μ g/ml; Sigma)混合后在37°C孵育5小時，細胞重懸于固定/通透液(Cytofix/Cytoperm 試劑盒;BD Pharmingen)中，胞內 1L_17a 和 IFN-gamma染色按產品說明操作。結果用Guava easyCyte? 8HT流式細胞儀和GuavaSoft軟件進行分析。
[0054]實施例5:CD4+T細胞分離和體外分化
[0055]用磁珠(:Dynal?MouseCD4 Cell Negative Isolation kit; Invitrogen)分離6-8周齡正常雌性C57BL/6小鼠脾中幼稚型⑶4+T細胞，分離后的⑶4+T細胞加入抗⑶3 (2 μ g/ml; 145-2C11 ;BD Pharmingen)和抗 CD28 (2 μ g/ml; 37.51; BD Pharmingen)抗體激活后分另Ij 加入 IL-12 (10ng/ml; R&D)和抗-1L-4 (10 μ g/ml; IlBll;BD Pharmingen)誘導分化為Thl 細胞，或加入抗-1L-4、抗-1FN-gamma (10 μ g/ml; BD Pharmingen)及含 TGF-β 1(3ng/ml)、IL-6 (30ng/ml; eBioscience)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor) (lOng/ml; R&D) >IL-23 (lOng/ml; R&D)和 IL-1 β (lOng/ml; R&D) ^ Th-17 “分化因子組合”來誘導分化為Th-17細胞。在上述分化過程中，同時加入各種濃度(0-30 μ Μ)的ATA以評估其對T細胞分化的影響。三天后收集細胞進行胞內IFN-Y、IL-17a的染色。
[0056]實施例6:DC分離及DC-T細胞共培養實驗
[0057]用MACS磁珠(Miltenyi Biotec)分選來源于實施例1中EAE對照組小鼠(免疫后第12天)或EAE給藥組小鼠(ATA, 20mg/kg/天,第3天給藥至第12天)脾臟中的⑶IIc+DC細胞后，與CFSE標記的來源于EAE對照組小鼠(免疫后第12天)脾臟中的⑶4+T細胞以3:1的比例混合，在M0G35_55 ( 25 μ g/ml)存在或不存在的條件下，培養72小時；或⑶4+T細胞和DC細胞均分離自EAE對照組小鼠(免疫后第12天)，在共培養體系中加入ATA (10 μ Μ),培養72小時后，流式細胞儀檢測CD4+T細胞的增殖情況，ELISA方法檢測上清液中細胞因子IFN- Y，IL-17a, IL-6 和 TNF- α 的含量(Dakewe, Shenzhen, China)。
[0058]實施例7:DC凋亡實驗
[0059]將分選自8-10周齡正常C57BL/6小鼠脾臟中的CDl Ic+DC與ΑΤΑ (0_30μΜ)或喜樹堿(0-30 μ Μ)在37°C孵育18小時。收集細胞進行Annexin V/碘化丙啶染色。早期凋亡表現為Annexin V陽性,碘化丙唳陰性,晚期凋亡表現為Annexin V和碘化丙唳雙陽性，用流式細胞儀檢測。
[0060]實施例8:趨化實驗
[0061]體外趨化實驗米用5 μ m孔徑芽I旲小室(Transwel!K ,Corning)。從實施例1中的EAE對照組小鼠(免疫后第12天)中提取全脾細胞或DC細胞，并且將該細胞用含10 μ g/ml LPS的RPM1-1640培養液培養48小時，細胞洗后用含0.5%BSA的RPM1-1640培養液稀釋成密度為IX IO7細胞/ml懸液。將各種趨化因子受體的相應配體(SDF-1、CCL19、CCL20或SlP(均為30nM))加入到下層小室內而將100 μ I細胞懸液加入到上層小室內。對于趨化阻滯實驗，各種濃度的ATA (0-100 μ Μ)被加入到下層小室及上層小室內。正常培養3小時后從上層小室遷移至下層小室內的脾細胞用流式細胞儀計數。
[0062]實施例9:鈣流實驗
