免疫細胞及其它細胞的測定的制作方法
【專利說明】免疫細胞及其它細胞的測定
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2013年8月26 日提交的標題為 "Determination of Immune Cells and Other Cells"的美國臨時專利申請系列號61/870,214(通過引用并入本文）的權益。
[000；3]領域
[0004] 本發明總體上設及流體微滴，W及用于篩選或分選運樣的流體微滴的技術。在一 些實施方案中，所述流體微滴可含有細胞諸如免疫細胞，可分析所述細胞W測定細胞的受 體序列或其它有用的性質。
[0005] 背景
[0006] -些細胞表型是克隆性的，運意味著單個祖細胞能產生許多相同的子細胞，每一 個子細胞具有相同的表型。通常地，克隆性的表型由特定的基因型控制。例如，T細胞在其細 胞膜上呈遞T細胞受體(TCR)分子。每一個T細胞克隆編碼單一序列的T細胞受體(TCR)分子。 如果T細胞表達結合于由感染的細胞或癌性細胞呈遞的膚的TCR，則可給T細胞傳遞信號W 快速分裂。原始T細胞的此"克隆擴增"導致大量表型相同的細胞產生，每一個細胞編碼相同 的TCR。在免疫應答期間，運些克隆衍生的T細胞可被活化W殺死呈遞感染或癌癥衍生的膚 的細胞。W此方式，免疫系統可產生針對感染或癌癥的祀向應答。
[0007] 由于TCR的序列對于其識別其細胞祀的能力是重要的，因此擁有鑒定由T細胞呈遞 的TCR的序列的有效方法在醫學和科學上是有用的，所述T細胞具有識別并殺死呈遞從感染 的細胞或癌性細胞衍生的膚的細胞的能力。然而，迄今為止，還沒有鑒定具有所需識別和殺 死活性的個體T細胞的高通量測定；因此難W鑒定介導祀細胞的識別的TCR。
[000引抗體分泌細胞(ASC)諸如B細胞和漿細胞也是克隆性的，因為單個細胞編碼和分泌 單一種類的抗體。由對應的細胞DNA定義的抗體的蛋白質序列決定抗體的結合特異性。迄今 為止，還沒有鑒定分泌具有所需祀特異性和功能活性的抗體的個體細胞的高通量測定。因 此，難W鑒定編碼運些目標抗體的DNA序列。
[0009] 概述
[0010] 本發明總體上設及流體微滴，W及用于篩選或分選運樣的流體微滴的技術。在一 些實施方案中，所述流體微滴可含有細胞諸如免疫細胞，可分析所述細胞W測定所述細胞 的受體序列或其它有用的性質。本發明的主題在一些情況下設及相關產品，針對特定問題 的備選解決方案，和/或一個或多個系統和/或物品的多個不同用途。
[0011] 在一個方面，本發明總體上設及測定免疫細胞受體的方法。根據第一組實施方案， 所述方法包括將免疫細胞和祀細胞封裝在微流體通道內包含的微流體微滴中，W使得至少 一些微流體微滴含有至少一個免疫細胞和至少一個祀細胞;測定祀細胞暴露于免疫細胞后 所述祀細胞的生存力；基于祀細胞的生存力分離微流體微滴;和對于含有至少一個免疫細 胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微滴，測定所述至少一個免疫細胞的受體序列。
[0012] 在另一組實施方案中，所述方法包括測定多個微流體微滴內包含的祀細胞的生存 力，所述微流體微滴的至少一些含有至少一個免疫細胞和至少一個祀細胞;基于祀細胞的 生存力分離微流體微滴;和對于含有至少一個免疫細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流 體微滴，測定所述至少一個免疫細胞的受體序列。
[0013] 在另一組實施方案中，所述方法包括W下行為:測定多個微流體微滴內包含的祀 細胞的生存力，所述微流體微滴的至少一些含有至少一個效應細胞和至少一個祀細胞，其 中所述效應細胞與祀細胞相互作用，W在祀細胞中產生可測定的變化;基于祀細胞的生存 力分離微流體微滴;和對于含有至少一個效應細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微 滴，測定所述至少一個效應細胞的受體序列。
