專利名稱：趨化因子受體調制劑,制備和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及趨化因子受體調制劑，其制備方法和用途。
相關申請本申請是美國專利申請登記號No.60/217683(2000年7月12日申請)的部分持續申請，No.60/217683在這里引作參考。
背景技術：
趨化因子是白細胞運輸和各種其它生物過程中涉及的小蛋白質。大多數趨化因子是定位的并且通過誘導趨化性而增加炎癥，并且不同類型炎癥細胞的細胞激活一般存在于炎癥部位。一些趨化因子具有除趨化性之外的性質，例如誘導殺傷細胞的增殖和激活，調制造血母細胞類型的生長，在炎癥癥狀，血管生成和腫瘤生長時將造血母細胞運輸入和運輸出骨髓(參見，例如，Baggiolini等，Ann.Rev.Immunology(1997)15675-705；Zlotnik等，Critical Rev.Immunology(1999)19(1)1-4；Wang等，J Immunological Methods(1998)220(1-2)1-17；和Moser等，Intl.Rev.Immunology(1998)16(3-4)323-344)。
很多趨化因子的氨基酸序列，結構和功能是公知的。趨化因子具有大約8-10 kDa的分子量，并且在蛋白質水平上表現出彼此大約20-50％的序列同源性。并且這些蛋白質還具有共同的三級結構。所有的趨化因子具有一定數目的在分子內二硫鍵形成中涉及的保守的半胱氨酸殘基，它們被用來鑒定趨化因子并且將趨化因子分類。例如，具有由單個氨基酸分開的頭兩個半胱氨酸殘基的趨化因子被稱為″C-X-C″趨化因子(也稱為″α″趨化因子)。具有相鄰的頭兩個半胱氨酸殘基的趨化因子被稱為″CC″趨化因子(也稱為″β″趨化因子)。″C″趨化因子與其它趨化因子的不同之處在于沒有半胱氨酸殘基(也稱為″γ″趨化因子)。C趨化因子表現出與CC趨化因子的一些成員相類似，但是沒有第一和第三半胱氨酸殘基，而第一和第三半胱氨酸殘基是CC和CXC趨化因子的特征。具有由三個氨基酸分開的頭兩個半胱氨酸殘基的趨化因子小組成員被稱為″CXXXC ″趨化因子(也稱為″CX3C″或″δ″趨化因子)。還有趨化因子亞組。例如，已知包含另外兩個保守的半胱氨酸殘基的CC趨化因子，有時術語″C6-β″趨化因子用于該亞組。迄今為止鑒定的大多數趨化因子是CC和CXC趨化因子類的成員。
趨化因子的生物學活性是受體介導的。這包括趨化因子特異性受體還有具有與屬于CC趨化因子或CXC趨化因子族的幾種不同的趨化因子結合的重疊配體特異性的受體。例如，CC趨化因子SDF-1α對于CXCR4受體是特異性的，而CXC趨化因子RANTES結合CCR1，CCR3和CCR5受體。另一個例子是趨化因子Eotaxin，其是CCR3(也稱為CKR3)受體的配體(參見，例如Cyster，J.G.，Science(1999)2862098-2102；Ponath等，J.Experimental Medicine(1996)183(6)2437-2448；Ponath等，J.Clinical Investigation(1996)97(3)604-12；和Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Communications(1997)231(2)365-368)。
重要的疾病路徑，例如哮喘，過敏性鼻炎，特應性皮炎，癌癥，病毒引起的疾病，粉瘤/動脈粥樣硬化，類風濕性關節炎和器官移植排異中涉及趨化因子。但是，和很多趨化因子以及它們用作治療物的潛在的用途相關的一般問題涉及它們促進或惡化炎癥反應和感染的固有的性質。歸根結蒂，進行過很多趨化因子的修飾試圖產生相應的野生型趨化因子的拮抗劑。經典的有代表性的例子是RANTES的情況。在某些情況下，野生型RANTES能增強炎癥和HIV感染(Gordon等，RVirol.(1999)73684-694；Czaplewski等，J Biol.Chem.(1999)27416077-16084)。相反，在RANTES多肽鏈的26位(E26A)和66位(E66S)的取代作用將分子轉化為它的非炎癥版本，并且提高了它與其對于HIV的受體的競爭能力(Appay等，J.Biol.Chem.(1999)274(39)27505-27512)。此外，進行RANTES的N-末端修飾，產生能阻斷HIV-1感染的拮抗劑，包括N-末端截短[RANTES 9-68]，加入甲硫氨酸(″Met-RANTES″)，氨基氧戊烷(″AOP-RANTES″)，或者壬酰基(″NNY-RANTES″)(Arenzana-Seisdedos，等.，Nature(1996)383400；Mack，等，J Exp.Med.(1998)1871215-1224；Proudfoot，等.，J Biol.Chem.(1996)2712599-2603；Wells，等，WO 96/17935；Simmons，等，Science(1997)276276-279；Offord等，WO 99/11666；和Mosier等，J Virology(1999)73(5)3544-3550)。
在某些情況下，這樣的進展提高了拮抗劑-相關效力，但是制備趨化因子受體調制劑的挑戰之一是在改進其它藥物性質例如藥物動力學的同時提高藥效。也期望制備趨化因子的潛在的拮抗劑和相應的趨化因子受體調制劑化合物的一般策略和方法，和它們在制備用于預防和/或治療疾病的藥物的用途。本發明滿足這些和其它需要。
發明概述本發明涉及抑制相應的天然存在的趨化因子的作用的氨基-末端(“N-末端”)和羧基-末端(“C-末端”)修飾的趨化因子受體調制劑。本發明的N-末端趨化因子受體調制劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈。本發明的C-末端趨化因子受體調制劑包括在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈。本發明的N-和C-末端趨化因子受體調制劑還可以包括在N-和C-末端兩者一起進行的修飾。也提供了制備和應用趨化因子受體調制劑的方法。本發明的顯著之處在于提供了制備是相應的天然存在的野生型趨化因子或者它們的受體的潛在的抑制劑的化合物的一般途經。
詳細地，本發明涉及包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈。
本發明特別涉及這樣的趨化因子受體調制劑的實施方案，其中趨化因子多肽鏈包括與天然存在的野生型趨化因子的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列(例如CC趨化因子，CXC趨化因子等)。
本發明進一步涉及這樣的趨化因子受體調制劑的實施方案，其中N-末端包括是趨化因子多肽鏈的第一個形成二硫鍵的半胱氨酸的N-末端的趨化因子多肽鏈的氨基酸。
本發明進一步涉及這樣的趨化因子受體調制劑的實施方案，其中所述脂肪鏈是包括5-26個碳原子的烴鏈，和/或其中氨基酸衍生物具有式-(N-CnR-CO)-，其中n是1-22，R是氫原子，烷基或芳基，并且其中N和Cn，N和R，或者Cn和R能形成環結構。
本發明進一步涉及趨化因子受體調制劑，包括在其C-末端修飾有脂肪鏈(特別是其中包括5-22個碳原子的脂肪鏈)或多元環，特別是其中脂肪鏈或多元環是脂質的趨化因子多肽鏈。
本發明進一步涉及趨化因子受體調制劑，包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈。
此外，本發明涉及含有趨化因子受體調制劑的藥物組合物，其中趨化因子受體調制劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈，或者其藥學可接受鹽。
此外，本發明涉及含有趨化因子受體調制劑的藥物組合物，其中趨化因子受體調制劑包括在其C-末端修飾有脂肪鏈或者多元環的趨化因子多肽鏈，或者其藥學可接受鹽。
此外，本發明涉及含有趨化因子受體調制劑的藥物組合物，其中趨化因子受體調制劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈，或者其藥學可接受鹽。
本發明還涉及治療通過用趨化因子受體調制劑治療而減輕的哺乳動物(包括人)的疾病狀態(特別是其中所述疾病狀態是炎癥疾病，或者其中所述疾病狀態是由HIV感染引起的或者與HIV感染相關)的方法，該方法包括對需要這樣治療的哺乳動物施用治療有效量的趨化因子受體調制劑，其中所述趨化因子受體調制劑包括下面的趨化因子多肽鏈(A)在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，(B)在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環，或者(C)在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環。


圖1是四類天然存在的趨化因子和保守的半胱氨酸型定義的它們相應的N-末端，N-環和C-末端區的一般結構示意圖，其中“C”是半胱氨酸的一字母代碼，“X”代表除半胱氨酸之外的任何氨基酸。
圖2A-2E描述各種趨化因子多肽鏈的天然存在的氨基酸序列的例子，包括這些趨化因子的相應的N-末端，N-環和C-末端區。使用的是20種遺傳編碼的氨基酸的標準一字母氨基酸代碼。
優選實施方案說明本發明涉及N-和C-末端趨化因子受體調制劑。如這里使用的，術語“趨化因子受體調制劑”意指根據合適的趨化因子生物測試所測定的調制或抑制天然存在的趨化因子的活性的多肽，或衍生的多肽。合適的抑制劑可以通過拮抗它們所結合的趨化因子受體的一種或多種性質而起作用(例如抑制病毒感染，引起受體下調，引起受體內在化)，從而“拮抗”受體循環回細胞表面的正常周期。在其它生物響應的背景中，這樣的調制劑能夠作為受體的激動劑起作用，例如誘導鈣通量，引發趨化性等。因此，本發明的趨化因子受體調制劑能夠作為拮抗劑起作用(包括拮抗作用)，但是也可以作為激動劑起作用，或者是這兩者的混合。優選的是表現出至少一種拮抗性質的趨化因子受體調制劑，所述拮抗性質就是拮抗它們結合的趨化因子受體的一種或多種生物學性質的能力(例如阻斷或部分阻斷(1)病毒感染，(2)趨化性，(3)受體循環等)。這樣的趨化因子受體調制劑可以通過結合(或者捕獲)，但是不激活趨化因子受體而起作用，或者可以通過其它方式介導它們的作用。
本發明的N-末端趨化因子受體調節劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈。所述N-末端趨化因子受體調節劑從N-末端向C-末端方向閱讀時具有下式J1-X1-Z1-CHEMOKINE，其中J1是脂肪鏈；X1是包括趨化因子多肽鏈N-末端氨基酸序列的0個或多個氨基酸的間隔基團；Z1是氨基酸衍生物；CHEMOKINE是趨化因子多肽鏈殘留的氨基酸序列；短線(″-″)代表一個共價鍵。設計化合物時考慮多肽鏈的N-末端區的總長。因此，根據疏水性脂肪鏈的長度和氨基酸衍生物的位置，N-末端拮抗劑可以包括相對于相應的天然存在的趨化因子多肽鏈的一處或多處取代，插入或缺失。
本發明的C-末端趨化因子受體調節劑包括在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈。這些化合物從N-末端向C-末端方向閱讀時具有下式CHEMOKINE-X2-J2，其中X2是包括趨化因子多肽鏈C-末端氨基酸序列的0個或多個氨基酸的間隔基團；J2是脂肪鏈或多元環；CHEMOKINE是趨化因子多肽鏈殘留的氨基酸序列；短線(″-″)代表一個共價鍵。可以對趨化因子的C-末端區進行取代修飾，包括一個或多個氨基酸或者其它化學部分的插入，缺失或添加，與相應的野生型分子相比延長多肽鏈的C-末端，以及加入熒光標記和生物相容性聚合物，以及偶聯其它的化合物例如小的有機分子，肽，蛋白質等等。
本發明的N-末端和C-末端趨化因子受體調節劑可以包括在其N-和C-末端兩個區的修飾作用，具體指定為N-/C-末端趨化因子受體調節劑。這些化合物具有下式J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2，其中J1，XI，Z1，CHEMOKINE，X2，J2和″-″如上所述。這些化合物根據給定的最終的用途以協同方式合并了N-和C-末端修飾的優點。
″趨化因子多肽鏈″意指與天然存在的野生型趨化因子的多肽鏈基本上同源的多肽鏈。″N-末端氨基酸序列″意指是鄰接的并且是天然存在的趨化因子多肽鏈的第一個形成二硫鍵半胱氨酸的N-末端的趨化因子多肽鏈的氨基酸序列。″C-末端氨基酸序列″意指是鄰接的并且是天然存在的趨化因子多肽鏈的最后一個形成二硫鍵半胱氨酸的C-末端的趨化因子多肽鏈的氨基酸序列。構成本發明趨化因子受體調制劑基礎的趨化因子多肽鏈，N-末端氨基酸序列，C-末端氨基酸序列，第一個和最后一個形成二硫鍵的半胱氨酸容易從天然存在的趨化因子相應的氨基酸序列，以及通過與相同類的其它趨化因子特異性模擬，例如與已知的C，CC，CXC和CXXXC趨化因子的氨基酸序列相比較，而推導出。
例如，下面是已知的天然存在的趨化因子的例子，其中很多有不同的名稱，因此出現幾次6Ckine，9E3，ATAC，ABCD-1，ACT-2，ALP，AMAC-1，AMCF-1，AMCF-2，AIF，ANAP，Angie，β-R1，β-血小板球蛋白，BCA-1，BLC，blr-1配體，BRAK，C10，CCF18，Ck-β-6，Ck-β-8，Ck-β-8-1，Ck-β-10，Ck-β-11，cCAF，CEF-4，CINC，C7，CKA-3，CRG-2，CRG-10，CTAP-3，DC-CK1，ELC，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-1，Exodus-2，ECIP-1，ENA-78，EDNAP，ENAP，FIC，FDNCF，FINAP，Fractalkine，G26，GDCF，GOS-19-1，GOS19-2，GOS-19-3，GCF，GCP-2，GCP-2-類，GR01，GR02，GR03，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，H400，HC-11，HC-14，HC-21，HCC-1，HCC-2，HCC-3，HCC-4 H174，肝素中和蛋白，Humig，I-309，ILINCK，I-TAC，Ifi10，IL8，IP-9，IP-10，IRH，JE，KC，Lymphotactin，L2G25B，LAG-1，LARC，LCC-1，LD78-α，LD78-β，LD78-γ，LDCF，LEC，Lkn-1，LMC，LAI，LCF，LA-PF4，LDGF，LDNAP，LIF，LIX，LUCT，Lungkine，LYNAP，Manchester抑制劑，MARC，MCAF，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MDC，MIP-1-α，MIP-1-β，MIP-1-δ，MIP-1-γ，MIP-3，MIP-3-α，MIP-3-β，MIP-4，MIP-5，Monotactin-1，MPIF-1，MPIF-2，MRP-1，MRP-2，M119，MDNAP，MDNCF，巨核細胞刺激因子，MGSA，Mig，MIP-2，mob-1，MOC，MONAP，NC28，NCC-1，NCC-2，NCC-3，NCC-4 N51，NAF，NAP-1，NAP-2，NAP-3，NAP-4，NAP S，NCF，NCP，Neurotactin，制癌蛋白A，P16，P500，PARC，pAT464，pAT744，PBP，PBP-樣，PBSF，PF4，PF4-樣，PF4-ALT，PF4V1，PLF，PPBP，RANTES，SCM-1-α，SCI，SCY A26，SLC，SMC-CF，ST38，STCP-1，SDF-1-α，SDF-1-β，TARC，TCA-3，TCA-4，TDCF，TECK，TSG-8，TY5，TCF，TLSF-α，TLSF-β，TPAR-1，TSG-1。
