本發(fa)明血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制(zhi)肽的(de)提取(qu)技術(shu)領域，特別涉及(ji)一(yi)種應用固定(ding)化(hua)(hua)血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)對具有(you)血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制(zhi)活性的(de)原(yuan)料或其酶(mei)解(jie)液中血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制(zhi)肽的(de)分離純化(hua)(hua)。
背景技術：
高(gao)血(xue)壓(ya)(ya)會(hui)改變和(he)(he)損壞(huai)大腦(nao)、心(xin)(xin)臟(zang)、血(xue)管、腎(shen)臟(zang)以(yi)及(ji)眼底的結(jie)構(gou)和(he)(he)功(gong)能(neng)，引(yin)起這些器官(guan)的并發(fa)疾(ji)病(bing)(bing)從而導(dao)致(zhi)(zhi)功(gong)能(neng)的衰竭。高(gao)血(xue)壓(ya)(ya)導(dao)致(zhi)(zhi)的以(yi)下幾(ji)種(zhong)并發(fa)癥：冠心(xin)(xin)病(bing)(bing)、腦(nao)血(xue)管病(bing)(bing)、高(gao)血(xue)壓(ya)(ya)心(xin)(xin)腦(nao)疾(ji)病(bing)(bing)、慢性腎(shen)功(gong)能(neng)衰竭和(he)(he)動(dong)脈粥樣(yang)硬化等。目前的降血(xue)壓(ya)(ya)藥物主要有利(li)尿藥、β受(shou)體阻(zu)滯劑(ji)、鈣通道阻(zu)滯劑(ji)、血(xue)管緊(jin)張(zhang)素轉(zhuan)化酶(ACE)抑制(zhi)劑(ji)和(he)(he)血(xue)管緊(jin)張(zhang)素Ⅱ受(shou)體阻(zu)滯劑(ji)。
血(xue)管緊張素(su)轉(zhuan)換酶(mei)(mei)(ACE)是(shi)(shi)一種存在于肺(fei)、腎、腦、眼球(qiu)、小(xiao)腸(chang)、胎(tai)盤等不同組織的(de)多功(gong)能二(er)肽(tai)羧基肽(tai)酶(mei)(mei)。在人體中，血(xue)壓的(de)調(diao)節(jie)主要(yao)是(shi)(shi)受(shou)到(dao)腎素(su)－血(xue)管緊張素(su)系(xi)統(Renin-Angiotensin System,RAS)和(he)激肽(tai)釋(shi)放酶(mei)(mei)－激肽(tai)系(xi)統(Kallikrein-Kinin System，KKS)的(de)控制，當其(qi)失衡時將會引起人體血(xue)壓的(de)異常，而(er)ACE又是(shi)(shi)這兩(liang)個系(xi)統的(de)關鍵酶(mei)(mei)。
目前(qian)，治療(liao)高(gao)血壓的(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)多是人工合(he)成的(de)(de)(de)ACE抑制(zhi)(zhi)肽(tai)，但是由(you)于(yu)其具有明顯的(de)(de)(de)副作用(yong)，因此開(kai)發(fa)無副作用(yong)的(de)(de)(de)天然(ran)的(de)(de)(de)健康的(de)(de)(de)ACE抑制(zhi)(zhi)肽(tai)成為時下研(yan)究的(de)(de)(de)熱(re)點。
