專利名稱：槲寄生堿的制法及其在制備治療癌癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗癌藥物的制法及其應用，具體地說是以中草藥為原料提取的生物堿及其在制備治療癌癥的藥物方面的應用。
背景技術：
癌癥是危害人類健康的大敵。我國每年新發癌癥病例約有160萬人，每年死于癌癥的約有130萬人。全國因癌癥而死亡的人數逐年上升。我國為肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌癥高發區，癌癥死亡率居高不下。
目前尚無有效的藥物治愈大多數癌癥患者。化療藥物對癌癥雖有一定療效，但毒副作用大。中成藥對癌癥的療效普遍較低，如參蓮膠囊對肺胃癌的癌灶緩解率為3.5％，療效還不理想。
槲寄生為桑寄生科槲寄生屬植物。我國槲寄生屬分布11種及1變種，藥用部分為干燥帶葉莖枝。槲寄生是一味傳統中藥，其性平，味苦，具有強筋骨、安胎、祛風濕、益血、補肝腎等功能。目前，已有文獻報道歐洲槲寄生和朝鮮槲寄生的提取物具有抗腫瘤活性。國內報道采用稀醋酸浸提法或稀鹽酸浸提法從槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai中提取的總生物堿在50，75mg/kg時對小鼠移植性腫瘤S180、S37、EAC、ARS及L1210白血病均有明顯抑制作用((1)王慶端，劉梅筠，王東陽等，槲寄生總生物堿的抗腫瘤作用中國中藥雜志，1994，19(1)45；(2)胡家會，張永忠，郭善利等，槲寄生總堿抗腫瘤及抗炎作用研究聊城師院學報，2001，14(2)64；(3)陳世偉，李俊峰，胡家會等，槲寄生堿的提取純化及抗腫瘤研究山東中醫藥大學學報，2001，25(5)373)，在50，75mg/kg時對Lewis肺癌的抑瘤率為59.0％和65.2％，并對Lewis肺癌肺轉移有抑制作用(1)。

發明內容
1、發明目的本發明的目的是提供一種高效低毒、抗癌譜廣的抗癌藥物，具體地說是以白果槲寄生、扁枝槲寄生、槲寄生為原料提取的生物堿及其在制備治療肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌的藥物方面的應用。
2、技術方案經資料查閱目前還沒有文獻報道槲寄生堿用于抗肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌等癌癥的治療。本發明從白果槲寄生Viscum album L.var.meridianum Danser、扁枝槲寄生Viscum articulatum Burm.f.、槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai中提取的生物堿(槲寄生堿)，提取的步驟為①將白果槲寄生，或扁枝槲寄生，或槲寄生的帶葉莖枝，經自然風干后粉碎。②用粉碎后的槲寄生粗粉2-5kg加入70％-95％乙醇6～10倍回流提取3～5小時，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至浸膏。③加入1％～2％鹽酸700～1000ml，充分攪拌使生物堿溶解，靜置，傾出上清液，抽濾，濾液置于1000ml分液漏斗，滴加濃氨水調至PH9，使生物堿游離。④加入氯仿150-300ml，振搖萃取，分取氯仿層，上層堿性水液再以氯仿萃取4～8次。⑤合并氯仿液，水洗，用無水硫酸鈉干燥后回收氯仿，靜置，析出結晶即為槲寄生堿。
本發明涉及抗癌藥槲寄生堿在制備治療肝癌的藥物方面的應用。
實驗方法是取接種7天后的肝癌H22腹水，用生理鹽水稀釋成13的懸液備用。將肝癌H22懸液以0.2ml/只的量接種于小鼠右前肢腋部皮下，24小時后將已接種的小鼠隨機分為5組，每組10只，設對照組、5-FU組、槲寄生堿大小劑量組。槲寄生堿組，每天給小鼠灌胃給藥1次；5-FU組為腹腔注射給藥，每天1次，每次0.2ml/20g體重；對照組每天灌胃等量1％CMC-Na液。各組均連續給藥7天。小鼠停藥后1～3天拉頸處死，剝取瘤塊稱重，按“抑瘤率＝(1-T/C)×100％”公式計算抑瘤率。
實驗結果表明當槲寄生堿的用量在60mg/kg-120mg/kg時，對小鼠肝癌細胞的抑瘤率達41.5％～68.9％。
本發明涉及抗癌藥槲寄生堿在制備治療胃癌的藥物方面的應用。
實驗方法是在無菌條件下，取荷瘤傳代鼠，消毒腹部皮膚，用無菌空注射器抽吸腹水，以無菌生理鹽水作1∶2倍的稀釋，取雌性小鼠50只，每只鼠接種0.2ml，接種后次日隨機分為5組，每組10只，按大小3個劑量灌胃給藥，每日1次，連續10d，記錄小鼠生存時間，計算生命延長率，實驗重復3次。