為了詳細說明，而不是為了限制，圖2A-2D描述了上面列出的野生型趨化因子多肽鏈和它們相應的N-末端，N-環和C-末端氨基酸序列中的一些的例子。如圖所示，另外的趨化因子多肽鏈是已知的并且能夠從很多不同的來源獲得，包括公眾可進入的數據庫，例如(JohnsHopkins University，Maryland USA)，Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratory & Rutgers University，NewJersey USA)，Entrez(National Institutes of Health，MarylandUSA)，NRL 3D(Pittsburgh Supercomputing Center，CarnegieMellon University，Pennsylvania USA)，CATH(University CollegeLondon，London，UK)，NIH Gopher Server(NIH，Maryl and USA)，ProLink(Boston University，Massachusetts USA)，The NucleicAcid Database(Rutgers University，New Jersey USA)，Genebank(National Library of Medicine，Maryland USA)，Expasy(SwissInstitute of Bioinformatics，Geneva Switzerland)，等。還有，通過根據現有技術已知的標準技術，包括數據庫和相關的實現該目的工具，通過同源性和模式匹配能夠鑒定新的趨化因子，例如從不同的基因和蛋白質測序程序得到的那些。
在本發明的一個實施方案中，涉及進化技術，例如噬菌體展示或者模塊改組，可以用來產生具有提高的受體特異性的趨化因子。HIV的治療和預防(美國專利6,214,540；DeVico等)中描述過利用噬菌體展示對趨化因子衍生物或類似物測定它們結合趨化因子受體的能力。噬菌體展示技術也曾被用來檢測或鑒定CXC趨化因子受體3(CXCR3)(美國專利6,140,064，Loetscher等)的受體蛋白質的配體，抑制劑或啟動子，它們的特征在于選擇性結合具有誘導細胞應答能力的一種或多種趨化因子(美國專利6,184,358，Loetscher等)。在分子的標記和篩選中(美國專利6,180,336，Osbourn等)，在特異性抗原的結合分子的標記和接下來的純化中(參見例如，WO92/01047)，以及在預防和治療HIV感染和免疫疾病的肽組合物的檢測中(美國專利6,090,388，Wang)都描述過噬菌體展示的應用。
也描述過涉及G蛋白-偶聯受體的噬菌體展示方法(參見例如，Doorbar，J.等，″利用噬菌體展示分離凝血酶受體的肽拮抗劑″，J.Mol.Biol.，244361-9(1994))，在N-環區有定向進化的優選的區(Konigs，C，″噬菌體展示隨機肽庫的2單克隆抗體篩選揭示趨化因子受體CCR5的mimotopes受體的三級結構和HIV-1 gp120的N-末端結合位點的推斷″，Eur.J.Immunol.2000年4月；30(4)1162-71；Sidhu，S.S.等，″噬菌體上大蛋白質的高拷貝展示用于功能篩選″，JMol Biol 2000年2月18日；296(2)487-95；Fielding，A.K.等，″超融合劑gibbon猿ape白血病包膜糖蛋白配體展示對細胞毒素基因的定向，″Hum Gene Ther 2000年4月10日；11(6)817-26)，N-環和C-末端之間的區，和C-末端(Cain，S.A.等，″從全分子隨機誘變的C5a庫篩選新的配體″，Protein Eng 2001年3月；14(3)189-93；Heller，T.等，″從噬菌體文庫篩選在免疫綜合疾病和局部缺血/再灌注損傷中減弱炎癥反應的C5a受體拮抗劑″，J.Immunol.1999年6月15日；163(2)985-94；Chang，C.等，″利用組合肽庫解剖LXXLL核受體輔助激活劑相互作用主題α和β雌激素受體的肽拮抗劑的發現″，Mol Cell Biol 1999年12月；19(12)8226-39)。
合適的疏水性脂肪鏈J1和J2包括但不限于長度是5(C5)至22(C22)個碳原子的疏水性脂肪鏈。所述鏈可以是不飽和的和/或沒有支鏈的，或者可以具有不同的飽和度和/或支化度。脂肪鏈具有通式Cn(Rm)-，其中Cn碳原子數，Rm是選自氫原子，烷基，酰基，芳香基團或者它們的組合的取代基的數目，并且n和m可以是相同或不同的。基團J1和J2通過任何合適的共價鍵連接X1，X2或者連接趨化因子多肽鏈。合適的共價鍵的例子包括但不限于酰胺鍵，酮，醛，酯，醚，硫醚，硫代酸酯，thiozolidne，肟，oxizolidine，席夫堿和席夫堿型鍵(例如酰肼)。非限制性地，這樣的鍵包括-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C(O)NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-NH-(CH2)-C(O)-；-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-NH-(CH2)xNH-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-NH(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]yC(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-ONH-C(O)-；-ONH-(CH2)-C(O)-；-ONH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-NHC(O)-；-ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)x-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)；-OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C-(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-C(O)-；-S-C(O)NH-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-NHC(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]yC(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NHC(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-
-C3H6ON-C-；-C3H6ON-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-NH-(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-NH[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NHC(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-；-C(O)-，或者一個共價鍵，其中x和y是2，3，4或更大，并且可以是相同或不同的。
適合鍵合體系的化學是公知的并且可以用于該目的(參見，例如，″蛋白質共軛和交聯化學″，S.S.Wong，編著，CRC Press，Inc.(1993)；生物綴合化學透視，Claude F.Modres，編著，ACS(1993))。
除了J1和J2連接XI，X2或趨化因子多肽鏈之外，可以選擇使用的鍵合體系來調節目標分子的物理-化學和/或生物學性質，前提是得到的分子保留其拮抗劑性質。例如，通過插入在有關通過利用不同的長度、剛性、電荷和/或偏光力的鍵合體系調節半壽期等或者調節效力、特異性等方面與另一種相比的一種類型的條件下更穩定(或更不穩定)的鍵合體系能夠實現該目的。連接烴鏈和趨化因子多肽鏈的鍵合單元本質上可以不同，前提是J1和/或J2的總長度和空間占有最優選接近天然存在的趨化因子。
在優選的實施方案中，脂肪鏈J1是長度為5(C5)至10(C10)個碳原子的烴鏈，而脂肪鏈J2是長度為12(C12)至20(C20)個碳原子的脂質。J1 C5-C10烴鏈包括但不限于-C5H11，-C5H9，-C5H7，-C5H5，-C5H3，-C6H13，-C6H11，-C6H9，-C6H7，-C6H5，-C6H3，-C7H15，-C7H13，-C7H11，-C7H9，-C7H7，-C7H5，-C7H3，-C8H17，-C8H15，-C8H13，-C8H11，-C8H9，-C8H7，-C8H5，-C8H3，-C9H19，-C9H17，-C9H15，-C9H13，-C9H11，-C9H9，-C9H7，-C9H5，-C9H3，-C10H21，-C10H19，-C10H17，-C10H15，-C10H13，-C10H13，-C10H11，-C10H9，-C10H7，-C10H5，和-C10H3。
合適的J2脂質包括但不限于脂肪酸衍生的脂質和多元環甾族化合物衍生的脂質。所述脂肪酸包括但不限于飽和的和不飽和的脂肪酸。飽和脂肪酸的例子是月桂酸(C12)，十四烷基酸(C14)，棕櫚酸(C16)，硬脂酸(C18)，和花生酸(C20)。不飽和脂肪酸的例子包括油酸(C18)，亞油酸(C18)，亞麻酸(C18)，桐酸(C18)，和花生四烯酸(C20)。所述多元環包括但不限于醛甾酮，膽甾烷醇，膽固醇，膽酸，糞甾醇，皮質甾酮，可的松，脫氫膽甾醇，鏈甾醇，毛地黃皂甙配基，麥角甾醇，雌二醇，羥基皮質甾酮，7-膽甾烷醇，強的松，孕烯醇酮，孕甾酮，睪酮，酵母甾醇，等等。脂肪酸通常通過酸部分連接趨化因子多肽鏈，從而得到酰基-連接部分，但是也可以使用其它鍵。連接烴鏈和趨化因子多肽鏈的鍵合單元本質上可以不同，前提是N-末端區的總長度和空間占有接近天然存在的趨化因子。從這點上看發現C-末端區更靈活，這樣可以比N-末端區更大程度改變總長度和空間占有。
在另一個優選的實施方案中，本發明的趨化因子衍生物中包括J1和J2成分時，J1和J2包括C5至C20飽和或不飽和酰基鏈，例如壬酰基，壬烯酰基，氨基氧戊烷，十二酰基，十四酰基，棕櫚酸根，月桂酰基，棕櫚酰基，二十烷酰基，油酰基，或二十四烷酰基。例如，J1取代基可以是壬酰基或氨基氧戊烷，J2取代基可以是飽和或不飽和脂肪酸，優選C12-C20脂肪酸，或者多元環甾族化合物脂質例如膽甾醇。
根據脂肪鏈的性質和長度，本發明的趨化因子受體調制劑可以包括加給多肽鏈特別是在C-末端的另外的氨基酸或其它部分，提供對于脂肪部分的間隔基團和/或分開的連接位點。
″氨基酸衍生物″意指除20種遺傳編碼天然存在的氨基酸之外的氨基酸或類氨基酸化合物。特別地。氨基酸衍生物Z1不是20種遺傳編碼天然存在的氨基酸之一，而是具有式-(N-CnR-CO)-，其中Cn是1-22個碳原子，R是氫原子，烷基或者芳香基團，并且其中N和Cn，N和R，或Cn和R能夠形成環結構。還有，在其還原形式中，根據氨基酸衍生物的性質，N，Cn和R各自可以具有一個或多個氫原子。烷基部分可以是被取代的或不被取代的，其可以是線性的，支鏈的或者環的，并且可以包括一個或多個雜原子。氨基酸衍生物可以從頭制備或者從商業來源購得(參見，例如，Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Advanced Chemtech，Louisville，KY，USA；LancasterSynthesis，Inc.，Windham，NH，USA；Bachem California，Inc.，Torrance，CA，USA；Genzyme Corp.，Cambridge，MA，USA)。氨基酸衍生物的例子包括但不限于，氨基異丁酸(Aib)，羥基脯氨酸(Hyp)，1，2，3，4-四氫異喹啉-3-COOH(Tic)，二氫吲哚-2-羧酸(indol)，4-二氟-脯氨酸(P(4，4DiF))，L-噻唑烷-4-羧酸(Thz)，L-高脯氨酸(HoP)，3，4-脫氫-脯氨酸(ΔPro)，3，4-二羥基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH))，pBzl，-3，4-二羥基苯丙氨酸(F(3，4DiOH，pBzl))，二苯甲酮(p-Bz)，環己基丙氨酸(Cha)，3-(2-萘基)丙氨酸(βNal)，環己基甘氨酸(Chg)，和苯丙氨酸(Phg)。
關于X1，CHEMOKINE和X2，這些成分的氨基酸序列基本上與天然存在的野生型分子同源。術語″基本上同源″當在這里使用時，包括與給定序列至少具有40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％(優選95-99％)序列同源性的氨基酸序列。該術語包括但不限于相對于給定序列有1至20個，1至10個或者1至5個單個氨基酸缺失，插入或取代的氨基酸序列，前提是得到的多肽作為相應的天然存在的趨化因子的拮抗劑起作用。
例如，本領域公知某些氨基酸可以被其它氨基酸置換而多肽的性質基本上沒有改變，包括但不限于氨基酸的保守型取代。這樣的可能性在本發明的范圍內。還應該注意能經常進行基本上沒有改變多肽的性質的氨基酸的缺失或插入。本發明包括這樣的缺失或插入(其可以是例如至多是相應的天然存在的趨化因子的特異拮抗劑序列的長度的10，20或50％)。此外，可以使趨化因子進行實質性修飾，包括混合和匹配不同的趨化因子多肽片段，產生另外的多樣性，例如WO 99/11655中描述的模塊′交叉′合成方法，這篇文獻在這里全文引作參考。
除了在N-和/或C-末端改變之外，本發明的趨化因子受體調制劑還可以包括在多肽鏈中，即在上式CHEMOKINE代表的多肽鏈中，一個或多個氨基酸取代，插入或缺失。在優選的實施方案中，在趨化因子的N-環中進行改變，提高它對目標受體的特異性/選擇性。用這種方法，本發明的趨化因子受體調制劑的N-環可以阻斷特異性受體，同時減小對其可能的其它共同受體的拮抗劑作用。″N-環″意指與給定趨化因子多肽鏈的N-末端區的第一個保守半胱氨酸模式鄰接的/C-末端的20-26個氨基酸序列區(參見，圖1和2)。例如，以趨化因子多肽鏈的N-末端至C-末端方向閱讀時，CC趨化因子的N-環是位于與第一和第二個保守的半胱氨酸氨基酸之間和與它們鄰接/C-末端和與第三個保守的半胱氨酸氨基酸鄰接/N-末端的氨基酸區。