目前，常用超濾，凝膠層析、離(li)(li)子交(jiao)換層析、反(fan)相高(gao)效液相色譜以及(ji)親(qin)和(he)層析等方(fang)法分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)血管(guan)緊張素轉化(hua)(hua)酶(mei)抑(yi)制肽(tai)(tai)(ACEIP)。其中親(qin)和(he)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)法分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)蛋白肽(tai)(tai)是非常高(gao)效快捷(jie)的方(fang)法，而應(ying)用固(gu)定化(hua)(hua)酶(mei)技術親(qin)和(he)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)蛋白的方(fang)法也迅速(su)發展。應(ying)用固(gu)定化(hua)(hua)酶(mei)親(qin)和(he)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)方(fang)法的載體(ti)不僅可以達到快速(su)分(fen)(fen)(fen)離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)蛋白肽(tai)(tai)的目的，同(tong)時可以降低(di)成本，且對環境友(you)好。
國內外對血管緊張素轉化酶的固定化研究的報導，多采用殼聚糖、瓊脂糖微球、甲殼糖為固定化載體。將ACE固定到SBA-15上，制備SBA-15未有報道。SBA-15分子篩是采用三嵌段共聚物為模板劑于酸性合成體系中制備出來的介孔材料，孔徑尺寸為4.6～30nm，孔體積可達0.85cm3/g，是目前孔徑最大的分子篩材料。SBA-15介孔分子篩具有孔徑可調、孔壁厚和水熱穩定性高的特點。田志茗等采用無溶劑法將ZnO,(NH4)2SO4與煅燒的主體材料SBA-15分子篩進行人工研磨混合后焙燒，制備了Zn-SO42-/SBA-15改(gai)性介(jie)孔分子篩(shai)。
技術實現要素：
本(ben)發明的目的在于應用固定化(hua)血(xue)管(guan)(guan)緊(jin)(jin)張素轉化(hua)酶(ACE)對血(xue)管(guan)(guan)緊(jin)(jin)張素轉化(hua)酶抑制(zhi)肽(tai)進行純化(hua)分離，制(zhi)備高純度、無副作用的、天然健(jian)康的血(xue)管(guan)(guan)緊(jin)(jin)張素轉化(hua)酶抑制(zhi)肽(tai)。
為達(da)到上述目的(de)，本(ben)發明提(ti)供了一種血管緊(jin)張素轉(zhuan)化酶抑制肽的(de)提(ti)取方法，具體步(bu)驟(zou)為：
S1、取酶解液(ye)(ye)凍干粉，溶于pH為(wei)8.3、0.1mol/L硼(peng)酸鹽緩沖溶液(ye)(ye)，制成濃度(du)為(wei)20～100g/L的酶解液(ye)(ye)溶液(ye)(ye)；
所(suo)述酶(mei)解(jie)(jie)液(ye)凍干(gan)(gan)粉為(wei)具有血管緊張素轉化酶(mei)抑制(zhi)活性的原料經蛋白酶(mei)水解(jie)(jie)制(zhi)得的酶(mei)解(jie)(jie)液(ye)，經超濾(lv)分(fen)級(ji)、凍干(gan)(gan)制(zhi)得；優選水泡(pao)蛾螺酶(mei)解(jie)(jie)液(ye)凍干(gan)(gan)粉；
所述(shu)硼酸鹽(yan)緩(huan)沖溶液中含有(you)濃度為0.1～0.3mol/L的(de)NaCl；
S2、取固(gu)(gu)定化(hua)血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)素轉化(hua)酶(mei)與步驟S1制得的(de)(de)酶(mei)解液(ye)(ye)(ye)溶液(ye)(ye)(ye)按質量體積比1:10～20(g/mL)的(de)(de)比例(li)混合(he)，30℃恒溫水(shui)浴(yu)震蕩50～120min，抽濾、采用(yong)pH為8.3的(de)(de)0.1mol/L硼酸(suan)鹽緩(huan)沖(chong)溶液(ye)(ye)(ye)沖(chong)洗干凈，收集固(gu)(gu)相，得到吸附有血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)素轉化(hua)酶(mei)抑制肽的(de)(de)固(gu)(gu)定化(hua)血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)素轉化(hua)酶(mei)；