實驗結果表明當槲寄生堿的用量在60mg/kg～120mg/kg時，對小鼠胃癌細胞的抑瘤率達33.6％～71.9％本發明涉及抗癌藥槲寄生堿在制備治療乳腺癌的藥物方面的應用。
實驗方法是采用MTT法測定槲寄生堿對人乳腺癌細胞生長抑制作用。取對數生長期的乳腺癌細胞調整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養24h后棄原培養液，加入含不同濃度槲寄生堿培養液各0.2ml(設0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml3個濃度)，每個濃度設9個復孔(分3次重復)，并設無藥物(含配制藥物的乙醇)培養液和空白對照孔(同時作3個板)。作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標儀570nm處測OD值。抑制率(％)＝(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值×100％。
實驗結果表明隨槲寄生堿濃度的升高，對乳腺癌細胞的抑制率也升高。在0.03125mg/ml以上劑量對乳腺癌細胞生長均有明顯抑制作用。
本發明還涉及抗癌藥槲寄生堿在制備治療食管癌的藥物方面的應用。
實驗方法是采用MTT法測定槲寄生堿對食管癌細胞生長抑制作用。取對數生長期的食管癌細胞調整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養24h后棄原培養液，加入含不同濃度槲寄生堿培養液各0.2ml(設0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.03125mg/ml3個濃度)，每個濃度設9個復孔(分3次重復)，并設無藥物(含配制藥物的乙醇)培養液和空白對照孔(同時作3個板)。作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標儀570nm處測OD值。抑制率(％)＝(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值×100％。
實驗結果表明，隨槲寄生堿濃度的升高，對食管癌細胞的抑制率也升高，在0.03125mg/ml以上劑量對食管癌細胞生長均有明顯抑制作用。
3、有益效果本發明藥物的-個重要特點是抗癌活性高，抗癌譜廣，毒性低。
本發明的藥物經抗癌藥理研究和動物試驗的結果表明，有如下優點①癌活性高。用量在60mg/kg～120mg/kg時，對小鼠肝癌H22的抑瘤率達41.5％～68.9％，對小鼠移植胃癌的抑瘤率達33.6％～71.9％。
②抗癌譜廣。對肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌均有明顯的抑制作用。
③毒性低。在動物體內抗癌實驗中，未發現其有明顯的毒副反應。
④藥物原料來源豐富，提取工藝簡單。
具體實施例方式實施例1白果槲寄生的帶葉莖枝，經自然風干后粉碎。粉碎后的槲寄生粗粉5kg用95％乙醇10倍回流提取5小時，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至浸膏。加入2％鹽酸1000ml，充分攪拌使生物堿溶解，靜置，傾出上清液，抽濾，濾液置于1000ml分液漏斗，滴加濃氨水調至PH9，使生物堿游離。加入氯仿300ml，振搖萃取，分取氯仿層，上層堿性水液再以氯仿萃取8次。合并氯仿液，水洗，用無水硫酸鈉干燥后回收氯仿，靜置，析出結晶即為槲寄生堿。
實施例2白果槲寄生的帶葉莖枝，經自然風干后粉碎。粉碎后的槲寄生粗粉2kg用70％乙醇6倍回流提取3小時，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至浸膏。加入1％鹽酸700ml，充分攪拌使生物堿溶解，靜置，傾出上清液，抽濾，濾液置于1000ml分液漏斗，滴加濃氨水調至PH9，使生物堿游離。加入氯仿150ml，振搖萃取，分取氯仿層，上層堿性水液再以氯仿萃取4次。合并氯仿液，水洗，用無水硫酸鈉干燥后回收氯仿，靜置，析出結晶即為槲寄生堿。。
實施例3
以扁枝槲寄生的帶葉莖枝為原料，提取方法和步驟與實施例1相同。
實施例4以槲寄生的帶葉莖枝為原料，提取方法和步驟與實施例2相同。
實施例5槲寄生堿對小鼠肝癌H22的抑制作用。
1、實驗材料瘤株肝癌H22，上海動物研究所提供。實驗動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18g～22g，南京中醫藥大學實驗動物中心提供。對照藥5-氟尿嘧啶(5-FU)，批號010104，上海旭東海普藥業有限公司出品。