[0063]將穩定表達各種G蛋白偶聯受體(包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CXCR4，CXCR5和CXCR6)和G α 16的ΗΕΚ293細胞株(如上所述由實驗室自行構建)接種在96孔板里，培養24小時后，將細胞與2μ M fluo 4411染料在371:孵育45分鐘，移去染料，加入5(^1^含不同濃度ATA (0-100 μ M`)或者1%DMS0 (陰性對照)的HBSS，室溫孵育lOmin，然后再用相應配體(SDF-1、CCL19、CCL20，S1P等(均為30nM))作為激動劑進行刺激，記錄鈣信號。用Flex Station 3微孔板檢測儀(Molecular Devices)讀數。檢測儀在指定時間點,可自動將25 μ I激動劑(終濃度30ηΜ)加入到反應體系中，同時用485nm的光激發并于525nm波段檢測細胞內鈣離子濃度變化引起的染料熒光強度的變化。
[0064]實施例10:受體內吞實驗
[0065]將穩定表達Myc-CXCR4、EGFP-CCR6或HA-SlPl的HEK293細胞株(如上所述由實驗室自行構建)接種在蓋玻片上，培養過夜。細胞先用ATA (0-30 μ M)預孵育10分鐘，后用相應的配體(SDF-1、CCL20或SlP)30nM刺激30分鐘。然后，將細胞用4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100破膜后，用抗myc或HA標簽的抗體4°C孵育過夜，相應的Alexa Fluor488 二抗室溫孵育I小時，Hochest33342染核后，用熒光共聚焦顯微鏡(Olympus FVlOiconfocal microscope)拍照。
[0066]數據處理
[0067]數據用GraphPad Prism軟件分析處理。非線性回歸分析產生劑量依賴曲線并計算半數抑制濃度(IC5(I)。數據表示為平均值土標準誤差，EAE小鼠處理組間統計學差異用雙方向方差檢驗(two-way ANOVA test)分析,時間點內EAE評分統計學差異用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitneytest)分析。其他數據分析(如基因表達，細胞因子生成后病理學統計分析)用史蒂頓特氏t檢驗分析。p〈0.05為有統計學意義。
[0068]結果
[0069]ATA抑制多種趨化因子受體的功能[0070]趨化因子受體是一類G蛋白偶聯受體(GPCR)，它們對細胞的遷移有非常重要的作用，對EAE的發病機制也有一定的貢獻。在篩選趨化因子受體拮抗劑時，發明人發現ATA(圖1A)能抑制多種趨化因子導致的細胞信號轉導和遷移。首先，實施例9中，發明人利用穩定表達Ga 16和各類GPCR (其中趨化因子受體包括:CCR2，CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9,CXCR4, CXCR5或CXCR6 ;非趨化因子受體包括:S1P1，DOR, KOR, GLP-1R和β 2AR)的細胞系檢測了 ATA對GPCR介導的鈣流反應的抑制作用。Ga 16是一類泛宿主性的G蛋白，常與G蛋白偶聯受體偶聯，啟動下游鈣信號通路。實施例9的結果顯示，ATA劑量依賴性地抑制大多數趨化因子受體介導的鈣流反應，僅CCR2除外(圖1Β，下表1)。但是對于其他非趨化因子受體，ATA則沒有顯示出抑制效應(圖1Β，下表1)。
[0071]實施例8中，發明人隨后檢測了 ATA對幾個不同趨化因子受配體對如CCL19/CCR7，CCL20/CCR6或SDF-1/CXCR4介導的脾細胞遷移活性的影響。實施例8的結果顯示，ATA劑量依賴性的抑制CCL19，CCL20或SDF-1所誘導的脾細胞的遷移，其IC50分別為0.24，3.36，
11.46μΜ(圖1C，下表1);S1P1受體在淋巴細胞遷出次級淋巴器官過程中發揮了重要作用，但ATA并不影響SlPl介導的細胞趨化(圖1C，下表1)。