S3、將步(bu)驟S3制得(de)的吸(xi)附有血管(guan)(guan)緊(jin)張素轉化(hua)酶(mei)抑(yi)制肽的固(gu)定化(hua)血管(guan)(guan)緊(jin)張素轉化(hua)酶(mei)加(jia)入到(dao)pH為7、濃度為2mol/L的NaCl溶(rong)液(ye)中，30℃水浴30～120min，洗脫(tuo)血管(guan)(guan)緊(jin)張素轉化(hua)酶(mei)吸(xi)附的抑(yi)制肽，收集洗脫(tuo)液(ye)，凍干，獲(huo)得(de)血管(guan)(guan)緊(jin)張素轉化(hua)酶(mei)抑(yi)制肽。
優選方式(shi)下，步驟S1所述具有血管緊張(zhang)素轉化酶抑制活性的(de)原料經(jing)蛋白酶水解制得(de)的(de)酶解液的(de)具體制備過程為：
取具有血管緊張素轉化(hua)酶(mei)抑制(zhi)活性的(de)原(yuan)料凍(dong)(dong)干(gan)制(zhi)得凍(dong)(dong)干(gan)粉，將(jiang)所述(shu)凍(dong)(dong)干(gan)粉與水(shui)按1:10～20(g/mL)的(de)質量體(ti)積比混合均勻，在45℃水(shui)浴(yu)中預熱5～15min；
調節(jie)溶(rong)(rong)液(ye)pH至7.0，加(jia)入中(zhong)性蛋白酶，加(jia)酶量為(wei)2500U/g，開始反應(ying)(ying)，反應(ying)(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)通過(guo)滴(di)加(jia)標準(zhun)堿溶(rong)(rong)液(ye)或標準(zhun)酸溶(rong)(rong)液(ye)，維持反應(ying)(ying)液(ye)pH為(wei)7.0不變，水(shui)解(jie)2～3h后，沸水(shui)浴滅酶10～20min，冷(leng)卻；在4℃、10000rpm條件(jian)下(xia)，離心20～30min，取上(shang)清液(ye)，得到酶解(jie)液(ye)。
所述具有血(xue)管緊張素轉(zhuan)化(hua)酶抑制活(huo)性(xing)的原料優選水泡蛾螺(luo)。
進一步(bu)優化(hua)，步(bu)驟S2所述固(gu)定(ding)化(hua)血管緊張素轉化(hua)酶為(wei)(wei)SBA-15固(gu)定(ding)化(hua)血管緊張素轉化(hua)酶；具體(ti)制備方法為(wei)(wei)：
取介孔分子篩SBA-15與血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)素(su)(su)轉(zhuan)化(hua)酶(mei)溶液按質(zhi)量體積(ji)比1:5～20(g/mL)的(de)(de)(de)比例(li)混合，45～50℃，在(zai)水浴(yu)鍋中水浴(yu)震(zhen)蕩(dang)30～40min，至反(fan)(fan)應液中的(de)(de)(de)蛋白含量不變，反(fan)(fan)應結(jie)束；抽(chou)濾(lv)、清洗、除去未吸附(fu)結(jie)合的(de)(de)(de)血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)素(su)(su)轉(zhuan)化(hua)酶(mei)，得到SBA-15固定化(hua)血管(guan)緊(jin)(jin)張(zhang)(zhang)素(su)(su)轉(zhuan)化(hua)酶(mei)；
所述血(xue)管緊張(zhang)素轉(zhuan)化(hua)酶溶(rong)液采用(yong)7.8～9.3硼(peng)酸鹽緩沖(chong)溶(rong)液配置，酶活(huo)為0.17U/mL。
最有方式下，所述介孔分子篩SBA-15為通過直接或間接吸附螯合的方式制得的螯合有Zn2+的SBA-15分子(zi)篩；
所述直接螯合的具體操作為(wei)：
將介孔分子篩SBA-15與濃度為0.05mol/L的ZnSO4水溶液按質量體積比1:10g/mL的比例混合，30～40℃水浴震蕩45～65min，獲得直接螯合Zn2+的SBA-15分子篩(shai)；
所述間接螯合(he)的具體操(cao)作為(wei)：
將介孔分子(zi)篩SBA-15加入到無(wu)水(shui)乙(yi)(yi)醇中(zhong)，向所述(shu)無(wu)水(shui)乙(yi)(yi)醇中(zhong)加入3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)，30℃水(shui)浴震蕩10～20h，反(fan)應結束后抽濾，收集固體物質(zhi)，洗凈；