2、實驗方法取接種7天后的肝癌H22腹水，用生理鹽水稀釋成1∶3的懸液備用。將肝癌H22懸液以0.2ml/只的量接種于小鼠右前肢腋部皮下，24小時后將已接種的小鼠隨機分為5組，每組10只，設對照組、5-FU組、槲寄生堿大小劑量組。槲寄生堿組，每天給小鼠灌胃給藥1次；5-FU組為腹腔注射給藥，每天1次，每次0.2ml/20g體重；對照組每天灌胃等量1％CMC-Na液。各組均連續給藥7天。小鼠停藥后1～3天拉頸處死，剝取瘤塊稱重，按“抑瘤率＝(1-T/C)×100％”公式計算抑瘤率。
3、實驗結果見表1。
表1 槲寄生堿對小鼠肝癌H22瘤體生長的影響劑量動物數 動物體重(g) 瘤體重(g) 抑瘤率組別(mg/kg×(開始/結 (開始/結束) (X±SD) (％)d) 束)對照組 10/10 19.6/26.11.29±0.335-FU 20×7 10/9 19.9/21.70.38±0.29**70.54槲寄生堿 120×7 10/10 20.0/21.60.35±0.42**72.8790×7 10/10 20.4/26.80.49±0.31**62.0260×7 10/10 20.7/26.20.73±0.36**43.41對照組 10/10 19.5/26.91.30±0.415-FU 20×7 10/10 20.3/21.60.41±0.23**68.46槲寄生堿 120×7 10/9 20.0/26.80.34±0.36**73.8590×7 10/10 19.9/27.10.51±0.33**60.7760×7 10/10 20.1/26.50.76±0.33* 41.54注*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實驗中對照組用藥為5-氟尿嘧啶，其毒副作用有骨髓抑制；胃腸道反應；神經系統損害；肝腎功能損害。
實施例6槲寄生堿對小鼠移植胃癌的抑制作用。
1、實驗材料實驗動物昆明種小鼠，雌雄各半，體重18g～22g，南京中醫藥大學實驗動物中心提供。對照藥環磷酰胺，由上海華聯制藥有限公司生產，批號010304。瘤株胃癌瘤株購自省腫瘤醫院腫瘤研究所。
2、實驗方法在無菌條件下，取荷瘤傳代鼠，消毒腹部皮膚，用無菌空注射器抽吸腹水，以無菌生理鹽水作1∶2倍的稀釋，取雌性小鼠50只，每只鼠接種0.2ml，接種后次日隨機分為5組，每組10只，按大小3個劑量灌胃給藥，每日1次，連續10d，記錄小鼠生存時間，計算生命延長率，實驗重復3次。
3、實驗結果見表2表2槲寄生堿對小鼠移植胃癌的抑制作用(X土S)組別 劑量 n 生存時間 生命延長率(mg/kg) (d) ％荷瘤對照組 1011.2±2.90環磷酰胺 501015.9±3.01**41.96槲寄生堿 120 1018.9±2.57**68.75901017.0±2.23**51.79601015.4±2.16* 37.50荷瘤對照組 1010.7±2.10環磷酰胺 501016.3±2.90**52.34槲寄生堿 120 1018.4±2.65**71.96901016.6±2.47**55.14601014.3±2.83* 33.64荷瘤對照組 1011.8±1.90環磷酰胺 501015.9±2.57* 34.75槲寄生堿 120 1018.3±2.80**55.08901016.7±2.07**41.52601014.8±2.28 25.42注*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實驗中對照組用藥為環磷酰胺，其毒副作用有骨髓抑制；胃腸道反應；出血性膀胱炎；肝臟損傷。
實施例7槲寄生堿對人乳腺癌細胞的抑制作用。
1、實驗材料瘤株人乳腺癌MCF-7細胞株購自省腫瘤醫院腫瘤研究所。RPMI1640培養液(GIBCO公司產品)，內含10％小牛血清，L-谷氨酰胺2nM，青霉素100IU/ml和鏈霉素100ug/ml。人乳腺癌細胞培養于RPMI1640培養液中，培育在37℃、5％CO2培養箱內。化合物是從槲寄生中提取的生物堿。
2、實驗方法采用MTT法測定槲寄生堿對乳腺癌細胞生長抑制作用。取對數生長期的乳腺癌細胞調整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養24h后棄原培養液，加入含不同濃度槲寄生堿培養液各0.2ml(設3個濃度)，每個濃度設9個復孔(分3次重復)，并設無藥物(含配制藥物的乙醇)培養液和空白對照孔(同時作3個板)。
作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標儀570nm處測OD值。抑制率(％)＝(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值×100％。