本發明的趨化因子受體調制劑還可以包括可檢測標記，例如熒光團，和在特異的選擇的位點導入的其它取代基，其將分子轉化為膜的探針和與趨化因子作用相關的細胞生物學作用，病毒抑制作用等，以及用于監測藥物動力學等。可檢測標記優選與趨化因子受體調制劑的C-末端區連接。可檢測標記可以在趨化因子多肽鏈的合成期間或合成之后插入。作為一個例子，在鏈組裝期間，可檢測標記可以插入到連接前的肽片段中，例如，在去除其它保護基團并且從樹脂釋放標記的肽之前，使熒光團與樹脂結合的肽上的沒有保護的反應基團連接是方便的。包括可檢測標記的氨基酸衍生物和用來將它們插入到肽或多肽序列中所使用的化學合成技術是公知的，并且可以用于該目的。用這種方法，可以對得到的趨化因子多肽鏈產物進行設計，使在選擇的具體位置之前包含一個或多個可檢測標記物。或者，可以對反應基團加上可檢測標記物，優選化學選擇性反應基團，例如酮基或醛基，它們使得連接之前的多肽片段或者甚至連接之后的多肽鏈的給定氨基酸上存在位點特異性連接。
適合該目的的可檢測標記物包括光敏基團，和發色團，包括熒光團和其它染料，或者半抗原，例如生物素。這樣的標記物可以從很多不同的商業途經獲得(參見，例如，Molecular Probes，Oregon USA；Sigma and affiliates，St.Louis MO，USA；等)。對于在樹脂上標記，熒光素，曙紅，俄勒岡綠，若丹明綠，對甲氨基酚綠，四甲基若丹明，若丹明紅，德克薩斯紅，香豆素和NBD熒光團，dabcyl發色團和生物素對于氟化氫(HF)來說都是適當穩定的，并且對于大多數其它酸來說也都是適當穩定的，因此對于通過固相合成插入是合適的(Peled，等，Biochemistry(1994)337211；Ben-Efraim，等，Biochemistry(1994)336966)。除香豆素之外，這些熒光團對于用來將利用Fmoc化學過程合成的肽去保護的試劑也是穩定的(Strahilevitz，等，Biochemistry(1994)3310951)。也可以使用ε-dabcyl-L-賴氨酸的t-Boc和α-Fmoc衍生物在多肽序列的選擇位點插入dabcyl發色團。dabcyl發色團具有很寬的可視吸收，并且可以用作淬火基團。通過使用dabcyl琥珀酰亞胺酯也可以在N-末端插入dabcyl基團(Maggiora，等，J Med Chem(1992)353727)。EDANS是FRET實驗中對于與dabcyl淬滅劑配對的常用熒光團。通過使用5-((2-(t-Boc)-γ-谷氨酰氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸可以在肽的自動合成期間方便地引入這樣的熒光團(Maggiora，等，J Med Chem.(1992)353727)。在化學合成期間可以使用α-(t-Boc)-ε-丹磺酰-L-賴氨酸將丹磺酰熒光團插入到多肽中(Gauthier，等，Arch Biochem.Biophys.(1993)306304)。和使用EDANS一樣，這種熒光團的熒光與dabcyl的吸收重疊。使用t-Boc-保護的生物胞素的衍生物(Geahlen，等，Anal.Biochem.(1992)20268)，或者其它已知的生物素化衍生物例如NHS-生物素等能夠實現肽的定位生物素化作用。外消旋二苯甲酮苯丙氨酸類似物也可以在其t-Boc或Fmoc保護作用之后插入到肽中(Jiang，等，Intl.J Peptide Prot.Res.(1995)45106)。非對映異構體的拆分可以通過產物的HPLC純化完成；沒有保護的二苯甲酮也可以通過本領域標準技術拆分。用于肟偶聯的攜帶酮基的氨基酸，氮雜/羥基色氨酸，生物素化賴氨酸和D-氨基酸也屬于可以用于樹脂標記的氨基酸的其它例子。認識到通過根據本領域標準技術的常規合成能夠制備用于自動肽合成的其它保護的氨基酸。在另一個實施方案中，本發明的趨化因子受體調制劑可以包括與其結合的藥物(參見，例如，WO 00/04926)。
還提供了制備本發明趨化因子受體調制劑的方法，該方法包括(i)合成包括具有與天然存在的趨化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽鏈的天然存在的趨化因子的類似物，其中所述多肽鏈在N-末端，N-環和C-末端的一處或多處修飾有選自脂肪鏈和氨基酸衍生物的部分；和(ii)與相應的天然存在的趨化因子相比對趨化因子類似物篩選拮抗劑活性。
特別地，制備N-末端趨化因子受體調制劑的方法包括(i)合成包括具有與天然存在的趨化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽鏈的天然存在的趨化因子的類似物，其中所述多肽鏈在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物；和(ii)與相應的天然存在的趨化因子相比對趨化因子類似物篩選拮抗劑活性。制備C-末端趨化因子受體調制劑的方法包括(i)合成包括具有與天然存在的趨化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽鏈的天然存在的趨化因子的類似物，其中所述多肽鏈在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環；和(ii)與相應的天然存在的趨化因子相比對趨化因子類似物篩選拮抗劑活性。制備N-/C-末端趨化因子受體調制劑的方法包括(i)合成包括具有與天然存在的趨化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽鏈的天然存在的趨化因子的類似物，其中所述多肽鏈在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環；和(ii)與相應的天然存在的趨化因子相比對趨化因子類似物篩選其拮抗劑活性。
本發明的趨化因子受體調制劑的合成是通過化學合成(即，沒有核糖體的合成)，或者生物合成(即，有核糖體的合成)和化學合成的結合來實現的。對于化學合成，趨化因子受體調制劑可以通過一步一步鏈組裝或片段縮合技術整個制備，例如利用Fmoc和tBoc途經的固相或液相肽合成，或者通過鏈組裝整個制備的肽片段的化學連接，或者鏈組裝和生物合成的組合。這樣的一步一步鏈組裝或片段縮合和連接技術是本領域公知的(參見，例如，Kent，S.B.H.，Ann.Rev.Biochem.(1988)57957-989；Dawson等，Methods Enzymol.(1997)28734-45；Muir等，Methods Enzymol.(1997)289266-298；Wilken等，Current Opinion In Biotechnology(1998)9412-426；Ingenito等，J Amer.Chem.Soc.(1999)121(49)11369-11374；和Muir等，Chemistry & Biology(1999)6R247-R256)。
對于化學連接，具有N-末端官能團的第一肽片段與具有C-末端官能團的第二肽片段連接，C-末端官能團與N-末端官能團反應，在它們之間生成共價鍵。根據選擇的官能團，連接反應產生在連接位點有正常酰胺鍵或非正常共價鍵的產物。用于化學連接的第一或第二肽片段一般利用一步一步鏈組裝或片段縮合來制備。特別地，當通過肽片段的連接制備趨化因子受體調制劑時，就想要的用于連接的化學選擇性反應化學來說，制備包含合適的攜帶的化學選擇性反應基團的片段。這些化學過程包括但不限于正常化學連接(Dawson，等，Science(1994)266776-779；Kent，等，WO 96/34878)，延長的一般化學連接(Kent，等，WO 98/28434)，形成肟的化學連接(Rose，等，J Amer，Chem.Soc.(1994)11630-33)，形成硫代酸酯的連接(Schnolzer，等，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的連接(Englebretsen，等，Tet，Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的連接(Gaertner，等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，和形成四氫噻唑的連接和形成噁唑烷的連接(Zhang，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等，WO 95/00846)。
選擇給定連接化學過程的反應條件，保持連接成分的期望的相互作用。例如，可以改變pH和溫度，肽和成分的水溶性，肽的比例，各種肽的水含量和組成，使連接最優化。可以進一步利用添加或逐出溶解肽的試劑至不同的程度，來控制期望的連接反應的特異性和速度。通過測定期望的化學選擇性反應產物與一種或多種內對照和/或外對照的比較，容易確定反應條件。
化學合成的優選方法使用了正常化學連接，這公開于Kent等，WO96/34878，和公開于Offord等，WO 99/11666中的在N-和/或C-末端進行化學修飾制備蛋白質的方法，這些文獻的公開內容在此引作參考。一般情況下，包含C-末端硫代酸酯的第一肽與帶有具有沒有氧化的巰基側鏈的N-末端半胱氨酸的第二肽反應。N-末端半胱氨酸的氧化的巰基側鏈在催化量的硫醇的存在下與C-末端硫代酸酯縮合，所述硫醇優選是芐基硫醇，苯硫酚，2-硝基苯硫酚，2-硫代苯甲酸，2-硫代吡啶，等。通過對-氨基硫代酸酯鍵連接第一和第二肽來制備中間體肽，其重排產生包括通過酰胺鍵連接的第一和第二肽的肽產物。
對于化學和生物合成的結合，通過化學合成制備一個肽片段，同時應用重組技術制備另一個，然后利用化學連接來連接片段，產生全長產品。例如，可以使用intein表達系統開發′intein′蛋白質剪接元件的可誘導自身裂解活性，來產生C-末端硫代酸酯肽片段。特別地，intein在硫醇例如DTT，b-巰基乙醇或半胱氨酸的存在下經歷了自身裂解，產生帶有C-末端硫代酸酯的肽片段(參見，例如，Muir等，Chemistry & Biology(1999)6R247-R256；Chong等，Gene(1997)192277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等，Protein Science(1998)72256-2264；和Cotton等，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。然后可以利用這種帶有C-末端硫代酸酯的肽片段連接帶有N-末端硫代酸酯反應官能團的第二個肽，例如帶有用于正常化學連接的N-末端半胱氨酸的肽片段。
在鏈裝配期間，鏈裝配之后或者期間及之后，可以插入脂肪鏈和氨基酸衍生物。對于在鏈裝配期間插入，在逐步式或片段縮合，和/或連接鏈裝配過程中插入氨基酸衍生物和/或具有與其連接的脂肪鏈的氨基酸。這些氨基酸可以以逐步的方式加給肽合成期間延長著的肽鏈，加給目的在于連接的裝配的肽片段，或者在某些情況下，通過從聚合物載體上裂解，能夠提供結合的N-或C-末端修飾，通過裂解產物得到期望的脂肪鏈。對于后鏈裝配，在鏈裝配期間(保護的或沒有保護的形式)插入氨基酸或者其帶有反應官能團的衍生物，然后以其沒有保護的反應形式使用連接期望的部分，即，在后肽合成連接反應中。在變性線性肽鏈上，或者在多肽鏈折疊之后，可以進行后鏈裝配連接。在優選的實施方案中，在肽合成中在感興趣的氨基酸位點加上氨基酸衍生物，而在肽合成之后通過連接反應加上N-，C-和/或N-/C-末端脂肪鏈。根據期望的共價鍵，可以利用多種連接化學過程中的任何一種(參見，例如，Plaue，S等，Biologicals.(1990)18(3)147-57；Wade，J.D.等，Australas Biotechnol.(1993)3(6)332-6；Doscher，M.S.，Methods Enzymol.(1977)47578617；Hancock，D.C.等，Mol Biotechnol.(1995)4(1)73-86；Albericio，F.等，Methods Enzymol.(1997)289313-36)，以及連接化學過程。根據本領域標準技術能夠實現本發明趨化因子受體調節劑的折疊。參見，例如，WO 99/11655；WO 99/11666；Dawson等，MethodsEnzymol.(1997)28734-45)。
對于對趨化因子化合物篩選拮抗劑活性，以特征在于趨化因子配體與其相應的受體直接或間接結合的測試為基礎，通過體外或體內，檢測化合物。趨化因子受體和它們的相應的野生型趨化因子的例子包括CXXXCR1(Fractalkine)；XCR1(SCM-1)；CXCR2(GRO，LIX，MIP-2)；CXCR3(MIG，IP-10)；CXCR4(SDF-1)；CXCR5(BLC)；CCR1(MIP-1α，RANTES，MCP-3)；CCR2(MCP-1，MCP-3，MCP-5)；CCR3(Eotaxin，RNATES，MIP-1α)；CCR4(MDC，TARC)；CCR5(RANTES，MIP-1α，MIP-1β；CCR6(MIP3α)；CCR7(SLC，MIP-3β)；CCR8(TCA-3)；和CCR9(TECK)。這些系統的體內和體外測試是公知的，并且容易獲得，或者能夠從頭制備。參見，例如，US 5,652,133；US5,834,419；WO 97/44054；WO 00/04926；和WO 00/0492。例如，一般使用表達一種或多種趨化因子受體的天然的，轉化的，和/或轉基因細胞系監測當暴露給趨化因子受體調制劑例如本發明的化合物時趨化因子誘導的趨化性的效果或者對該作用的抑制。也可以使用動物模型，例如，監測與本發明的趨化因子受體調制劑處理相關的反應曲線，或者表征這些化合物的藥物動力學和藥效性能。為了表征作為病毒感染抑制劑的本發明的化合物，可以應用使用靶細胞系和膜細胞系的膜-介導的細胞融合測試對本發明的趨化因子受體調制劑篩選它們預防HIV感染的能力。當然，也可以使用沒有細胞的病毒感染測試用于該目的。
作為一個例子，一般對于評價趨化性的拮抗作用，可以使用外周血白細胞，例如根據已知的單細胞純化方法從正常供者分離的那些，T淋巴細胞和嗜中性白細胞。可以構建一組表達C，CC，CXXXC和CXC趨化因子受體的試驗細胞，并且在接觸本發明的各種化合物的系列稀釋物之后進行評價。天然的趨化因子可以用作對照物。例如，用編碼不同的趨化因子受體的表達盒轉染的一組細胞適合該目的。例如，可以使用轉化體表達CXCR4/融合/LESTR，CCR3，CCR5，CXC4(這樣的細胞可以從各種商業來源和/或科研途經獲得或者能夠根據標準方法制備；參見，例如，Risau，等.，Nature 387671-674(1997)；Angiololo，等，Annals NY Acad.Sci.(1996)795158-167；Friedlander，等，Science(1995)8701500-1502)，能夠篩選趨化因子的拮抗劑，例如RANTES，SDF-1α或SDF-1β和MIP。結果可以表示為趨化性指數(″CI″)，代表刺激物對對照介質誘導的細胞遷移中折疊的增加，并且測定統計學意義。
