。
[0086] 制劑
[0087] 取決于最佳的施用途徑，可W使用不同制劑(無菌制劑、緩沖制劑、緩慢釋放制劑、 控制釋放制劑、穩定劑、油膏等）。參見例如，Niazi S.K.化ndbook of Pharmaceutical Manufacturing F'ormulations Informa Healthcare 2012。與消炎劑相同，CX化 17/CXCR8 相互作用的激動劑或括抗劑可W與其它確定的藥物組合使用W優化治療結果。此外，所述 化合物可W與其它治療劑組合用于單一制劑策略中。可W使用藥理學變體來獲得所希望的 藥物動力學結果(分泌、半衰期、溶解性或優化排泄途徑）。
[0088] 確切劑量將取決于治療目的，并且可W由本領域技術人員使用已知技術確定。參 見例女日，Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;Lieberman α992)PharmaceuticalDosage化rms(第l-3卷），De化er，ISBN 0824770846,082476918X， 0824712692,0824716981;Lloyd(1999)The A;rt,Science and Technology of 曲armaceutical Compounding;and Picka;r(1999)Dosage Calculations。如本領域中所 知，可能需要針對蛋白質降解、全身遞送對比局部遞送及新蛋白酶合成的速率，W及年齡、 體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、藥物相互作用及病癥的嚴重程度作調整，并且 運可W由本領域技術人員通過一些實驗確定。
[0089] 本領域眾所周知各種藥學上可接受的賦形劑。如本文所使用，"藥學上可接受的賦 形劑"包括運樣一種材料，該材料當與組合物的活性成分組合時使該成分能獲得生物活性， 而且不會引起與受試者免疫系統的破壞性反應。此類材料可W包括穩定劑、防腐劑、鹽或糖 絡合物或結晶等。參見例如，Niazi S.K.化ndbook of 曲armaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012。
[0090] 示例性藥學載體包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。實例包括但不限于， 標準藥物賦形劑，如憐酸鹽緩沖生理鹽水溶液、水、乳液(如油/水乳液)及各種類型的潤濕 劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油（如橄攬油)及可注射有機醋（如油酸乙 醋）。水性載劑包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質。腸胃外媒劑包 括氯化鋼溶液、林格氏右旋糖、右旋糖及氯化鋼、乳酸林格氏溶液或非揮發性油。靜脈內媒 劑包括流體和養分補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏右旋糖的那些)等。在其它實施方 案中，所述組合物將并入固體基質中，該固體基質包括緩慢釋放顆粒、玻璃珠、細帶、眼上的 插入物及局部形式。施用途徑可W包括W下：局部、全身、呼吸道、口、眼、植入物、陰道、肛 口、栓劑、控制釋放裝置、舌下、頰、鼻、吸入、腸胃外、器官內、皮下、皮內、肌肉內、靜脈內等。 [0091 ]實施例
[0092]通過參照所附實施例可W更好地了解本發明，運些實施例只意圖用于說明目的， 并且不應在任何意義上解釋為限制本發明的范圍。盡管本發明的說明包括了一個或多個實 施方案W及某些變化形式和修改的說明，但在了解了本公開內容之后，其它變化形式和修 改也在本發明的范圍內，例如，可W在本領域的技術和知識范圍內。本文所引用的所有出版 物、專利、專利申請、Genbank編號及網站都通過全文引用并入本文中用于所有目的。