所述(shu)介孔分子篩SBA-15與無(wu)水乙醇(chun)、3-(異丁(ding)烯酰(xian)氧)丙基三甲氧基硅烷的(de)質量體(ti)積比為1:350～400:20～30(g/mL/mL)；
連(lian)接亞氨(an)基(ji)二乙酸(IDA)，將(jiang)所得(de)固體(ti)物質與濃度為0.6～0.8mol/L的(de)亞氨(an)基(ji)二乙酸溶液按質量體(ti)積比(bi)1:10(g/mL)的(de)比(bi)例混(hun)合，30～40℃水浴震蕩反(fan)應，反(fan)應結束后抽(chou)濾，再(zai)次收集固體(ti)物質；
將再次收集的固體物質與濃度為0.05mol/L的ZnSO4溶液按質量體積比1:10(g/mL)的比例混合，30～40℃水浴震蕩60～90min，獲得間接螯合Zn2+的SBA-15分子篩。
本發明(ming)的(de)上述過程中多用(yong)凍(dong)干(gan)粉作為(wei)實驗材料，一是(shi)凍(dong)干(gan)粉可以方便配置成需要濃度(du)的(de)溶(rong)液，二是(shi)凍(dong)干(gan)粉存儲方便且對在(zai)固體狀態(tai)下較液態(tai)下樣(yang)品的(de)活性(xing)更穩定。
采(cai)用上述方(fang)案后，本發明與已有技(ji)術相比具有以下優點：
1、本發明基于親和(he)原理，將(jiang)固定化(hua)(hua)血管緊張(zhang)素轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)應(ying)用于血管緊張(zhang)素轉(zhuan)化(hua)(hua)酶(mei)抑制肽(tai)(ACEIP)的提(ti)(ti)取分離(li)(li)純化(hua)(hua)，為ACEIP的分離(li)(li)純化(hua)(hua)提(ti)(ti)供了優(you)良(liang)載體及方法(fa)。
2、本(ben)發明固(gu)定(ding)(ding)化(hua)(hua)血(xue)管(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)活性高、穩定(ding)(ding)性好，用于分離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)相(xiang)應的血(xue)管(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)抑制肽具有極好效果(guo)，優選采用的Zn-SBA-15固(gu)定(ding)(ding)化(hua)(hua)血(xue)管(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)，固(gu)定(ding)(ding)化(hua)(hua)過(guo)程簡單(dan)，且產品(pin)穩定(ding)(ding)性更好；通過(guo)固(gu)定(ding)(ding)化(hua)(hua)血(xue)管(guan)緊(jin)張(zhang)素(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)對酶(mei)解(jie)液進行ACEIP的分離(li)(li)純(chun)化(hua)(hua)相(xiang)比于單(dan)純(chun)的游離(li)(li)酶(mei)可以達(da)到更好的分離(li)(li)效果(guo)。
3、本發明適用(yong)(yong)于各(ge)種(zhong)具有血(xue)管緊(jin)(jin)張素轉化(hua)酶(mei)抑制活(huo)性的原料，優(you)選水泡蛾(e)螺，原料天(tian)(tian)然健康、制備(bei)的血(xue)管緊(jin)(jin)張素轉化(hua)酶(mei)抑制肽(tai)純度高、天(tian)(tian)然健康，適用(yong)(yong)范圍(wei)廣(guang)。本發明是(shi)首次從水泡蛾(e)螺中分離純化(hua)ACEIP，為水泡蛾(e)螺的綜合利用(yong)(yong)提供(gong)了新的途徑。