[0014] 根據另一組實施方案，所述方法包括W下行為:將效應細胞和祀細胞封裝在微流 體通道內包含的微流體微滴中，W使得至少一些微流體微滴含有至少一個效應細胞和至少 一個祀細胞，其中所述效應細胞與祀細胞相互作用，W在祀細胞中產生可測定的變化;測定 祀細胞暴露于效應細胞后祀細胞的生存力;基于祀細胞的生存力分離微流體微滴;和對于 含有至少一個效應細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微滴，測定所述至少一個效應 細胞的受體序列。
[0015] 在另一個方面，本發明總體上設及測定細胞蛋白質的方法。在一組實施方案中，所 述方法包括W下行為:測定多個微流體微滴內包含的祀細胞的生存力，所述微流體微滴的 至少一些含有至少一個效應細胞和至少一個祀細胞，其中所述效應細胞與祀細胞相互作 用，W在祀細胞中產生可測定的變化;基于祀細胞的生存力分離微流體微滴;和對于含有至 少一個效應細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微滴，測定來自至少一個效應細胞的 至少一個編碼蛋白質的基因的序列。
[0016] 根據另一組實施方案，所述方法包括W下行為:將效應細胞和祀細胞封裝在微流 體通道內包含的微流體微滴中，W使得至少一些微流體微滴含有至少一個效應細胞和至少 一個祀細胞，其中所述效應細胞與祀細胞相互作用，W在祀細胞中產生可測定的變化;測定 祀細胞暴露于效應細胞后祀細胞的生存力;基于祀細胞的生存力分離微流體微滴;和對于 含有至少一個效應細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微滴，測定來自至少一個效應 細胞的至少一個編碼蛋白質的基因的序列。
[0017] 在另一個方面，本發明總體上設及運樣的方法，所述方法包括將免疫細胞和祀細 胞封裝在微流體通道內包含的微流體微滴中，W使得至少一些微流體微滴含有至少一個免 疫細胞和至少一個祀細胞;測定祀細胞暴露于免疫細胞后祀細胞的生存力;基于祀細胞的 生存力分離微流體微滴;和培養來自至少一些含有至少一個免疫細胞和至少一個無生存力 祀細胞的微流體微滴的細胞。
[0018] 在另一個方面中，所述方法包括W下行為:測定多個微流體微滴內包含的祀細胞 的生存力，所述微流體微滴的至少一些含有至少一個免疫細胞和至少一個祀細胞;基于祀 細胞的生存力分離微流體微滴;和培養來自至少一些含有至少一個免疫細胞和至少一個無 生存力祀細胞的微流體微滴的細胞。
[0019] 在另一個方面，所述微滴可含有抗體分泌細胞、病毒顆粒、和可被病毒感染的祀細 胞。微滴內測定可用于鑒定分泌中和病毒（即預防或減少祀細胞的病毒感染）的抗體的細 胞。
[0020] 在另一個方面，本發明總體上設及運樣的方法，所述方法包括將效應細胞和祀細 胞封裝在微流體通道內包含的微流體微滴中，W使得至少一些微流體微滴含有至少一個效 應細胞和至少一個祀細胞，其中所述效應細胞與祀細胞相互作用，W在祀細胞中產生可測 定的變化;測定祀細胞暴露于效應細胞后物質從效應細胞的分泌，基于所述物質分離微流 體微滴，和對于含有至少一個效應細胞和至少一個無生存力祀細胞的微流體微滴，測定所 述至少一個效應細胞的受體序列。
[0021] 在某些情況下，所述微滴可被用于分離分泌抗微生物化合物、膚或蛋白質的細胞。 在一些實施方案中，可W例如使用微滴內測定分析所述微滴，W測定由細胞分泌的物質。例 如，微滴可能含有具有合成抗微生物劑(例如，青霉素）的潛能的個體酵母細胞，W及為已知 的人病原體的微生物細胞。微滴內測定可用于鑒定分泌殺死致病微生物或抑制致病微生物 的生長的化合物、膚或蛋白質的酵母細胞。在其它實施方案中，在封裝之前，可將酵母遺傳 編程來分泌膚或蛋白質的文庫，并且微滴內篩選法可被用于分離分泌抗微生物劑的酵母。 隨后可將標準分子生物學方法用于鑒定編碼抗微生物化合物的DNA序列。
[0022] 在相關實例中，液滴內測定可用于鑒定分泌不由DNA直接編碼的抗微生物化合物 (即非蛋白質或非RNA化合物)的細胞。運會允許獲得由酵母或其它生物體合成的化學試劑。 例如，會分離具有抗微生物性質的酵母，使其生長W產生所分離的細胞的許多克隆拷貝，然 后將細胞破碎，并分析內容物。通過將具有抗微生物性質的酵母的內容物與不具有抗微生 物性質的酵母的內容物相比較，可鑒定抗微生物化合物和/或相應的合成途徑。
[0023] 當與附圖結合考慮時，根據本發明的各種非限定性實施方案的W下詳細描述，本 發明的其它有利方面和新特征將變得顯而易見。在其中本說明書和通過引用并入的文獻包 括矛盾和/或不一致的公開內容時，W本說明書為準。如果通過引用并入的兩個或多個文獻 包括矛盾和/或不一致的公開內容時，則W具有較晚的生效日期的文獻為準。