也可以進行受體結合測試，例如評價競爭抑制作用對受體再循環作用(參見，Signoret，N.等，″HIV輔助受體CCR5的胞吞作用和再循環″，J Cell Biol.2000 151(6)1281-94；Signoret，N.等，″趨化因子受體胞吞作用和再循環的分析″，Methods Mol Biol.2000；138197-207；Pelchen-Matthews，A.等，″趨化因子受體運輸和病毒復制″，Immunol Rev.1999年4月；16833-49；Daugherty，B.L.等，″放射性標記趨化因子結合測試″，Methods Mol Biol.2000；138129-34；Mack，M.等，″趨化因子受體的下調和再循環″，MethodsMol Biol.2000；138191-5；所有這些在此引作參考)。這種方法是公知的，并且一般根據標準方法在遞增濃度的未標記天然趨化因子的存在下使用標記的趨化因子受體調制劑。當然，標記可以在一個配體或兩個配體上。在這種類型的測試中，可以例如使用計算機程序例如LIGAND(P.Munson，Division of Computer Research andTechnology，NIH，Bethesda，MD)分析結合數據，并且與天然白細胞或一組表達靶趨化因子受體的受體轉染細胞，使用“一點”和“兩點”模型進行Scatchard作圖分析。然后利用下面的計算式計算沒有標記的配體對結合的競爭速度％抑制作用＝1-(在沒有標記的趨化因子存在下結合/在只有介質存在下結合×100。
為了對化合物篩選它們預防或減輕病毒感染和疾病的能力，可以對一組暴露給各種病毒株和對照物穩定表達每一種合適的受體的細胞篩選化合物。例如，可以使用表達CCR3，CCR5，CXC4或CXCR4受體的U87/CD4細胞篩選M-回歸，T-回歸和雙重回歸HIV株的感染。可以以相對于趨化因子受體調制劑和對照濃度感染百分比評價病毒感染的抑制作用。參見，例如.，McKnight，等，Virology(1994)2018-18)；和Mosier，等，Science(1993)260689-692；Simmons，等，Science(1997)276276-279；Wu，等，J.Exp.Med.(1997)185168-169；和Trkola，等，Nature(1996)384184-186)。鈣遷移測定是用于篩選受體結合的拮抗劑的另一個實施例，例如鑒定對于嗜中性白細胞和嗜酸性細胞是趨化性的天然趨化因子的拮抗劑(Jose，等.，J.Exp.Med 179881-887(1994))。作為另一個例子，通過小雞尿囊絨膜(CAM)測試可以評價本發明的化合物的生血管活性(Oikawa，等，Cancer Lett，(1991)5957-66)。
本發明的趨化因子受體拮抗劑具有很多用途，包括用作研究工具，診斷和用作治療物。特別地，發現本發明的趨化因子受體拮抗劑具有有價值的藥理學性質，已經證明有效阻斷與在各種疾病中涉及的相應的野生型分子相關的炎癥作用，所述各種疾病包括哮喘，變應性鼻炎，特應性皮炎，粉瘤/動脈粥樣硬化，器官移植排異，和類風濕性關節炎。因此，它們用于治療哮喘，變應性鼻炎，特應性皮炎，粉瘤/動脈粥樣硬化，器官移植排異，和類風濕性關節炎。例如，幾種本發明的趨化因子受體拮抗劑例如RANTES和SDF-1α或SDF-1β拮抗劑也被證明抑制HIV-1感染，并且拮抗劑(例如，vMIP-II)可以用于相同的目的。因此，本發明的RANTES，或SDF-1α或SDF-1β拮抗劑和本發明的vMIP-II類似物用于抑制哺乳動物HIV-1。通過下面實施例中描述的方法測定化合物用于抗HIV-1用途的潛力。通過本領域技術人員公知的方法測定化合物抗炎效果的潛力。此外，要明白本發明的趨化因子受體調制劑可以單獨使用，或者相互組合使用，以及與在治療一種給定疾病中有協同作用的其它非趨化因子藥物組合使用。
舉例來說，不是限制性的，下面是詳細說明這些分子制備趨化因子受體調制劑的一般用途的野生型趨化因子分子和它們相關的生物學性能的一些具體例子。例如，SCM-1是脾中表達的C-趨化因子。其本質上與CC和CXC-趨化因子有關，主要差別在于它只具有這些蛋白質中保守的四個半胱氨酸的第二個和第四個(Yoshida等，FEBS Letters(1995)360(2)155-159)；Yoshida等，J.Biol.Chem.(1998)273(26)16551-16554)。對于人，有兩種高度同源的蛋白質，SDF-1α或SDF-1β，其差別在于兩個氨基酸取代基。發現SCM-1與鼠淋巴細胞特異性趨化因子lymphotactin大約60％相同。因此SCM-1和lymphotactin可以代表人和鼠C-趨化因子或γ-趨化因子的原型。兩種SCM-1分子特異性誘導基因工程處理表達孤獨受體GPR5的鼠L1.2細胞中的遷移，GPR5主要在胎盤中表達，在各種人組織中在脾和胸腺中弱表達。因此，發現SCM-1的拮抗劑在阻斷GPR4的正常功能中的用途。
作為另一個實施例，Fractalkine的可溶形式，一種76個氨基酸CXXXC-趨化因子，是T-細胞和單核細胞的有效化學引誘物，但是對嗜中性白細胞則不是。用TNF或IL1刺激之后Fractalkine大大增加。對于Fractalkine的人受體指定為CX3CR1。該受體介導Fractalkine的粘著和遷移功能。該人受體在嗜中性白細胞，單核細胞，T-淋巴細胞，和幾種實體器官包括腦中表達。已經證明該受體與CD4一起作為來自HIV-1初級分離物的膜蛋白的輔助受體發揮功能。細胞-細胞融合測試證明Fractalkine有效地并且特異性地抑制融合。(參見，例如，Bazan等，Nature(1997)385(6617)640-644；Combadiere等，J.Biol.Chem.(1998)273(37)23799-23804；Rossi等，Genomics(1998)47(2)163-170；和Faure等，Science(2000)2872274-2277)。因此表明發現Fractalkine的拮抗劑在涉及TNF或IL1途經的各種關節炎疾病例如關節炎的治療中的用途，還發現作為HIV感染阻斷劑的用途。
Eotaxin是另外一個例子。該蛋白質長度是74個氨基酸，并且由于其特征性半胱氨酸模式而分類為CC-趨化因子。在用作變應性炎癥模型的豚鼠的支氣管肺泡中發現它，并且涉及與哮喘相關的疾病。Eotaxin誘導皮膚中1-2 pM劑量的大量的嗜酸性細胞累積，而不明顯影響嗜中性白細胞的累積。Eotaxin是豚鼠和人嗜酸性細胞的體外有效刺激劑。該因子表現出與豚鼠嗜酸性細胞上的RANTES共享一個結合位點。Eotaxin對正常人嗜酸性細胞誘導鈣流通響應，但是對嗜中性白細胞或單核細胞則不是這樣。通過用其它CC-趨化因子預處理嗜酸性細胞不能將該響應脫敏。在嗜堿細胞中，Eotaxin誘導比RANTES高水平的趨化性響應，但是其對于組胺釋放或白三烯C4產生只有邊緣作用。其在B-細胞淋巴瘤細胞的趨化性中也可以起作用。Eotaxin的主要受體是CCR3(參見，例如，Bartels等，Biochem.Biophys.Res.Comme(1996)225(3)1045-51)；Jose等，J Exp.Med.(1994)179881-887)；Ponath等，J.Clin.Investigation(1996)97(3)604-612)；Ponath等，J.Exp.Med.(1996)183(6)2437-2448)；Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1997)231(2)365-368)。因此，Eotaxin的拮抗劑可以用作哮喘和其它嗜酸性細胞相關的變應性疾病的潛在的調制劑。
RANTES是令人特別感興趣的拮抗劑的靶趨化因子的另一個例子。它是在從炎癥，器官排異到HIV感染范圍很多疾病中涉及的一種CC-趨化因子。TNF-α和IL1-α誘導RANTES的合成，但是TGF-β，IFN-γ和IL6則不誘導。培養物中循環T-細胞和T-細胞克隆產生RANTES，而迄今為止試驗的任何T-細胞系則不產生。T-淋巴細胞的刺激作用之后抑制RANTES的表達。對于T-細胞，人嗜酸性細胞和嗜堿細胞，RANTES是趨化性的，并且在將白血球補充到炎癥部位中起著積極作用。RANTES也激活嗜酸性細胞釋放例如嗜酸性陽離子蛋白質。它改變嗜酸性細胞的密度并且使得它們hypodense，認為這代表一般細胞激活的狀態并且常常與象哮喘和變應性鼻炎這樣的疾病相關。RANTES也是氧化代謝的潛在的嗜酸性細胞-特異性激活劑。RANTES提高單核細胞對內皮細胞的粘著性。它選擇性支持表達細胞表面標記CD4和UCHL1的單核細胞和T-淋巴細胞的遷移。認為這些細胞預先刺激具有記憶T-功能的輔助T-細胞。RANTES激活來自某些選擇嗜堿細胞供體的人嗜堿細胞并且引起組胺的釋放。另一方面，RANTES也能抑制幾種細胞因子包括最有效的組胺誘發劑MCAF之一誘導的組胺從嗜堿細胞的釋放。
最近證明RANTES具有除趨化性之外的生物學活性。它能誘導已知為類似于IL2激活的細胞的CHAK(C-C-趨化因子激活殺傷細胞)的殺傷細胞的增殖和激活。人滑液成纖維細胞表達RANTES，并且RANTES可以參與正在發生的類風濕性關節炎的炎癥過程。在人單核細胞白血病細胞系THP-1上已經鑒定了RANTES的高親和性受體(大約700個結合位點/細胞；Kd＝700皮摩爾)，其在趨化性和鈣遷移測試中響應RANTES。通過與MCAF(單核細胞趨化性和激活因子)或者MIP-1-α(巨噬細胞炎性蛋白質)預先溫育，THP-1細胞對RANTES的趨化性響應得到大大抑制。RANTES對單核細胞的結合受到MCAF和MIP-1-α的競爭。RANTES的受體是CCR1，CCR3和CCR5。RANTES的拮抗劑的臨床應用和意義是多方面的。例如，天然RANTES的抗體能夠顯著抑制與實驗血管系膜增殖性腎炎相關的細胞滲透。另外，天然RANTES表現出在經受與腎移植排異相關的細胞排斥的人腎同種移植中高效表達(Pattison等，Lancet(1994)343(8891)209-11(1994)。已經證明RANTES的化學修飾形式(氨基氧戊烷-RANTES或AOP-RANTES；和正-壬酰基RANTES或NNY RANTES)作為趨化因子的CCR-5受體的拮抗劑起作用，并且具有抑制HIV-1感染的能力。因此，根據本發明的RANTES的N-，C-和N-/C-末端修飾的類似物拮抗劑作為象哮喘，變應性鼻炎，特應性皮炎，器官移植，粉瘤/動脈粥樣硬化和類風濕性關節炎這樣的疾病的治療中的抗炎藥物是有用的。
趨化因子SDF-1α和β的拮抗劑是另外的例子，它們屬于CXC類趨化因子。SDF-1β的不同之處在于在C-末端具有四個另外的氨基酸。這些趨化因子與它們的非人相應物92％以上相同。除了血細胞之外SDF-1被普遍表達。SDF-1對淋巴細胞和單核細胞起作用，但是體外對嗜中性白細胞不起作用，并且體內是單核細胞的高效化學引誘劑。其還誘導淋巴細胞內胞內肌動蛋白聚合作用。SDF-1體外體內作為人造血母細胞的化學引誘劑，產生混合類型的并且更原始類型的母細胞。SDF-1還表現出在心室隔膜的形成中涉及。CD34+細胞的趨化性加強了對SDF-1和IL-3組合的響應。SDF還被證明誘導這些細胞中細胞質鈣的暫短增加。SDF-1的主要受體是CXCR4，它還作為HIV1的主要T-淋巴細胞輔助受體發揮功能。參見，例如.，Aiuti等，J.Exp.Med.(1997)185(1)111-120(1997)；Bleul等，J Exp.Med.(1996)184(3)1101-1109(1996)；Bleul等，Nature(1996)382(6594)829-833；D′Apuzzo等，European J.Immunol.(1997)27(7)1788-1793；Nagasawa等，Nature(1996)382635-638)；Oberlin等，Nature(1996)382(6594)833-835。例如，本發明的SDF-1拮抗劑作為象哮喘，變應性鼻炎，特應性皮炎，器官移植，粉瘤/動脈粥樣硬化和類風濕性關節炎這樣的疾病的治療中的抗炎藥物是有用的。此外，本發明的SDF-1拮抗劑可以單獨使用或者與其它化合物例如本發明的RANTES拮抗劑類似物結合使用，用于阻斷就原炎癥細胞的募集和/或激活來說SDF-1，RANTES，MIP-1α，和/或MIP-1β在哺乳動物中的作用，或者治療或阻斷HIV-1感染。
因此，本發明的另一方面涉及通過施用治療有效量的包括本發明的趨化因子受體調制劑的化合物或者其藥學可接受鹽對需要的哺乳動物治療的藥物組合物和方法。″藥學可接受鹽″意指保留本發明多肽的生物學效力和性質而且沒有生物學或其它方面不期望的性質的鹽。鹽可以從酸或堿衍生。酸加成鹽衍生自無機酸，如鹽酸，氫溴酸，硫酸(得到硫酸鹽和硫酸氫鹽)，硝酸，磷酸等，和有機酸，如乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，蘋果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，水楊酸，對甲苯磺酸等。堿加成鹽可以衍生自無機堿，包括鈉，鉀，鋰，銨，鈣，鎂鹽等。衍生自有機堿的鹽包括從下面的化合物形成的那些伯胺，仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺，和環胺包括異丙基胺，三甲基胺，二乙基胺，三乙基胺，三丙基胺，乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，氨丁三醇，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，咖啡因，普魯卡因，羥基胺，膽堿，甜菜堿，乙二胺，葡萄糖胺，N-烷基葡萄糖胺，可可堿，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶等。優選的有機堿是異丙基胺，二乙胺，乙醇胺，哌啶，氨丁三醇和膽堿。
這里使用的術語″治療″包括哺乳動物特別是人的疾病的任何治療，包括(i)預防受試者疾病發生，所述疾病可能預先已經存在但是還沒有診斷患有該疾病；(ii)抑制該疾病，即阻止其發展；或者(iii)減輕疾病，即使得該疾病消退。
這里使用的術語″通過用趨化因子受體調制劑治療而預防或減輕的哺乳動物疾病狀態″意在包括本領域一般公知的一般情況下用趨化因子受體調制劑有用治療的所有的疾病狀態，和發現通過用本發明具體化合物治療有用地防止或減輕的那些疾病狀態。為了詳細說明而非限制性地，這些包括哮喘，過敏性鼻炎，特應性皮炎，病毒疾病，粉瘤/動脈粥樣硬化，類風濕性關節炎和器官移植排異。
這里使用的術語″治療有效量″指當對需要的哺乳動物施用時足以例如作為消炎藥物，抗哮喘藥物，免疫抑制藥物，或者抑制哺乳動物病毒感染的抗自身免疫疾病藥物有效治療(如上定義)的本發明趨化因子受體調制劑的量。構成″治療有效量″的該量取決于趨化因子衍生物，癥狀或疾病及其嚴重程度，要治療的哺乳動物，其體重，年齡等，但是本領域技術人員根據經驗和本說明書的公開可以按常規確定。這里使用的術語″q.s.″指加入足以實現所述功能，例如使得溶液達到期望的體積(例如，100mL)的量。
以治療有效劑量施用本發明的趨化因子受體調制劑和它們的藥學可接受鹽，即活性成分，所述治療有效劑量即如上所述當對相應的哺乳動物施用時足以有效治療的量。這里描述的趨化因子受體調制劑的施用可以通過對于有著相似用途的藥物來說任何可接受的施用方式。這里使用的術語″本發明的趨化因子受體調制劑″，″本發明的多肽的[藥學可接受鹽]″和″活性成分″互換使用。