[0072]受體內吞是GPCR被其配體刺激后的一種常見現象。實施例10中，發明人也檢測了ATA對配體刺激后的CXCR4，CCR6和SlPl受體內吞效應的影響。表達CXCR4，CCR6或SlPl受體的細胞與ATA預孵育10分鐘后，再用相應的配體SDF-1，CCL20或SlP刺激30分鐘，然后進行受體免疫熒光染色。實施例10的結果顯示，未經配體刺激地細胞，受體都定位在細胞膜上,配體刺激后，受體內吞至胞內(圖1D);加入ATA處理后，配體刺激導致的CXCR4和CCR6受體內吞顯著減少HMATA不影響SlPl受體的內吞(圖1D)。綜上所述，ATA抑制許多趨化因子受體的功能，但不影響其他的GPCR的功能。
[0073]ATA減輕EAE的臨床癥狀及病理學特征
[0074]實施例1中，用M 0G35_55免疫8-9周的雌性C57BL/6小鼠誘導EAE，從第3天或第12天起開始腹腔注射ATA (10或20mg/kg)至實驗結束,或者在第3天到第12天給藥。溶劑對照為含0.4%DMS0的PBS。EAE的臨床評分數據見圖2A-2C和下表2。ATA劑量依賴性地緩解EAE的臨床評分(圖2A)，并顯著降低疾病的最高臨床評分和累計臨床評分(圖2A，下表2)。當僅第3天到第12天給藥時，ATA也能夠在EAE疾病發生的起始和高峰階段降低其嚴重程度，但在20天后疾病的分數又有上升的趨勢，表明藥物的移除導致了疾病的再次發生(圖2B)。在疾病開始之后(第12天起)給藥，20mg/kg ATA仍能有效減輕EAE的嚴重程度(圖2C，表2)，表明該藥物不僅有預防效果，也能達到治療疾病的目的。
[0075]實施例2中，發明人分析了免疫21天后脊髓的病理切片。實施例2的研究結果顯示，相較于對照組，ATA給藥可明顯減少白細胞對脊髓的浸潤(圖2D和2G);快藍染色顯示對照組的EAE小鼠脊髓白質出現廣泛的脫髓鞘現象，而給予ATA后，脫髓鞘現象明顯減少(圖2E和2H);冰凍切片免疫熒光染色的結果顯示，ATA給藥后能明顯減少EAE小鼠脊髓中CD45+細胞的數量(圖2F和21)。
[0076]ATA減少疾病起始階段脾臟內DC和效應T細胞的比例
[0077]CD4+T細胞的活化，增殖和分化是EAE疾病發生的前提。實施例4中，發明人利用流式分析檢測了 EAE免疫后第12天，小鼠脾臟內各細胞亞群的比例。與對照組相比，ATA給藥組小鼠的⑶IIc+DC和EAE中兩種主要效應T細胞Thl和Thl7細胞的比例顯著下降(圖3A)。與此結果一致，給藥組小鼠脾細胞在體外用MOG35_55重刺激，上清中的細胞因子(包括IFN- Y，IL17, IL6和TNF- α )也有顯著性減少(圖3Β)。
[0078]發明人隨后進一步驗證ATA是否是通過直接影響Thl或Thl7細胞的分化，而使脾臟中這兩種細胞比例減少的。實施例5中，用免疫磁珠從6-8周齡雌性C57BL/6小鼠脾細胞中分選出幼稚型CD4+T細胞，用抗-CD3和抗-CD28抗體激活后加入不同分化因子及各種濃度的ATA，將細胞誘導分化為Thl或Thl7細胞。三天后收集細胞進行胞內IFN-Y、IL_17a的染色。流式分析后發現ATA并不直接影響Thl (圖3C)或Thl7(圖3D)的體外分化。體內Thl或Thl7的分化很大程度上受到DC的影響，既然ATA不直接影響Thl或Thl7的分化，那么這些細胞在體內的減少很可能是因為⑶Ilc+DC的減少所引起(圖3A)。實施例7中，發明人檢測了 ATA是否會促進DC的凋亡，從而使脾臟中DC的含量減少。圖3E顯示，I型拓撲異構酶抑制劑喜樹堿劑量依賴性的促進DC的凋亡，但ATA卻沒有這種效應，說明ATA對DC的凋亡沒有促進作用。
[0079]ATA抑制DC的遷移，但不影響其其他功能
[0080]DC在外周組織中捕獲、加工并向MHC分子遞呈抗原。DC隨后向次級淋巴器官中遷移，并在這些器官中，向幼稚型T細胞遞呈抗原，促使它們向Thl或Thl7分化，從而啟動抗原特異性免疫反應。因為ATA不會促進DC的凋亡，那么它很有可能是抑制了 DC向脾臟的遷移。實施例8中，發明人用趨化實驗研究ATA對于DC遷移的作用。CCR7是成熟DC上高表達的介導DC遷移的主要的趨化因子受體。結果顯示，ATA (10 μ M)能夠完全抑制CCR7的配體CCL19所誘導的EAE免疫后第12天小鼠脾臟中分離的獲得的DC的趨化效應(圖4Α)。