3、實驗結果結果如表3顯示，隨槲寄生堿濃度的升高，對乳腺癌細胞的抑制率也升高。在0.03125mg/ml以上劑量對乳腺癌細胞生長均有明顯抑制作用。
表3槲寄生堿對乳腺癌細胞生長抑制作用(n＝9)藥物 濃度(mg/ml)OD值(A±S)抑制率(％)0 0.346±0.02100.0槲寄生堿 0.125 0.103±0.017**70.230.06250.152±0.015**56.070.03125 0.198±0.020*42.77注*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較實施例8槲寄生堿對食管癌細胞的抑制作用。
1、實驗材料食管癌細胞株(Eca-109)由南京中醫藥大學微生物教研室提供。細胞培養于199培養液中，內加10％小牛血清，培育在37℃、5％CO2培養箱內。化合物是從槲寄生中提取的生物堿。
2、實驗方法采用MTT法測定槲寄生堿對食管癌細胞生長抑制作用。取對數生長期的食管癌細胞調整至1×105/ml，0.2ml接種于96孔板上，置37℃、5％CO2培養24h后棄原培養液，加入含不同濃度槲寄生堿培養液各0.2ml(設3個濃度)，每個濃度設9個復孔(分3次重復)，并設無藥物(含配制藥物的乙醇)培養液和空白對照孔(同時作3個板)。
作用24h后傾去上清液，各孔加入MTT0.1ml，37℃4h后吸去上清液，加入DMSO0.1ml于各孔，30min后上酶標儀570nm處測OD值。抑制率(％)＝(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值×100％。
3、實驗結果結果如表4顯示，隨槲寄生堿濃度的升高，對食管癌細胞的抑制率也升高，在0.03125mg/ml以上劑量對食管癌細胞生長均有明顯抑制作用。
表4槲寄生堿對食管癌細胞生長的抑制作用(n＝9)藥物 濃度(mg/ml) OD值(A±S) 抑制率(％)0 0.349±0.016 0.0槲寄生堿 0.125 0.115±0.019**67.050.0625 0.187±0.012**46.420.031250.210±0.011*39.83注*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較
權利要求
1.一種抗癌藥物槲寄生堿的制備方法，其特征是制備步驟為①將白果槲寄生或扁枝槲寄生或槲寄生的帶葉莖枝，經自然風干后粉碎；②在粉碎后的槲寄生粗粉中加入乙醇回流提取減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至浸膏；③加入鹽酸，充分攪拌使生物堿溶解，靜置，傾出上清液，抽濾，將濾液置于分液漏斗中，滴加濃氨水，使生物堿游離；④加入氯仿振搖萃取，分取氯仿層，上層堿性水溶液再以氯仿萃取；⑤將氯仿液、水洗、用無水硫酸鈉干燥回收氯仿，靜置，析出的結晶即為槲寄生堿。
2.根據權利要求1所述的槲寄生堿的制備方法，其特征是在②中的槲寄生粗粉用量為2-5kg，乙醇濃度為70％-95％，用量是槲寄生粗粉的6-10倍，回流提取3-5小時。
3.根據權利要求1所述的槲寄生堿的制備方法，其特征是在③中鹽酸的濃度為1％-2％，用量為700-1000ml，滴加濃氨水調至PH9。
4.根據權利要求1所述的槲寄生堿的制備方法，其特征是在④中加入氯仿150-300ml，萃取4-8次。
5.抗癌藥槲寄生堿在制備治療肝癌的藥物方面的應用。
6.抗癌藥槲寄生堿在制備治療胃癌的藥物方面的應用。
7.抗癌藥槲寄生堿在制備治療乳腺癌的藥物方面的應用。
8.抗癌藥槲寄生堿在制備治療食管癌的藥物方面的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗癌藥物，它是以白果槲寄生或扁枝槲寄生或槲寄生為原料提取的生物堿(槲寄生堿)，提取方法步驟是將原料風干粉碎加入乙醇回流提取，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至浸膏，再加入鹽酸并攪拌使生物堿溶解、靜置、浸出上清液、抽濾，再滴加濃氨水使生物堿游離，加入氯仿萃取，將氯仿液水洗，用無水硫酸鈉干燥后回收氯仿，靜置，析出的結晶即為槲寄生堿。該藥物對肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌有顯著的抑制作用，具有抗癌活性高、抗癌譜廣、毒性低等優點。
文檔編號A61K31/7048GK1417208SQ0214840
公開日2003年5月14日 申請日期2002年12月2日 優先權日2002年12月2日
發明者章永紅, 彭海燕 申請人:南京中醫藥大學