[OOW] 實施例1
[0094] 首先，鑒別對CX化17起反應的細胞。為此，使用基于化answell的趨化作用檢驗測 量多個細胞系對重組CX化17的反應。利用THP-1人細胞系觀察到由CX化17所誘導的最佳趨 化反應之一（圖1AKTHP-1細胞來源于急性單核細胞性白血病患者（18)并且被廣泛用于單 核細胞/巨隧細胞研究。
[0095] 由于已知CX化17募集單核細胞和樹突狀細胞(2)，故得出結論，THP-1細胞應當表 達CXCL17受體。重要的是，還發現THP-1細胞對CXCL17的反應在用前列腺素 E2(PGE2)處理后 增加（圖1A)。先前的報道觀察到THP-1在PGE2處理之后對其它趨化因子(例如，CX化14)具有 類似趨化反應(19)。另外，THP-1細胞的趨化反應對百日咳桿菌毒素(PTX)敏感(圖1A)。已知 PTX可抑制Gai/。蛋白質信號傳導路徑(20-21)。由于大多數趨化因子受體經由Gai/。蛋白引起 其反應，故運一觀察結果表明，CX化17受體使相同信號傳導路徑活化。
[0096] 趨化因子與其受體的結合使胞質巧特征性增加，運是在細胞中響應配體結合其同 源受體而發生的最早生物化學事件之一（21-22)。因此，提出假說：THP-1細胞應當展現 CX化17介導的Ca"流動。如圖IB中所示，在休眠細胞和PGE2處理的細胞中添加 CX化17之后觀 察到較強的化"流動。與趨化反應一致，PGE2處理的THP-1細胞也引起較強的化"流動信號 (圖 1B)。
[0097]若干調控步驟管理細胞對趨化因子的反應。運些調控過程的實例包括控制激動劑 和趨化因子受體合成或趨化因子降解(23)。另外，還存在一個快速機制，該機制設及受體失 活信號傳導路徑的活化，稱為去敏化。運一現象是由包括抑制蛋白和G蛋白偶合受體激酶在 內的反饋抑制劑級聯的活化引起(24)，并且可W被設計用于防止延長的活化作用的潛在損 害作用。因此，趨化因子受體在活化后去敏化一段時間。
[009引使用THP-1細胞測試CX化17驅動的去敏化。如圖1C中所示，CX化17使自身而非由 (XL2 (在THP-1細胞中誘導較強反應的另一趨化因子)誘導的化"流動去敏化(25)。相反地， CCL2不會使CXCL17介導的反應去敏化，表明運兩個趨化因子是經由不同受體進行信號傳導 ((：化2結合0：尺2)。
[0099] 先前的結果指示，CX化17通過由CX化17應答細胞表達的未鑒別的受體進行信號傳 導。如W上所提到的，CXCL17誘導單核細胞和樹突狀細胞的趨化作用（圖1A，（2))。因此，使 用了綜合人類基因表達微陣列數據庫，即'基因表達的身體指數（Body Index of Gene E邱ression，BIGE)'數據庫（26-27)來鑒別由單核細胞表達的GPCR。運一篩選得到接近90種 GPCR，其中10種注釋為嗅覺的，60種是已知的（經過注釋），并且20種是孤兒（內源配體未知 的GPCR)(圖8,表2)。為了研究其受體，首先測試CXCL17是否結合或活化其它已知的趨化因 子受體，包括已知由巨隧細胞表達的那些。結合和/或信號傳導研究證實，CX化17不與CCR2、 CCR5、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7 及 CCX-CKR 結合或進行信號傳導。此外，CX 化 14 或 CCL28 也 不結合GPR35(圖7)。因此，預期CX化17應當結合一種新的但尚未得到鑒別的趨化因子受體。 我們決定進行旨在鑒別CX化17雙體的實驗。