制劑中趨化因子受體調制劑的含量可以在本領域技術人員使用的全部范圍內改變，例如，占總制劑的從大約0.01％重量(％w)至大約99.99％w的趨化因子受體調制劑和大約0.01％w至99.99％w賦形劑。更典型地，趨化因子受體調制劑以大約0.5％w至大約80％w的水平存在。
本發明趨化因子受體調制劑對人劑量水平進行了優化，一般來說，日劑量是每千克體重每天大約0.05至25mg，最優選是每千克體重每天大約0.01至10mg。因此，對體重70kg的人施用，劑量范圍是每天大約0.07mg至3.5g，優選每天大約3.5mg至1.75g，最優選每天大約0.7mg至0.7g。施用的拮抗劑的量當然取決于受試者和預防或減輕所針對的疾病狀態，疾病的性質或嚴重程度，施藥方式和時間表，以及開處方的醫師的判斷。這樣的使用優化完全在本領域技術人員范圍之內。
可以通過任何可接受的全身或局部途經施藥，例如，通過腸胃外，口服(特別是嬰兒制劑)，靜脈內，鼻內，支氣管吸入(即，氣霧劑制劑)，透皮或局部途經，以固體形式，半固體形式或液體形式或氣霧劑劑量形式，象，例如，片劑，丸劑，膠囊，粉末，液體，溶液，乳狀液，注射液，懸浮液，栓劑，氣霧劑等。本發明的趨化因子受體調制劑也可以以緩釋或控制釋放劑量形式給藥，包括貯存式注射液，滲透泵，丸劑，透皮貼(包括電轉運)，等等，用于以預定速度延時施用多肽，優選以適合單次給藥的精確劑量的單位劑量形式。組合物含有常規藥物載體或賦形劑和本發明的趨化因子受體調制劑，此外，可以含有其它藥用物質，藥物，載體，佐藥等。載體可以選自各種油類，包括石油，動物油，植物油或合成油，例如，花生油，豆油，礦物油，芝麻油，等。水，鹽水，葡萄糖水溶液，和二醇類是優選的液體載體，特別是對于可注射溶液來說。合適的藥學載體包括淀粉，纖維素，滑石粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鎂，硬脂酸鈉，一硬脂酸甘油酯，氯化鈉，干燥脫脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇，等。其它合適的藥學載體和它們的制劑描述于E.W.Martin著的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″。
如果期望，要施用的藥物還可以含有少量沒有毒性的輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑等，例如，乙酸鈉，一月桂酸脫水山梨糖酯，三乙醇胺油酸酯等。
盡管活性成分中的很多是必需的，可以利用口服使用常規日劑量給藥方案送遞本發明的趨化因子受體調制劑，可以根據期望的預防程度或折磨減輕的程度調整給藥方案。對于這樣的口服給藥，通過摻入通常使用的賦形劑例如藥物級甘露糖醇，乳糖，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，croscarmellose sodium，葡萄糖，明膠，蔗糖，碳酸鎂等，制備藥學可接受的無毒組合物。這樣的組合物的形式是溶液，懸浮液，可分散片劑，丸劑，膠囊，粉末劑，緩釋制劑等。口服制劑特別適合腸胃失調的治療。通過利用改善全身循環吸收的賦形劑能夠調節一般全身目的的口服生物利用度，例如含有乙酰化氨基酸的制劑。參見，例如，US 5,935,601和US5,629,020。
組合物可以采取膠囊，丸劑或片劑形式，因此組合物可以含有活性成分，稀釋劑例如乳糖，蔗糖，磷酸二鈣，等；崩解劑，例如croscarmellose sodium，淀粉或者其衍生物；潤滑劑，例如硬脂酸鎂等；和粘合劑，例如淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，阿拉伯膠，明膠，纖維素及其衍生物，等。
液體藥學可施用的組合物可以例如通過將本發明的趨化因子受體調制劑(大約0.5％至大約20％)和任意的藥學佐藥溶解，分散等在載體中來制備，所述載體是例如水，鹽水，葡萄糖水溶液，甘油，甘醇，乙醇，防腐劑等，從而形成溶液或懸浮液。如果期望，要施用的藥物組合物還可以含有少量的無毒輔助物質，例如濕潤劑，懸浮劑，乳化劑，或者增溶劑，pH緩沖劑等，例如，乙酸鈉，檸檬酸鈉，環糊精衍生物，聚氧乙烯，一月桂酸或硬脂酸脫水山梨糖醇酯等。制備這樣的劑量形式的操作方法是已知的，或者對于本領域技術人員是顯而易見的；例如，參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania。在任何情況下，要施用的組合物或制劑還含有定量的活性成分，其量足以預防或減輕接受治療的受試者的癥狀。對于對嬰兒口服施用，優選液體制劑(例如糖漿或懸浮液)。
對于在例如碳酸異丙烯酯，植物油或甘油三酯中含有液體，溶液或懸浮液的固體劑量形式，優選制成明膠膠囊。對于液體劑量形式，例如在聚乙二醇中的溶液，可以用足夠量的藥學可接受液體載體例如水稀釋，容易計量給藥。
或者，通過將活性成分溶解于或分散于植物油，甘醇，甘油三酯，二醇異丙烯酯(例如碳酸異丙烯酯)等中，并且將這些溶液或懸浮液在硬或軟明膠殼中制成膠囊，可以制備液體或半固體口服制劑。
在使用本發明的趨化因子受體調制劑治療上述癥狀中，優選腸胃外施用這里描述的活性成分。腸胃外給藥一般特征在于注射，或者皮下，或者肌內或者靜脈內，并且包括真皮內或腹膜內注射以及胸骨內注射或者輸液技術。可注射液可以制備成常規形式，或者是液體溶液或者是懸浮液，適合在注射之前制成溶液或懸浮液的固體形式，作為乳狀液或者生物相容性聚合物基礎的微球體(例如，脂質體，聚乙二醇衍生物，聚(D，C)交酯等)。合適的賦形劑是例如水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等，另外，如果期望，要施用的藥物組合物還可以含有少量沒有毒性的輔助物質，例如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑，增溶劑，蛋白質載體等，例如，乙酸鈉，聚氧乙烯，一月桂酸脫水山梨糖酯，三乙醇胺油酸酯，環糊精，血清白蛋白等。
本發明的趨化因子受體調制劑可以腸胃外施用，例如通過將這樣的分子溶解于合適的溶劑(例如水或鹽水)或者摻入到脂質體制劑中然后分散到可接受的輸液用液體中。本發明多肽的典型的日劑量可以通過一次輸注給藥，或者通過以固定時間間隔的一系列輸注給藥。對于腸胃外給藥，特別適合的有水可溶形式的活性成分水溶液，例如水可溶性鹽形式，或者含有增粘物質的含水注射用懸浮液，所述增粘物質例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇和/或葡聚糖，和，如果期望，穩定劑。活性成分，任選地和賦形劑一起，也可以是凍干物形式，并且可以在腸胃外施用之前通過加入合適的溶劑而制備成溶液。
最近發明的腸胃外給藥的方法使用了緩慢釋放或緩釋體系的埋入法，使得保持恒定水平的劑量。參見，例如，US 3,710,795，US5,714,166和US 5,041,292，這里引作參考。
這樣的腸胃外用組合物中含有的活性成分百分比高度依賴于其具體性質，以及多肽的活性和受試者的需要。但是，可以使用溶液中活性成分是0.01％至10％的百分比，如果組合物是接著稀釋至上述百分比的固體，則更高。優選地，在溶液中組合物含有0.02-8％的活性成分。
施用本發明的趨化因子受體調制劑的另一種方法是利用大丸劑注射和連續輸液。當治療性處理是針對HIV-1感染的預防時，這是特別優選的。
氣霧劑給藥是直接對呼吸道送遞本發明的趨化因子受體調制劑的有效方法。該方法的一些優點是1)它避開了酶促降解作用，腸胃道不好的吸收作用，或者由于肝臟第一次通過作用使得治療物質的損耗；2)施用除此之外由于它們的分子大小，電荷或者對肺外位點的親和力而不能到達呼吸道中的目標點的活性成分；3)它提供了通過肺的肺泡快速吸收到體內；和4)避免其它器官系統接觸活性成分，在接觸可能引起不期望的副作用的情況下這是重要的。因為這些原因，氣霧劑給藥特別適合治療哮喘，肺部局部感染，和肺和呼吸道的其它疾病或癥狀。
有三種類型的藥物吸入裝置，霧化器吸入器，計量劑量吸入器和干粉吸入器。霧化器吸入器產生高速空氣流，其使得趨化因子衍生物(配制成液體形式)象霧一樣噴出，霧載著藥物進入患者呼吸道。計量劑量吸入器一般具有裝有壓縮氣體的配方，并且在開動時，通過壓縮氣體放出計量量的多肽，這樣提供施用一組量的藥物的可靠方法。干粉吸入器施用能夠通過儀器在呼吸時分散在呼吸氣流中的自由流動的粉末形式的多肽。為了獲得自由流動粉末，趨化因子與賦形劑例如乳糖一起配制。計量趨化因子衍生物保存在膠囊形式中，并且每次開動都分配給患者。所有上述方法都可以用于施用本發明。
以脂質體為基礎的藥物制劑也適合本發明的趨化因子受體調制劑。例如，參見，US 5,631,018，US 5,723,147，和5,766,627。相信脂質體的優點與藥物的脂質體包埋得到的組織分布和藥物動力學參數的有利變化相關，并且可以由本領域技術人員對本發明的多肽應用。也可以利用用于注射或口服施用的控制釋放脂質體液體藥物制劑。
對于通過栓劑的全身給藥，傳統的粘合劑和載體包括例如聚乙二醇或甘油三酯，例如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。這樣的栓劑可以從含有大約0.5w/w％至大約10w/w％；優選大約1w/w％至大約2w/w％范圍的活性成分的混合物形成。
如上所述，以及進一步如下面的具體實施例詳細說明的，發現本發明的趨化因子受體調制劑作為天然存在的趨化因子的拮抗劑的用途。特別地，發現具有作為拮抗劑的提高的效力的本發明的趨化因子受體調制劑在分析和治療各種病態例如哮喘，過敏性鼻炎，特應性皮炎，器官移植排異，病毒性疾病，粉瘤/動脈粥樣硬化，類風濕性關節炎和器官移植排異的用途。在設計和篩選它們的同類受體的小分子拮抗劑中也可以使用本發明的趨化因子受體調制劑。例如，對結構差異進行工程處理得到本發明的化合物有利于設計、篩選更合理方案和更好的小分子化合物用作治療涉及趨化因子受體的天然活性的疾病的藥物的協調。
實施例給出下面的制備和實施例使得本領域技術人員更清楚地理解和實施本發明。這些實施例不應該被認為是本發明范圍的限制，而只是詳細說明和代表性例子。
縮寫DIEA二異丙基乙胺DMF N，N-二甲基甲酰胺DNP 2，4-二硝基苯基GuHCl 鹽酸胍HBTUO-(H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-uronium六氟磷酸鹽HF 氟化氫TFA 三氟乙酸Aib 氨基異丁酸Hyp 羥基脯氨酸Tic 1，2，3，4-四氫異喹唑啉-3-COOHIndol 二氫吲哚-2-羧酸P(4，4DiF) 4-二氟-脯氨酸Thz L-噻唑烷-4-羧酸Hop L-高脯氨酸Δpro 3，4-去氫-脯氨酸
F(3，4-DiOH) 3，4二羥基苯基丙氨酸F(3，4-DiOH，pBzl)) pBzl，-3，4二羥基苯基丙氨酸p-Bz 二苯甲酮Cha 環己基丙氨酸BNal 3-(2-萘基)-丙氨酸Chg 環己基-甘氨酸Phg 苯基甘氨酸HoF 高苯丙氨酸F(F)5五氟苯丙氨酸TBuA 叔丁基丙氨酸F(4-Me) 4-甲基苯丙氨酸TL 叔亮氨酸CycP 1-氨基-1-環戊烷羧酸CycH 1-氨基-1-環己烷羧酸Nle 正亮氨酸氨基氧戊烷-RANTE(2-68) AOP-RANTES正-壬酰基-RANTES(2-68) NNY-RANTES實施例1本發明趨化因子受體調制劑的一般合成方法通過固相肽合成制備趨化因子受體調制劑的肽。在來自AppliedBiosystems的常規修飾的430A肽合成儀上進行固相合成，對于一步一步Boc化學鏈延伸，利用原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸鹽活化方法(Schnolzer，等，Int.J.Peptide Protein Res.(1992)40180-193)。在產生硫代酯的樹脂上合成N-末端肽片段。在所研究的位置之前的殘基(從C至N末端延長)和操作延長的肽在0.03mmol規模上接觸之后裂解樹脂。每一次合成循環由用純TFA處理1-2分鐘去除Nα-Boc，1分鐘DMF流動沖洗，與1.0mmol預先活化的Boc-氨基酸在過量DIEA存在下偶聯10-至20-分鐘和第二次DMF流動沖洗組成。在過量DIEA(3mmol)存在下用1mmol HBTU(0.5M，DMF)將Nα-Boc-氨基酸(1.1mmol)預先活化3分鐘。每一次人工偶聯步驟之后，用水合茚三酮分析評價殘留的自由胺(Sarin，等，Anal.Biochem.(1981)117147-157)。在標準-O-CH2苯基乙酰甲基樹脂上合成包括氨基酸的C-末端片段。鏈組裝完全之后，將肽去保護并且通過用5％ p-甲酚作為清除劑用無水HF在0℃下處理1小時而從樹脂上裂解下來。在所有的情況下，咪唑側鏈DNP保護基團殘留在His殘基上，因為DNP-去除過程與C-末端硫代酯基團不相容。但是在連接反應中硫醇會將DNP逐漸去除，得到去保護His。裂解之后用冰冷卻的二乙醚沉淀出兩種肽，溶解于含水乙腈中并且凍干。通過使用線性梯度的緩沖液A(H2O/0.1％三氟乙酸)中的緩沖液B(乙腈/10％ H2O/0.1％三氟乙酸)，用來自Waters的C18-柱子通過RP-HPLC來純化肽，并且在214nm下進行UV檢測。使用Platform II儀器(Micromass，Manchester，England)通過電霧化質譜分析樣品。利用正常化學連接將肽用于連接產生全長趨化因子多肽鏈(Dawson，等，Science(1994)266776-779)；Wilken，等，Chem.Biol.(1999)643-51；和Camarero，等.，CurrentProtocols in Protein Science(1999)18.4.1-18.4.21)。根據標準技術在Cys-SH/(Cys-S)2存在下完成多肽鏈的折疊(Wilken等，Chem.Biol.(1999)643-51)。
實施例2NNY-RANTES，AOP-RANTES，和SDF-1的N-，C-和N-/C-末端類似物的合成和在實施例1中一樣制備RANTES(1-68)和SDF-1β(1-72)的類似物，這里加以描述制備CC和CXC趨化因子拮抗劑的一般方法。特別地，N-末端，C-末端和N-/C-末端修飾的RANTES類似物以對趨化因子化合物CH3-(CH2)7-C(O)-RANTES(2-68)，也稱作正-壬酰基-RANTES(2-68)或″NNY-RANTES″，和趨化因子化合物CH3-(CH2)4-O-N＝CH-CO-RANTES(2-68)，也稱作氨基氧戊烷RANTES或″AOP-RANTES″的修飾為基礎。用于該目的的NNY-RANTES，AOP-RANTES和另外的RANTES衍生物分子描述于WO 99/11666，該專利文獻在此引作參考。利用和對RANTES類似物相同基礎設計方法構建SDF-1的N-，C-和N/C-末端類似物。