[0081]實施例6中，發明人為了進一步驗證ATA是否影響DC向⑶4+Τ細胞的抗原遞呈及其細胞因子的分泌，設計了 DC-⑶4+Τ細胞共培養實驗。⑶4+Τ細胞分離自對照組小鼠，用CFSE標記后，與分離自對照`組EAE或ATA給藥組EAE小鼠的⑶IIc+DC共培養72小時。來自ATA給藥組EAE小鼠的DC與來自對照組EAE小鼠的DC具有相同的刺激⑶4+Τ細胞增殖(圖4Β)及促進它們分泌細胞因子的能力(圖4C)。同時，發明人設計了另一個實驗，將均分離自對照組EAE小鼠的⑶4+Τ細胞和⑶IIc+DC共培養，并向培養體系中加入ATA (10 μ Μ)，72小時后分別用流式和ELISA檢測CD4+T細胞的增殖(圖4D)及它們細胞因子的分泌(圖4Ε-4Η)。結果顯示，⑶4+Τ細胞和⑶I Ic+DC共培養能顯著增強⑶4+Τ細胞的增殖及其細胞因子的產生。M0G35_55重刺激能進一步加強這種效應。但ATA并不影響該系統中⑶4+T細胞的增殖及它們細胞因子的分泌。綜上所述，ATA在EAE上展現出來的保護作用是通過抑制DC向脾臟內的遷移聚集，從而減少了 T細胞的活化和分化。
[0082]ATA阻斷致病性淋巴細胞向中樞神經系統的浸潤
[0083]ATA在疾病開始之后也表現除了一定的治療效果(圖2C)。所以發明人進一步驗證了 ATA是否會影響致病性T細胞向中樞神經系統浸潤的過程。利用流式分析技術對免疫后第18天CNS白細胞浸潤情況的進行檢測，ATA給藥后，CD4+T細胞和兩個主要致病細胞Thl和Thl7細胞的數目顯著性減少(圖5A)。然而，同時發現血液中Thl7細胞的比例，與對照組相比，ATA給藥組有顯著性上升(圖5B)。這個有趣的現象表明ATA可能抑制了致炎性T細胞向CNS中的浸潤，從而導致Thl7細胞在血液中的積累。脈絡叢形成了血腦屏障的一部分，T細胞穿過脈絡叢進入中樞神經系統是EAE病情起始的關鍵一步。有文獻報道，CCL20/CCR6介導的Thl7細胞向CNS的浸潤觸發了 EAE的開始。CCR6基因敲除小鼠的⑶45+細胞不能穿過血腦屏障，積聚在脈絡叢中。圖5C和顯示，與對照組相比，ATA給藥組EAE小鼠脈絡叢中有更多的CD45+細胞的聚集，這些都說明了 ATA同時還會抑制致病性T細胞向CNS的浸潤，從而緩解EAE的病情。
[0084]討論
[0085]趨化因子是一類與白細胞遷移和炎癥反應相關的細胞因子，根據它們的結構性質可被分為兩個大的家族(CXC和CC)和兩個小的家族(C和CX3C)。趨化因子受體下游信號通過異源三聚體G蛋白傳遞。G蛋白能夠調節多種信號傳導通路，包括細胞內鈣離子，絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK), PLC β , ΡΙ3Κ, Ras 和 RhoGTPases等。這些轉導信號被認為負責細胞的運動及免疫細胞的運輸。
[0086]抗原進入外周組織后，未成熟DC在病原體或炎癥因子誘導下慢慢成熟。攜帶抗原的成熟DC遷出外周組織到達次級淋巴器官，并在此刺激T細胞的增殖和分化。DC成熟過程中，其表面表達的趨化因子受體類型會改變。決定攜帶抗原的成熟DC在T細胞富集區域積累的趨化因子受體CCR7的表達會逐漸上調。最近的研究也表明CXCR4和CCR7介導的信號協同調節DC向脾白髓遷移。抑制DC遷移的藥物已經用于治療自身免疫疾病。例如，環孢霉素A (Cycl0Sp0rinA，CSA)在臨床上是一種非常重要的有效的免疫抑制劑，用于治療器官移植，變應性紊亂，自身免疫疾病和急性炎癥。CsA主要通過抑制DC在LPS刺激下產生PGE2，進而干預了趨化因子受體的表達，損傷DC的遷移能力。發明人的數據顯示，ATA非特異性地抑制趨化因子受體的功能，且它對于抑制CCL19/CCR7介導的DC趨化的活性也是最好的。這表明抑制DC向次級淋巴器官的歸巢也許是治療自身免疫疾病的一種有效方法。