[0024] 附圖概述
[0025] 本發明的非限制性實施方案將通過舉例的方式參考附圖來進行描述，所述附圖是 示意性的，并且并非旨在按比例繪制。在圖中，所示的每一個相同或幾乎相同的組件通常由 單一數字表示。為了清楚起見，并非每一個組件均標記在每一個圖中，并且當圖解對于使本 領域普通技術人員理解本發明不是必需的時，并非本發明的每一個實施方案的每一個組件 均顯示在每一個圖中。在附圖中：
[0026] 圖1是舉例說明在本發明的一個實施方案中測定T細胞受體的方法的示意圖；
[0027] 圖2舉例說明根據本發明的另一個實施方案的含有祀細胞和效應細胞的微滴；
[0028] 圖3是本發明的另一個實施方案中的包含在微滴中的效應細胞和祀細胞的顯微照 片；
[0029] 圖4A-4D是舉例說明在本發明的另一個實施方案中效應細胞對祀細胞的殺死的時 間序列顯微照片；
[0030] 圖5A-5C是舉例說明本發明的另一個實施方案中的分選方法的示意圖；和
[0031] 圖6舉例說明在本發明的另一個實施方案中微滴中的細胞感染的減少。
[0032] 詳述
[0033] 本發明總體上設及流體微滴，W及用于篩選或分選運樣的流體微滴的技術。在一 些實施方案中，所述流體微滴可含有細胞諸如免疫細胞，可分析所述細胞W測定所述細胞 的受體序列或其它有用的性質。例如，在一個方面，本發明總體上設及通過W下過程測定免 疫細胞受體:將免疫細胞和祀細胞封裝在微流體微滴中，測定免疫細胞對祀細胞的作用，和 對于殺死或W其它方式不利地影響祀細胞的那些免疫細胞，測定那些免疫細胞的一個或多 個受體序列。所述祀細胞可w是，例如，癌細胞或病毒感染的細胞。在一些情況下，受體序列 可用于，例如，鑒定免疫細胞的某些性質，篩選藥物或其它治療劑，等等。
[0034] 本發明的某些方面總體上設及其中兩個(或更多個)細胞包含在微滴諸如微流體 微滴中的測定法。所述細胞之一可作用于微滴內的其它細胞。可將其中發生某種結果（例 如，細胞被另一個細胞殺死)的微滴與其中發生其它結果(或無結果發生)的微滴分離。隨后 可例如通過對細胞的DNA測序、分析細胞mRNA水平、分析細胞蛋白質修飾(例如蛋白質憐酸 化水平)等來測定或分析所分離的微滴內包含的細胞。
[0035] 例如，參考圖1，在一組實施方案中，兩個(或更多個)細胞包含在微滴內。所述細胞 可來自相同生物體，相同物種的不同生物體，不同物種的不同生物體(例如，人和小鼠細胞， 人和大鼠細胞，人細胞和細菌，人細胞和真菌細胞，大鼠細胞和真菌細胞，細菌和真菌細胞 等)等。所述細胞還可被遺傳修飾，例如，可用編碼潛在功能性的膚或蛋白質的DNA質粒文庫 轉化一組細胞。如果多于兩個細胞存在于微滴中，則一些細胞可W是基本上相同的（例如， 復制細胞），和/或在微滴內可含有3、4或更多個類型的細胞，并且運樣的細胞可獨立地來自 相同物種或不同物種，W及來自相同生物體或不同生物體。所述細胞可存在于液體中，隨后 將所述液體形成含有細胞的微滴，和/或可在微滴形成后將細胞插入或注射入微滴。用于在 微滴中包含細胞的技術的實例包括在由Link等在2004年8月27日提交的標題為 巧lectronic Con化〇1 of Fluidic Species"的國際專利申請號PCT/US2004/027912(在 2005年3月10日公布為W0 2005/021151)，或由Weitz等在2010年6月25日提交的標題為 "Fluid Injection"的國際專利申請號PCT/US2010/040006(在2010年12月29日公布為W0 2010/151776)(其各自通過引用整體并入本文）中公開的那些技術。還可使用本領域普通技 術人員已知的用于產生包含在微滴內的細胞的其它技術。
[0036] 在一些情況下，細胞的一個(或多個)可W是與其它細胞(例如祀細胞)相互作用W 在祀細胞(和/或在一些情況下，效應細胞）中產生變化的效應細胞。例如，效應細胞可W是 識別祀細胞的T細胞或其它免疫細胞，例如，T細胞可殺死或抑制祀細胞。作為另一個實例， 效應細胞可W是分泌物質(例如，生長因子、神經遞質、激素、信號轉導膚或其它信號轉導化 合物、細胞調亡誘導因子等)的細胞，所述物質W可測定的方式影響(例如，通過抑制或促進 細胞生長、分裂、細胞調亡、分化等)祀細胞。在一些情況下，祀細胞和/或效應細胞可被遺傳 修飾，例如W產生分泌的物質或增加分泌的物質的產量，盡管在其它情況下，不對細胞進行 遺傳修飾。