對于給出目標趨化因子的N-末端修飾，例如對RANTES的NNY和AOP修飾，如上所述和如WO 99/11666和Wilken等，Chem.Biol.(1999)64351中所述，使用用于連接產生補充的N-末端修飾(例如.，NNY或AOP)的N-末端肽片段樹脂上加工，接著裂解/去保護，純化，并且在正常化學連接中使用沒有保護的N-末端修飾的肽α-硫酯連接C-末端肽片段，生成全長產物，來制備化學變體。根據實施例1所述，合成肽，并且在肽合成期間插入氨基酸取代基，包括氨基酸衍生物。利用和實施例1一樣的正常化學連接產生線性產物，其中對于RANTES類似物，連接是在Lys31-Cys32位點進行的，對于SDF-1類似物，在Asn33-Cys34位點進行。將等摩爾量的肽片段(2-2.5mM)溶解于6MGuHCl，100mM磷酸鹽，pH7.5，1％芐硫醇，和3％苯硫酚。反應通常進行過夜。和上文對于肽片段所述一樣純化和分析得到的多肽產物。對于產生折疊的蛋白質，將純化的NNY-RANTES類似物的多肽鏈(大約0.5-1mg/mL)溶解于含有8mM半胱氨酸，1mM胱氨酸和10mM甲硫氨酸的2M GuHCl，100mM Tris，pH8.0中。輕柔攪拌過夜，如上所述通過RP-HPLC來純化蛋白質溶液。在SDF-1類似物的情況下使用其它折疊條件室溫下在空氣存在下在0.5mg/mL于1M GuHCl，0.1M Tris，pH8.5下氧化SDF-1和Met0-SDF-1。攪拌過夜之后完成折疊。在相同緩沖液中在2M GuHCl存在下氧化SOP-，己酰基-和NNY SDF-1。
對于脂肪酸與給定折疊蛋白質的化學偶聯，包括兩個基本步驟。首先，用氨基氧基基團將脂肪酸官能化。其次，在認為對趨化因子活性無關緊要的蛋白質的羧基-末端區特異性引入反應羰基。為此目的，利用C-末端Lys(Ser)Gly序列延伸來合成目的在于C-末端脂肪酸修飾的趨化因子類似物。這樣，例如，合成在C-末端包含Lys(Ser)Gly序列延伸的NNY-RANTES(2-68)。通過對折疊蛋白質的NaIO4處理產生反應性羰基，這樣使得脂肪酸部分通過穩定的肟鍵定點連接。
對于脂肪酸官能化，在0.5ml的DMF/DCM混合物(1∶1，v∶v)中用等摩爾量的DCC和HOAt活化0.2mmol脂肪酸(十六烷酸酯，油酸酯，花生四烯酸酯，膽酸酯)，并且加給0.25mmolBoc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的0.5ml DMF溶液，并且用N-乙基嗎啉將表觀pH調節至pH.8.0。對于膽甾醇衍生物，將0.2mmol氯甲酸膽甾醇酯溶解于0.5ml DCM，并且加給0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的乙醇化溶液，并且用三乙胺將表觀pH調節至pH9.0。保溫過夜之后，真空下去除揮發物質，并且通過急驟層析或者通過在C4柱上進行制備HPLC分離產物。通過TFA處理去除Boc基團并且通過ESI-MS驗證產物。
對于蛋白質氧化，將目標蛋白質(2mg/mL)溶解于含有6M氯化胍的0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.5，并且加入甲硫氨酸，使得清除劑比蛋白質過量100-倍摩爾。然后加入10-倍過量的高碘酸鈉，并且避光下將溶液溫育10分鐘。通過加入比高碘酸鹽1000-倍摩爾過量的乙二醇終止反應，并且在室溫下進一步溫育溶液15分鐘。然后該溶液對0.1％乙酸透析，最后凍干。例如，ESI-MS幾乎定量證明C-末端側鏈絲氨酸的氧化作用，其中在AOP-RANTES-K(S)G情況下獲得8141.1±0.7Da的質量，相應于減少31Da，生成乙醛酰衍生物，沒有觀察到相應于起始物質量的峰。
在0.1％十二烷基肌氨酸鈉，20mM甲硫氨酸和比蛋白質20-倍過量的官能化脂肪酸存在下，在0.1M乙酸鈉緩沖液，pH5.3中實現脂肪酸與趨化因子的偶聯。在37℃下攪拌16-20小時之后，應用反相HPLC純化脂肪酸的氨基氧基和趨化因子醛之間形成肟鍵的偶聯物，并且通過ESI-MS表征產物。對于所有的類似物，通過分析HPLC幾乎可以定量控制氨基氧基官能化脂肪酸與氧化的蛋白質的偶聯。
實施例3NNY-和AOP-RANTES的N-末端類似物對于N-末端RANTES衍生物，對頭8個氨基酸殘基具有下面的序列-PYSSDTTP-的相應于NNY-RANTES(2-68)或AOP-RANTES(2-68)的頭8個氨基酸殘基的氨基酸N-末端區中的一個或多個進行修飾。這些相應于圖2A-2E給出的68個氨基酸殘基野生型RANTES多肽鏈(即，RANTES(1-68))的氨基酸殘基2-9，因為NNY-RANTES(2-68)中的正-壬酰基取代基和AOP-RANTES(2-68)中的氨基氧基戊烷置換了天然存在的RANTES(1-68)的第一個殘基(Ser)。例如，下面通式化合物″NNYP2X-RANTES(3-68)″代表氨基酸位置2處NNY-RANTES(2-68)中的取代，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的位置2處取代脯氨酸(P)的氨基酸，并且RANTES(3-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余66個氨基酸，以N-至C-末端方向閱讀。舉另外一個例子，通式化合物″NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)″代表氨基酸位置3處NNY-RANTES(268)中的取代，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的位置3處取代酪氨酸(Y)的氨基酸，并且RANTES(4-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余65個氨基酸，以N-至C-末端方向閱讀。對于多取代的NNY-RANTES類似物，通式化合物″NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)″代表在NNY-RANTES(2-68)中在氨基酸位置2，3和9處三處取代的下面的化合物結構式的例子，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的2位取代脯氨酸(P)，在3位取代酪氨酸(Y)，在9位取代脯氨酸(P)的相同或不同的氨基酸，SSDTT相應于NNY-RANTES(2-68)的氨基酸4-8，并且RANTES(10-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余59個氨基酸，以N-至C-末端方向閱讀。下面是制備的NNY-P2X-RANTES(3-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-P2Aib-RANTES(3-68) 1NNY-P2Hyp-RANTES(3-68) 2NNY-P2Tic-RANTES(3-68) 3NNY-P2Indol-RANTES(3-68) 4NNY-P2P(4，4DiF)-RANTES(3-68) 5NNY-P2Thz-RANTES(3-68) 6NNY-P2HoP-RANTES(3-68) 7NNY-P2ΔPro-RANTES(3-68) 8NNY-P2A-RANTES(3-68) 9下面是制備的NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-P-Y3P-RANTES(4-68) 10NNY-P-Y3A-RANTES(4-68) 11NNY-P-Y3L-RANTES(4-68) 12NNY-P-Y3V-RANTES(4-68) 13NNY-P-Y3F(3，4-DiOH)-RANTES(4-68) 14NNY-P-Y3F(3，4-DiOH，pBzl)-RANTES(4-68)15NNY-P-Y3pBz-RANTES(4-68) 16NNY-P-Y3Cha-RANTES(4-68) 17NNY-P-Y3β Nal-RANTES(4-68)18NNY-P-Y3Chg-RNATES(4-68) 19NNY-P-Y3Phg-RANTES(4-68) 20
NNY-P-Y3Hof-RANTES(4-68)21NNY P-Y3F(F)5-RANTES(4-68) 22NNY-P-Y3tbuA-RANTES(4-68) 23NNY-P-Y3F(4-Me)-RANTES(4-68)24NNY-P-Y3tL-RANTES(4-68) 25NNY-P-Y3CycP-RANTES(4-68) 26NNY-P-Y3CycH-RANTES(4-68) 27NNY-P-Y3Nle-RANTES(4-68)28下面是制備的NNY-PY-S4X-RANTES(5-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-PY-S4A-RANTES(5-68) 29NNY-PY-S4tbuA-RANTES(5-68) 30下面是制備的NNY-PYS-S5X-RANTES(6-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-PYS-S5tbuA-RANTES(6-68) 31下面是制備的NNY-PYSS-D6X-RANTES(7-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-PYSS-D6tbuA-RANTES(7-68)32下面是制備的NNY-PYSSD-T7X-RANTES(8-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES(8-68) 33下面是制備的NNY-PYSSDT-T8X-RANTES(9-68)類似物的例子。
化合物序號NNY-PYSSDT-T8tBuA-RANTES(9-68) 34下面是制備的NNY PYSSDTT-P9X-RANTES類似物的例子。
化合物序號
NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES(10-68)35NNY-PYSSDTT-P9Aib-RANTES(10-68)36NNY-PYSSDTT-P9ΔPro-RANTES(10-68) 37NNY-PYSSDTT-P9Thz-RANTES(10-68)38下面是制備的二取代類似物NNY-P2X-Y3X-RANTES(4-68)，和三取代類似物NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)的例子。
化合物序號NNY-P2Hyp-Y3tButA-RANTES(4-68) 39NNY-P2Thz-Y3tButA-RANTES(4-68) 40NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES(4-68) 41NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES(4-68) 42NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 43實施例4NNY-RANTES的N-末端，N-環類似物下面的化合物是為了詳細說明另外的NNY取代的-RANTES類似物，其中修飾N-環(RANTES的殘基12-20)以提高對CCR5的效力而不影響通過CCR1和CCR3的信號傳導。
對于N-末端，N-環RANTES類似物，對NNY-RANTES(2-68)進行N-末端修飾，其中N-環相應于氨基酸12-20。RANTES的N-環具有氨基酸序列-FAYIARPLP-(SEQ ID NO.2)。例如，NNY-RANTES(2-68)中氨基酸位置12處的取代具有化合物通式″NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)″，其中NNY是正-壬酰基，PYSSDTTPCC相應于RANTES(1-68)的氨基酸2-11，F12pBz指氨基酸衍生物在RANTES(1-68)的位置12處取代苯丙氨酸(F)，并且RANTES(13-68)代表RANTES(1-68)的其余氨基酸殘基13-68，自N-向C-末端方向閱讀。
化合物序號NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68) 44NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RANTES(13-68) 45NNY-PYSSDTTPCC-F12F(4-Me)-RANTES(13-68) 46NNY-PYSSDTTPCC-F12(4-F)-RANTES(13-68) 47NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES(14-68)48
NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES(14-68) 49NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES(15-68) 50NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14Cha-RANTES(15-68) 51NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES(16-68) 52NNY-PYSSDTTPCCFAY-I1SS-RANTES(16-68)53NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES(17-68) 54NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES(18-68) 55NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES(18-68) 56NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES(19-68)57NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES(20-68) 58NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19Cha-RANTES(20-68) 59NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES(21-68) 60實施例5NNY-RANTES的N-末端RANTES類似物下面的實施例是為了詳細說明另外的NNY-取代的-RANTES類似物，其中在NNY取代基處使用不同的疏水性脂肪鏈。