[0087]淋巴細胞向CNS的浸潤是EAE這種神經退行性疾病發生的另外一個關鍵步驟，它也是由趨化因子受體所調節。白細胞從血液向血管外滲出是一個多步驟的過程。在這一級聯反應中的關鍵一步是循環中的白細胞表面表達的趨化因子受體與血管內皮細胞表面的趨化因子結合，啟動細胞內信號，導致整合素活化，白細胞阻滯及外滲。最近的證據表明表達IL-17的Thl7細胞是EAE中最重要的致炎性T細胞。Thl7細胞高表達趨化因子受體CCR6，并且其配體CCL20在 健康的及EAE小鼠的脈絡叢細胞上高表達。Reboldi等報道CCR6+Thl7細胞穿過脈絡叢上皮細胞進入CNS的過程對于EAE的起始是非常重要的。CCR6基因敲除后能阻滯Thl7細胞的浸潤，減輕EAE的病情。發明人也證明了 ATA抑制CCL20/CCR6介導的脾細胞的趨化，并減少致炎性T細胞向CNS的浸潤。
[0088]許多其他的趨化因子受體在EAE發病過程中的作用也有報道，而ATA作為一個多趨化因子受體的非特異性抑制劑正是其對EAE有治療效果的原因。值得注意的是ATA已經被報道可通過抑制⑶4與病毒包膜糖蛋白gpl20的結合來抑制HIV的進入。眾所周知，CCR5和CXCR4是HIV入侵的共受體。通過發明人的數據顯示，ATA也許還通過抑制CCR5和CXCR4來阻擋HIV進入⑶4+T細胞。
[0089]本發明公開了 ATA抑制趨化因子受體功能的活性，并公開了 ATA通過抑制CCL19/CCR7介導的DC向次級淋巴器官的歸巢及CCL20/CCR6介導的Thl7細胞進入CNS的過程，可以達到治療EAE的目的。
[0090]表1:ATA抑制趨化因子受體介導的鈣流反應及細胞遷移。其中:
[0091]通過鈣流和趨化實驗檢測ATA在多種趨化因子受體和其他GPCR上的抑制活性。數據來自三次獨立實驗，每次實驗三復孔，表示為平均值土標準誤差。[0092]【表1】
[0093]
【權利要求】
1.金精三羧酸或含有金精三羧酸的藥物組合物在制備靶向趨化因子受體的藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其中，所述靶向趨化因子受體的藥物為趨化因子受體抑制劑。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中，所述趨化因子受體包括CCR2，CCR4，CCR5，CCR6, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5, CXCR6。
4.根據權利要求3所述的用途，其中，所述趨化因子受體為選自CCR2，CCR4，CCR5，CCR6, CCR7, CCR9, CXCR4, CXCR5 和 CXCR6 中的一種或多種。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于，金精三羧酸同時靶向3個以上的所述趨化因子受體。
6.金精三羧酸或含有金精三羧酸的藥物組合物在制備用于預防和/或治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
7.如權利要求6所述的用途，其中所述自身免疫性疾病選自多發性硬化癥、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡和炎癥性腸病。
8.如權利要求1-7中任一項所述的用途，其中，所述含有金精三羧酸的藥物組合物包含治療有效量的金精三羧酸和任選的可藥用載體。
9.一種預防和/或治療自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要其的對象施用治療有效量的金精三羧酸或含有金精三羧酸的藥物組合物。
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述自身免疫性疾病選自多發性硬化癥、類風濕性關節炎、紅斑狼瘡和炎癥性腸病。
【文檔編號】A61P29/00GK103800309SQ201210461826
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月15日 優先權日:2012年11月15日
【發明者】謝欣, 張菲菲, 魏巍 申請人:中國科學院上海藥物研究所