[0037] 作為一個例子，效應細胞可W通過產生或分泌抗體或溶細胞蛋白或能夠與祀細胞 相互作用的其它化合物(例如，穿孔素、粒酶等)與祀細胞相互作用。可被分泌的其它化合物 包括其它基因編碼的蛋白質或不是蛋白質的其它化合物，例如青霉素、激素、小分子(例如， 小于化化或化化的）等。作為另一實例，效應細胞可W例如通過吞隧作用、細胞調亡誘導等 來殺死祀細胞。效應細胞還可釋放信號轉導分子或與祀細胞相互作用的其它物質，如上文 中提及的。效應細胞的實例包括，但不限于，免疫細胞諸如B細胞、T細胞、天然殺傷細胞、淋 己細胞、巨隧細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞等。在一組實施方案中，例如，效 應細胞是CD8巧細胞。祀細胞的非限制性實例包括癌細胞(或疑似癌性的細胞）、正常細胞、 外來細胞(例如，細菌、真菌、病原體等）、病毒等。在一些情況下，祀細胞可W是受感染的細 胞，例如，感染了細菌、病毒、真菌、病原體等的細胞。如所提及的，效應細胞與祀細胞之間的 相互作用可w是直接的（例如，效應細胞直接結合于祀細胞)和/或間接的（例如，祀細胞可 分泌影響祀細胞的物質）。作為非限制性實例，可研究來自癌癥患者的T細胞和腫瘤細胞W 測定T細胞上的能夠識別運樣的腫瘤細胞的那些受體，或可將T細胞與感染了病原體(例如， 細菌或病毒)的細胞結合，W測定能夠識別病原體的那些受體。
[0038] 細胞可來自任何適當的物種，并且如所提及的，來自多于一個物種的細胞可存在 于微滴內。例如，效應細胞和祀細胞可來自相同物種或不同的物種。細胞可包括真核細胞、 動物細胞、植物細胞、細菌或其它單細胞生物體等。如果細胞是動物細胞，則所述細胞可W 是，例如，無脊椎動物細胞(例如，來自果蛹的細胞）、魚細胞(例如，斑馬魚細胞）、兩棲動物 細胞(例如，青蛙細胞）、爬行動物細胞、鳥細胞，或人或非人哺乳動物諸如猴、猿、牛、綿羊、 山羊、馬、兔、豬、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓等的細胞。如果細胞來自多細胞生物體，則所述細 胞可W來自生物體的任何部分。例如，如果細胞來自動物，則所述細胞可W是免疫細胞、屯、 肌細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、肝細胞、軟骨細胞、神經細胞、骨細胞、成骨細胞、肌細 胞、血細胞、內皮細胞等。在一些情況下，細胞是經遺傳改造的。
[0039] 在一些情況下，祀細胞可含有信號轉導實體或被暴露于信號傳導實體。所述信號 轉導實體可W是能夠使用檢測法W某種方式測定的任何實體。例如，所述信號轉導實體可 W是在祀細胞死亡或破裂后從祀細胞釋放的巧光實體，或所述信號轉導實體可W是巧光信 號的抑制劑。因此，可測定微滴W測定信號轉導實體(例如，通過測定巧光）。例如，可在微滴 內測定信號轉導實體的分布和/或強度，并且基于所述信號轉導實體分選所述微滴。在下文 更詳細地討論了分選技術的例子。例如，祀細胞的生存力可通過測定信號轉導實體從祀細 胞的滲漏來測定，并基于運樣的測定來分選所述細胞。作為另一個實例，可使用信號轉導實 體來測定祀細胞的狀態或特征(例如，其內部抑或其尺寸）。作為另一個實例，祀細胞可通過 合成可測量的物質種類諸如特定的mRNA或蛋白質來響應信號轉導實體。在一些情況下，可 測量的合成蛋白質可W是標記蛋白諸如綠色巧光蛋白（GFP)。
[0040] 作為實例，在一些情況下，通過封裝的抗體分泌細胞(ASC)分泌的抗體可抑制共封 裝的祀細胞的病毒感染。抗體分泌細胞的非限制性實例包括雜交瘤細胞、B細胞、漿細胞等。 病毒感染的抑制可通過祀細胞的存活來測定。在一些情況下，可對祀細胞進行遺傳修飾W 提供病毒感染的巧光指示劑。在一些實施方案中，其中祀細胞保持非巧光的微滴可能含有 分泌抑制病毒感染的抗體的ASC。其中病毒感染被抑制的微滴可通過微流體分選來選擇，W 使得可測定中和抗體的序列。例如，參考圖5A，可將祀細胞、病毒W及抗體-分泌細胞包含在 微滴內。可將其中抗