[0100] 研究集中在孤兒GPCR并且優先篩選與其它趨化因子受體顯示結構相似性而且表 達模式與CX化17類似的那些GPCR。運些標準縮窄了候選物清單。首先通過產生轉染子，在化 "流動檢驗中用CX化17測試來篩選CCRL2,運種GPCR展現與許多趨化因子受體相同的特征并 且在巨隧細胞和DC中表達(28)。與近期的報道一致(29)，未觀察到響應于CX化17的巧流動 (數據未顯示）。接下來的候選物是GPR35dGPR35最先被鑒別為A類孤兒GPCR基因（30)dGPR35 在若干粘膜組織中表達，包括胃腸道(31)，W及一些造血細胞，如單核細胞(32)、嗜堿細胞 和嗜曙紅細胞(33);并且還在成年肺中顯示相對較高的表達(34)。已發現，在用I巧抗體刺 激后的人肥大細胞（33)、用苯并[a]巧處理的人巨隧細胞（35)及胃癌細胞（31)中GPR35上 調。
[0101] 犬尿哇嘟酸(犬尿氨酸路徑的色氨酸代謝物）、2-酷基溶血憐脂酸(2-酷基-LPA)及 一些酪氨酸代謝物已經被鑒別為GPR35的激動劑(36-37);然而，是否存在替代性內源GPR35 激動劑仍有待商権。
[0102] BIGE數據庫中GPR35的表達掲露，前幾個表達GPR35的位置/細胞包括休眠單核細 胞(圖5,表1);如所預期的，休眠 DC也存在于此清單中并顯示相對較高的GPR35表達（圖5,表 1)。運些免疫細胞類型響應于CX化17而顯示趨化作用（（2)和未公布的數據）。在該清單上其 余組織中受體的表達在粘膜中較強并且與已知的CX化17表達模式相關(3)。
[0103] GPR35基因位于染色體2長臂上的2q37.3處（圖2A)。有趣的是，編碼CXCR7的基因位 于相鄰基因座中。運一觀察結果值得關注，因為系統發生序列分析指示，CXCR7與GPR35密切 相關（圖2B)。又，CX化17不結合CXCR7,因為其并不置換CXCR7表達性細胞中的i25I-CX化12。 隨后有關GPR35蛋白質序列的檢查掲露，在第二細胞內環處存在DRY盒（圖2C)。運一基序存 在于大多數已知的功能性趨化因子受體中的相應位置，是G蛋白與運些跨膜分子偶合的主 要位點（38)并且還與調控配體依賴性受體內化的β-抑制蛋白募集相關(39)。此外，還檢測 到在第二跨膜結構域處保守的Asp殘基和ΤχΡ(化r-Xaa-Pro)基序的存在。運些特征是趨化 因子受體中高度保守的結構決定子并且在受體活化中起到重要作用(40-41)"GPR35的運些 結構特征W及其組織表達模式有力地表明，GPCR35可W作為CX化17受體。
[0104] 使用定量實時PCR(qRT-PCR)證實，GPR35在休眠 THP-1單核細胞中表達并且在PGE2 刺激之后顯著上調（圖3A)。流式細胞術證實了 GPR35在THP-1細胞中的表達（圖3B)。我們試 圖證明，通過將運一受體轉染到不含GPR35的細胞系中可W在先前非反應性細胞中建立響 應于CX化17的巧流動。小鼠前體B細胞系Ba/F3不表達GPR35(42)，因此使用運些細胞進行轉 染實驗。當用重組人CX化17刺激人GRP35轉染的小鼠 Ba/F3細胞時，觀察到穩定的巧流動反 應（圖4A)。重要的是，在模擬轉染的對照細胞中未檢測到運一反應。另外，還注意到CX化17 劑量-反應模式，其中Ca"峰值增加對應于CXCL17濃度的增加（圖4B)。當將GPR35轉染到其它 細胞中時，獲得類似結果（圖6)。另外，對其它粘膜表達的趨化因子，如CX化14或(XL28是否 能誘導通過GRP35進行信號傳導進行測試，未得到成功（圖7)。總的說來，運些觀察結果表 明，GPR35是CX化17受體。
[01化]CX化17屬于C-X-C趨化因子亞家族并且運些配體通常結合C-X-C趨化因子受體 (43)。屯個GPCR成員構成了趨化因子受體的運一子類:CXCR巧ljCXCR7(l)。考慮到GPR35功能 性響應于CX化17的能力，提出對GPR35趨化因子(C-X-C基序)受體8(CXCR8)重新命名。