化合物序號CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES(2-68) 61Nle-Met-RANTES(1-68) 62化合物序號十二烷酰基-RANTES(3-68) 63月桂酰基-Hyp-RANTES(3-68)64化合物序號十四酰基-RANTES(4-68)65十二酰基-Hyp-RANTES(4-68)66實施例6NNY和AOP-RANTES的C-末端和N/C-末端類似物制備帶有絲氨酸殘基酰化的Lys的ε氨基的具有Lys-Gly C-末端延伸的AOP-和NNY-RANTES。高碘酸鹽氧化絲氨酸延伸之后，這些衍生物偶聯包括熒光團(FITC，NBD，Cy-5和BODIPY-F1)或者脂質的氨基氧酰基官能化化合物。已經證明保留了它們的生物學活性并且導入象CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-O-NH2這樣的脂肪部分的這些C-末端標記的趨化因子提高趨化因子的效力。為了發現最有效的化合物，通過偶聯Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2，接著Boc去除月桂酸根，棕櫚酸根，油酸根，花生酸根，膽酸根，和氯甲酸膽甾醇酯，用氨基氧基將不同的脂肪酸和脂質官能化。這些衍生物的一種或多種偶聯氧化的NNY-RANTES-K(S)G或AOP-RANTES-K(S)G，其中AOP類似物舉例如下化合物序號AOP-RANTES-K(月桂酰基)-G 67其中″(月桂酰基)″是乙醛酰＝AoA-乙二胺月桂酸酯的縮寫，依此類推AOP-RANTES-K(棕櫚酰)-G 68AOP-RANTES-K(二十烷酰)-G 69AOP-RANTES-K(油酰)-G 70AOP-RANTES-K(膽酰)-G 71AOP-RANTES-K(膽甾醇基)-G 72也通過其它策略制備脂質部分的化學變體。通過使脂肪酸與Fmoc-去保護的Boc-肽-Lys-Gly-樹脂連接，然后裂解，純化并且用于化學連接，產生全長多肽，通過C-末端片段樹脂上合成，合成了這樣的化合物。
在設計這些化合物中，使用脂質偶聯有兩個主要的原因。首先，現在有越來越多的證據證明RANTES化合物的抗HIV-1抑制活性與下調受體的能力有關。這意味著，一旦內在化，正常情況下在早期核內體中與受體的再循環相關的配體-受體復合體也應該與漿膜或者某些胞質脂肪酸結合蛋白相互作用。因此，簡單通過相互作用，配體的脂質修飾可以將復合體定向具體的胞內亞區，從而延遲受體的再循環。幾篇與胞內蛋白運輸有關的最新文章支持這樣的觀點酰化作用是提高蛋白質對去污劑抗性膜的親合力的共同機理，并且可能是沒有跨膜的蛋白質的主要定向機理(參見，例如，Melkonian等，J Biol.Chem.(1999)2743910-3917；Zlatkine等，J.Cell Sci.(1997)110673-679；Zhan等，Cancer Immunol.Immunother.(1998)4655-60)。其次，也可以進行修飾來改變化合物的藥物動力學性質。幾篇最近的文章支持該概念(參見，例如，Honeycutt等，Pharm.Res.(1996)131373-1377；Kurtzhals等，J.Pharm.Sci.(1997)861365-1368；Marlcussen等，Diabetologia(1996)39281-288)。
如下面實施例中證明的，活性的提高是令人驚奇和出人意料的，因為修飾是要改變藥物動力學。所預期的結果是活性降低而又希望藥物動力學改進是不能給出可接受的折中方案的。
實施例7SDF-1的N-末端類似物制備下面的N-末端SDF-1(1-72)衍生物來詳細說明制備CXC趨化因子受體調制劑的一般方法。舉例來說，修飾SDF-1的N-末端，產生N-末端帶有脂肪鏈的化合物。根據上文對于RANTES化合物所描述的，制備在N-末端區還包括氨基酸衍生物，和/或在C-末端區有脂肪鏈的化合物。特別地，制備合適的N-末端取代基并且檢測，具體來說包括但不限于Lys，Met-Lys，己酰基-Lys，CH3-(CH2)7-C(O)和CH3-(CH2)4-O-NH-乙醛酰。下面的化合物是一些制備的SDF-1類似物的例子。
化合物序號Lys-SDF-1(2-72) 73Met-Lys-SDF-1(2-72) 74己酰基-Lys-SDF-1(2-72)75NNY-SDF-1(2-72) 76AOP-乙醛酰-SDF-1(2-72)77實施例8篩選分析利用HIV-基礎測試表征針對發現RANTES和SDF-1用途的該特定指征的阻斷功能，對實施例3-7中制備的幾種RANTES和SDF類似物和其它化合物篩選拮抗劑活性。一般來說，化合物通過篩選它們抑制HIV膜-介導的細胞融合的能力的初步篩選。接著對這些化合物中最有希望的化合物測定它們抑制靶細胞系無細胞病毒感染的能力。選擇這些測試，因為根據在SCID小鼠模型中測得細胞融合測試和體外無細胞病毒感染測試是體內潛力的有用指征(Mosier等，J.Virol.(1999)733544-3550)。此外，因為發現NNY-RANTES相對于AOP-RANTES的抗病毒效力的提高是由于除對于CCR5親合力提高之外的因素，對化合物評價在細胞融合測試中的活性，而不是對于CCR5的親合力。
實施例9膜-介導的細胞融合測試使用經工程處理使病毒膜蛋白與攜帶CD4和CCR5并且包含報道基因受體系統的細胞融合的細胞測定給定一組實施例3-7的化合物抑制CCR5-依賴性細胞融合的能力。基本上根據Simmons等(Science(1997)276276-279)所述，使用細胞系HeLa-PSL和HeLa-Env-ADA，進行CCR5-回歸線病毒膜-介導的細胞融合測試，所述兩種細胞系均由M.Alizon(巴黎)實驗室友情提供。簡要地說，將HeLa-PSL細胞接種于96-孔板中(每孔100微升104個細胞)。24小時之后去除培養基并且對每孔加入含有104HeLa-Env-ADA細胞加趨化因子(200微升終體積)。又過24小時之后，用PBS將細胞清洗一次并且溶解于室溫的50微升PBS/0.5％ NP-40中15分鐘。通過加入50微升2XCPRG底物(16mM氯代苯酚紅-p-D-吡喃半乳糖苷；120mM Na2HPO4，80mMNaH2PO4，20mM KCl，20mM MgSO4，和10mM β-巰基乙醇)，接著在室溫下避光溫育1-2小時，對溶胞產物測定對p-半乳糖苷酶的活性。然后在Labsystems微量板讀數器上讀取575nm下的吸收度。根據這些數值，計算各抑制劑濃度下抑制百分率[100×(OD(試驗)-OD(負對照))/OD(正對照)-OD(負對照))]。從融合抑制百分率對抑制劑濃度的圖可以計算各化合物的IC50值。
有統計學意義的是，被測化合物中的大多數表現出相對于野生型RANTES更大的效力。下面的表1給出了選擇的RANTES拮抗劑類似物的結果。
表1細胞融合篩選N-末端修飾的NNY-RANTES化合物序號平均相對效力19 723 740 442 2NNY-RANTES(對照) 18-25N-環修飾的NNY-RANTES化合物序號平均相對效力54914NNY-RANTES(對照) 18-25C-末端修飾的AOP-RANTES化合物序號平均相對效力6845AOP-RANTES(對照)100在表1中，對于平均相對效力，融合測定中IC50的絕對值根據不同天數進行的實驗而不同，但是活性的排列次序保持不變。為了將結果規格化，各項實驗中使用AOP-RANTES作為對照物。這樣，相對于AOP-RANTES表示各項實驗中的IC50，AOP-RANTES給出100的任意值。盡管試驗的化合物中大多數表現出相對于野生型RANTES更大的效力，但是某些化合物例如序號是19，23，40和42的化合物的效力是即使是系列中最低稀釋度下仍然獲得大于50％的抑制作用。
實施例10無細胞病毒感染測試以和膜-介導的細胞融合測試相同的方法進行無細胞病毒感染測試，除了在這種情況下用肝R5-回歸線病毒代替膜細胞系。HEK293-CCR5細胞(7，T.Schwartz，Copenhagen友情提供)接種于24孔板(1.2×105細胞/孔well)。溫育過夜之后，使用12pM[125I]MIP-1-α(Amersham)加0.5ml的結合緩沖液(50mM HEPES，pH7.4，補加了1mM CaCl2，5mM MgCl2，和0.5％(w/v)牛血清白蛋白)中不同量的未標記配體，在4℃下對全部細胞進行競爭結合3小時。溫育之后，在補加有0.5M NaCl的冰冷卻結合緩沖液中將細胞快速洗滌四次。細胞溶解于1毫升的3M乙酸，8M脲和2％NP-40中。使用貝克曼γ4000閃爍計數器對溶解材料計數1分鐘。測定兩次，并且應用Prism軟件從相吻合的單相濃度抑制曲線得出IC50值。表2說明了超過序號是19和23的化合物初步篩選所示的NNY-RANTES的效力的提高。
表2對于從無細胞病毒感染測試篩選化合物的體外感染數據

實施例11與抗-CCR5和抗-CXCR4化合物結合治療下面的實施例詳細說明使用抗-CCR5(例如.，NNY-RANTES)和抗-CXCR4(例如，SDF-1拮抗劑或AMD 3100)結合用于阻斷HIV感染，并且阻斷HIV的R5毒株向X4毒株潛在的轉化的保護作用。使用SCID小鼠模型用于該目的。特別地，根據Mosier，Adv.Immunol.(1996)6379-125；Picchio，等，J Virol.(1997)717124-7127；Picchio，等，J.Virol.(1998)722002-2009；和Offord等，WO 99/11666中描述的方法，對SCID小鼠測定NNY-RANTES和AMD 3100(小有機分子抗-X4試劑)的保護作用，重新注入人外周血白細胞，并且用HIV-1攻擊。根據表X施用NNY-RANTES，以200mg/ml溶液使用AMD 3100。用R5 HIV病毒攻擊，除了單獨使用AMD 3100族。在結合治療中發現沒有避開突變體，實驗自始至終，所有的適當接受處理的小鼠沒有病毒。這表明本發明的N-，C-和N-/C-末端RANTES衍生物可以與抗-X4毒株化合物例如AMD 3100或SDF-1拮抗劑結合使用，例如這里描述的那些，用于阻斷哺乳動物HIV感染。
本說明書中提到的所有的出版物和專利申請在這里引作參考，其引用程度就好象各出版物或專利申請具體地并且各個指明地引作參考一樣。
現在完全描述了本發明，對本領域技術人員來說，不脫離后面的權利要求書的精神或范圍對其進行很多變化和修飾是顯而易見的。
序列表<110>Gryphon Sciences<120>趨化因子受體調制劑，制備和用途<130>03504.271<140><141><150>60/217,683<151>2000-07-12<160>28<170>專利版本2.1<210>1<211>92<212>PRT<213>人<400>1Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr Thr Gln1 5 10 15Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly Ser20 25 30Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys Ala35 40 45Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met Asp Arg50 55 60Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly Thr65 70 75 80Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly85 90<210>2<211>68<212>PRT<213>人<400>2Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser50 55 60Leu Glu Met Ser65<210>3<211>74<212>PRT<213>人<400>3Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70<210>4<211>73<212>PRT<213>人<400>4Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu1 5 10 15Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser20 25 30Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu35 40 45Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met50 55 60Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65 70<210>5<211>76<212>PRT<213>人<400>5Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>人<400>6Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>82<212>PRT<213>人<400>7Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Val Val1 5 10 15Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Arg Thr Ile Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Lys Asn Ser Ile50 55 60Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe Ile Leu Glu Pro Ser Cys65 70 75 80Leu Gly<210>8<211>70<212>PRT<213>人<400>8Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser20 25 30Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser Ala65 70<210>9<211>69<212>PRT<213>人<400>9Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser20 25 30Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr50 55 60Asp Leu Glu Leu Asn65<210>10<211>70<212>PRT<213>人<400>10Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His1 5 10 15Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys20 25 30Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys35 40 45Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser50 55 60Lys Lys Val Lys Asn Met65 70<210>11<211>77<212>PRT<213>人<400>11Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro1 5 10 15Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp20 25 30Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln35 40 45Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg50 55 60Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser65 70 75<210>12<211>74<212>PRT<213>人<400>12Gly Asp Thr Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu1 5 10 15Gly Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr20 25 30Pro Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys35 40 45Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys50 55 60Leu Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg65 70<210>13<211>99<212>PRT<213>人<400>13Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu Pro1 5 10 15Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp20 25 30Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu35 40 45Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe50 55 60Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln65 70 75 80Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr85 90 95Arg Lys Asn<210>14<211>97<212>PRT<213>人<400>14G1n Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu1 5 10 15Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg20 25 30Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg35 40 45Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr50 55 60Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr65 70 75 80Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser85 90 95Gln<210>15<211>74<212>PRT<213>人<400>15Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys1 5 10 15Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp20 25 30Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile35 40 45Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val50 55 60Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn65 70<210>16<211>111<212>PRT<213>人<400>16Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys1 5 10 15Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu20 25 30Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln35 40 45Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met50 55 60Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys65 70 75 80Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser85 90 95Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro100 105 110<210>17<211>69<212>PRT<213>人<400>17Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr1 5 10 15Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr20 25 30Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu50 55 60Asn Lys Leu Ser Gln65<210>18<211>71<212>PRT<213>人<400>18Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys1 5 10 15Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu20 25 30Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala35 40 45Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr50 55 60Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser65 70<210>19<211>127<212>PRT<213>人<400>19Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly1 5 10 15Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser20 25 30Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His35 40 45Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met50 55 60Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn65 70 75 80Met Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser85 90 95Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser100 105 110Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu115 120 125<210>20<211>67<212>PRT<213>人<400>20Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser1 5 10 15His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro20 25 30Ala Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln 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Glu50 55 60Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn65 70<210>26<211>73<212>PRT<213>人<400>26Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly20 25 30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln35 40 45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu50 55 60Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn65 70<210>27<211>73<212>PRT<213>人<400>27Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln1 5 10 15Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly20 25 30Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys35 40 45Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu50 55 60Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn65 70<210>28<211>76<212>PRT<213>人<400>28Gln His His Gly Val Thr Lys Cys Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr1 5 10 15Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala20 25 30Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu35 40 45Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His50 55 60Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly65 70 7權利要求
1.一種包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一種或多種氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈的趨化因子受體調制劑。
2.權利要求1的趨化因子受體調制劑，其中所述趨化因子多肽鏈包括與天然存在的野生型趨化因子的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
3.權利要求2的趨化因子受體調制劑，其中所述天然存在的野生型趨化因子是CC趨化因子。
4.權利要求2的趨化因子受體調制劑，其中所述天然存在的野生型趨化因子是CXC趨化因子。
5.權利要求1的趨化因子受體調制劑，其中所述N-末端包括是所述趨化因子多肽鏈的第一個二硫鍵形成半胱氨酸的N-末端的所述趨化因子多肽鏈的氨基酸。
6.權利要求1的趨化因子受體調制劑，其中所述脂肪鏈是包括5-26個碳原子的烴鏈。
7.權利要求1的趨化因子受體調制劑，其中所述氨基酸衍生物具有式-(N-CnR-CO)-，其中n是1-22，R是氫原子，烷基或芳基，并且其中N和Cn，N和R，或者Cn和R能形成環結構。
8.一種包括在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈的趨化因子受體調制劑。
9.權利要求8的趨化因子受體調制劑，其中所述脂肪鏈包括5-22個碳原子。
10.權利要求9的趨化因子受體調制劑，其中所述脂肪鏈或多元環是脂質。
12.一種包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈的趨化因子受體調制劑。
13.一種含有趨化因子受體調制劑或者其藥學可接受鹽的藥物組合物，其中所述趨化因子受體調制劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物的趨化因子多肽鏈。
14.權利要求13的藥物組合物，其中所述組合物是與一種或多種藥學可接受賦形劑相混合的。
15.一種含有趨化因子受體調制劑或者其藥學可接受鹽的藥物組合物，其中所述趨化因子受體調制劑包括在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈。
16.一種包括權利要求15的趨化因子受體調制劑或者其藥學可接受鹽的藥物組合物。
17.權利要求16的藥物組合物，其中所述組合物是與一種或多種藥學可接受賦形劑相混合的。
18.一種含有趨化因子受體調制劑或者其藥學可接受鹽的藥物組合物，其中所述趨化因子受體調制劑包括在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環的趨化因子多肽鏈。
19.權利要求18的藥物組合物，其中所述組合物是與一種或多種藥學可接受賦形劑相混合的。
20.一種治療通過用趨化因子受體調制劑治療而減輕的哺乳動物疾病癥狀的方法，該方法包括對需要這樣治療的哺乳動物施用治療有效量的趨化因子受體調制劑，其中所述趨化因子受體調制劑包括下面的趨化因子多肽鏈(A)在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，(B)在其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環，或者(C)在其N-末端修飾有脂肪鏈和一個或多個氨基酸衍生物，并且其C-末端修飾有脂肪鏈或多元環。
21.權利要求20的方法，其中所述疾病癥狀是炎癥。
22.權利要求20的方法，其中所述炎癥是哮喘，過敏性鼻炎，特應性皮炎，，粉瘤，動脈粥樣硬化，或類風濕性關節炎。
23.權利要求20的方法，其中所述疾病癥狀是HIV引起的或者與HIV相關。
全文摘要
本發明公開了包括為了調制效力和藥物動力學性質而化學修飾的羧基－末端(C－末端)和/或氨基－末端(N－末端)的趨化因子受體調制劑，其制備方法和用途。通過CC和CXC趨化因子新的N－末端，C－末端和N－/C－末端類似物舉例說明了本發明的化合物和方法。本發明的趨化因子受體調制劑類似物用于治療涉及本發明的類似物所拮抗的天然存在的趨化因子的疾病，例如治療HIV和AIDS相關疾病和治療哮喘，過敏性鼻炎，特應性皮炎，粉瘤/動脈粥樣硬化，器官移植排異，和類風濕性關節炎。
文檔編號C07K19/00GK1441808SQ01812629
公開日2003年9月10日 申請日期2001年7月12日 優先權日2000年7月12日
發明者R·奧福德, H·蓋爾特納, O·哈特利 申請人:格萊風治療公司