[0106] CXCR8鑒別為CX化17受體是趨化因子領域的一個重要貢獻，因為距離最后一次報 道趨化因子結合受體(CXCR7-結合CX化U和CX化12)已過去八年(44)。粘膜部位中CX化17/ CXCR8軸的生理學意義仍有待探索。然而，GPR35已經被鑒別為胃腸疾病的潛在地重要祀 (31)。重要的是，全基因組關聯研究（genome-wide association study，GWAS)鑒別出GPR35 錯義單核巧酸多態現象與原發性硬化性膽管炎及隨后發生的潰瘍性結腸炎密切關聯(5)。 總的說來，運些觀察結果有力地表明，CXCL17/CXCR8軸是呼吸系統和消化系統中的重要巨 隧細胞募集信號，并且還表明運一軸設及腸道炎性疾病的發病機理，而且觀察到在IPF(3) 中W及肺病變中CX化17明顯上調。鑒于炎癥在肺和胃腸病變中的重要性，預期CX化17/ CXCR8軸將在各種人類疾病中顯示重要作用。
[0…7] 實施例2: 陶]細胞與試劑
[0109] 將人THP-1急性單核細胞性白血病細胞（American Type Culture Collection, Rockville，MD)W及鼠類骨髓源性前體B細胞系Ba/F3(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)的不依索負 于IL-3的克隆保持在完全RPMI培養基（10%胎牛血清、lOOOU/mL青霉素、lOOOU/mL鏈霉素及 20mmol/L谷氨酷胺，分別來自Co;rning-Cellg;ro，Manassas，VA)中。所提供的用于不同實驗 的試劑包括：純化的兔IgG( Jackson ImmunoResearch, West Grove ,ΡΑ)和多克隆兔抗人 GPR35(Cayman Chemicals，Ann Arbor,MI)。人GPR35克隆可W從The Missouri S&T cDNA Resource Center (Ro 11a, MO)獲得，該克隆是被克隆到pcDNA3. 1 +表達載體化if e Technologies, Carlsbad, CA)中 EcoRI (5'）和趾 ol (3'）處的 G 蛋白偶合受體 35(GPR35)(野生 型）的cDNA。利用PCR由人基因組DM擴增開放閱讀框。插入序列大小= 930bp。基因庫登錄 號:AY275467。
[0110] BIGE 數據庫
[0111] BIGE數據庫的構建已經得到描述(3,27)。簡單地說，在死后5小時內獲得對應于人 體105個不同部位的組織或細胞。如所描述的那樣制備RNA并使用其來制備cDNAW與U133 2.0基因陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交。將所得數據標準化，并使用對應于GPR35 (210264_at)的探針集來確定人體中GPR35的表達。
[0112] 定量實時PCR分析
[0113] 用Roche Li曲tcycler 480,使用基于Universal Probe UbraiT的系統（此處需 要Roche注釋)生成定量實時PCR(qRT-PCR)數據。簡單地說，使用Qiagen的RNeasy RNA純化 試劑盒從THP-1細胞提取總RNA。使用等濃度的總RNA進行逆轉錄反應W產生cDNA(Qiagen， 化lencia，CA)。使用50ng的每種cDNA執行40個周期的PCR。每一反應使用基因特異性引物和 對應的化iversal Probe L化ra巧W定量檢測每一組織樣品中CX化17和對照基因轉錄物的 量。使用Gra地Pad Prism軟件（見World Wide Web的.gra地pad.com)處理并分析結果。
[0114] 趨化作用檢驗
[0115] 使用24孔化answell遷移板（Corning, NY)進行趨化作用檢驗，運些板含有上部插 入物和下部小室。將含有200ng/mL重組趨化因子(R&D Systems,Minneapolis，MN)的600μ1 趨化作用緩沖液（C緩沖液）（不完全RPMI，Mediatech,Manassas,VA)添加到hanswell板的 底部小室中。運些檢驗中使用的化answell板具有5.0皿大小的孔(Corning, Corning, NY)。 除非另作說明，否則使用0.5-1.OX ΙΟ6個細胞作為測試的所有細胞系的細胞輸入數量。在 將其添加到頂部插入檢驗板之前，在C緩沖液中洗涂細胞Ξ次。該檢驗在37°C和5%C02下解 育18到20小時。使用顯微鏡定期監測趨化作用。當觀察到趨化作用時，用200ng/mL百日咳毒 素(PTX)(Sigma，Saint Louis，M0)或ΙΟμΜ前列腺素 E2(PGE2)(Sigma)處理細胞24小時，隨后 開始趨化作用檢驗。
[01W 通過流式細胞術對趨化作用進行定量
[0117]運一方案改編自Prou壯oot等人(45)。簡單地說，在趨化作用檢驗結束時，從所述 板的底部小室收集受趨化的細胞，在FACS管中進行離屯、，并且再懸浮于2(Κ)化的lx PBS中。 可W通過在20化L的lx PBS中制備范圍從1.0 X 106到1.0 X 102個細胞的10倍細胞稀釋液來 產生標準品。標準品及所有受趨化細胞的細胞計數被記錄作為在30秒內計數的事件數量。 由于已知標準品的細胞的精確數量，故使用其細胞計數來生成標準曲線。使用由運一標準 曲線得到的趨勢線和等式來計算所分析的每一細胞系或原代細胞中受趨化的細胞的相對 數量。運些定量實驗中使用了FACShlibur機器(Becton Dickinson,Rranklin Lakes ,NJ)。 [011引 GPR35轉染檢驗
[0119]將Ba/F3細胞再懸浮于巧tomix緩沖液（120mM KCl，0.15mM CaCl2,25mM 皿PES/ ΚΟΗ,ρΗ 7.6,2mM EGTA，5mM MgCl2)中，最終密度是2X107個細胞/mL，將500化懸浮液轉移到 0.4cm電擊管化SA Scientif ic，0cala，FL)中。接著，將二十微克PCDNA3.1+/GPR35 DNA轉染 到細胞中。在該電擊管中，將質粒DNA添加到細胞懸浮液中并通過輕柔地抽吸進行混合。隨 后使用Bio-Rad化ercules，CA)脈沖系統使混合物暴露于電容是96化F的300V的單次電脈 沖。在37°C(5%C02氛圍）下將細胞回收于完全培養基中，保持48小時，隨后收集并進行化" 調動檢驗。
[0120] 巧調動檢驗
[0121] 為了在THP-1或轉染的Ba/F3細胞中進行巧研究，在37°C下，在無補充的RPMI 1640 中向5 X 107個細胞/mL負載最終染料濃度是10皿ol/L的calcium green-1-AM和fura-red- AM化ife Technologies,Carlsbad,CA)，保持30分鐘。在含有0.14g/L CaCb的漢氏平衡鹽 溶液化anks balanced salt solution,皿SSiCorning-Cellgro)中洗涂經過負載的細胞一 次，將其W1.5 X 106個細胞/mL再懸浮于皿SS中并立即放到冰上，避光保存。在活化之前，使 細胞升溫到37°C，保持15分鐘。在30秒的數據采集之后，通過添加不同量的人重組CX化17 (R&D Systems, Minneapolis，MN)來刺激細胞，在最后階段使用100μΜ離子霉素（Sigma, Saint Louis,MO)進行刺激，W確定所分析的每個細胞群的活力，運表示陽性對照物刺激 物。在添加活化劑之前和之后，借助于FACS化libur流式細胞儀(Becton Dickinson)測量個 別細胞中calcium green與fura red巧光比率，并借助于Flowjo FACS軟件（Tree Star Inc.)進行分析。數據是W任意單位表示的巧光度(相對細胞內巧)相對于時間的變化。 [01。] 實施例3:
[0123] 術語"表位"意指能夠特異性結合到抗體或結合結構域(如基于支架的蛋白質或受 體蛋白質的一個或多個環)的蛋白質決定子。
[0124] 運些表位通常由分子的