4、游離ACE在使(shi)用(yong)(yong)過程(cheng)中容易變性失活，給使(shi)用(yong)(yong)、保存(cun)帶來很大困難(nan)，本發明采用(yong)(yong)固(gu)定化酶(mei)(mei)不僅(jin)能(neng)實現酶(mei)(mei)的回(hui)收(shou)利用(yong)(yong)，還可以提高固(gu)定化酶(mei)(mei)的穩定性。
具體實施方式
實施例1
1)一種(zhong)介孔分子篩SBA-15載(zai)體的(de)制備，具(ju)體制備方法過程如下(xia)：
介孔分子篩SBA-15載體的制備：取1g聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物(P123)溶解于50mL1.6mol/L鹽酸溶液中30℃水浴攪拌3h，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)5mL，并在40℃水浴持續攪拌20h；隨后將反應物轉移至反應釜中，放入烘箱110℃靜置條件下反應24h；最后收集固體產物，水洗抽濾干凈后放入烘箱80℃放置12h，取出后放入馬弗爐550℃燒8h，得介孔分子篩SBA-15；然后取0.5g SBA-15并以質量體積為SBA-15:ZnSO4(0.05mol/L的ZnSO4溶液)＝1:10加入到ZnSO4溶液，35℃恒溫水浴震蕩鍋震蕩反應50min；50min后取出用大量的水通過抽濾的方式將微球表面的Zn2+洗凈。
2)血(xue)管緊張素轉化(hua)酶在上步制(zhi)備Zn-SBA-15載體上的固(gu)定化(hua)
稱(cheng)取1)步制(zhi)備的(de)(de)Zn-SBA-15載(zai)體(ti)0.5g加入10mL的(de)(de)血管(guan)緊張(zhang)素轉化(hua)酶(mei)(酶(mei)活為0.17U/mL，用pH 8.3的(de)(de)0.1mol/L硼酸鹽緩沖(chong)溶液(ye)配置而成)，50℃，恒溫水浴(yu)鍋(guo)中(zhong)水浴(yu)震(zhen)蕩(dang)30min。反應結(jie)束后抽(chou)濾洗(xi)凈未吸(xi)附(fu)結(jie)合的(de)(de)酶(mei)，從而獲得固定(ding)化(hua)血管(guan)緊張(zhang)素轉化(hua)酶(mei)，酶(mei)活為0.2372U/g。
3)稱取(qu)100g水泡(pao)蛾(e)螺凍(dong)干(gan)粉以1：10(g/mL)的(de)(de)(de)(de)(de)比例加(jia)(jia)入去離子水中(zhong)，在一定溫(wen)度(du)水浴(yu)中(zhong)預(yu)熱10min，調節pH為(wei)中(zhong)性蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)適pH7.0，加(jia)(jia)入中(zhong)性蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)加(jia)(jia)酶(mei)(mei)(mei)(mei)量為(wei)2500U/g后(hou)開始反(fan)應(ying)，反(fan)應(ying)過程中(zhong)通過滴加(jia)(jia)標準(zhun)堿(jian)溶液(ye)(ye)(ye)(ye)或(huo)酸(suan)溶液(ye)(ye)(ye)(ye)，維(wei)持初始pH值7.0，水解(jie)2h后(hou)，沸水浴(yu)滅酶(mei)(mei)(mei)(mei)15min，4℃，10000rpm，冷凍(dong)離心20min，取(qu)上清液(ye)(ye)(ye)(ye)，冷凍(dong)干(gan)燥，得(de)(de)到(dao)水泡(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)蛋(dan)白(bai)水解(jie)產物。獲得(de)(de)水泡(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)凍(dong)干(gan)粉。取(qu)制(zhi)得(de)(de)的(de)(de)(de)(de)(de)水泡(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)凍(dong)干(gan)粉溶于(yu)含0.2mol/L NaCl的(de)(de)(de)(de)(de)pH8.3的(de)(de)(de)(de)(de)0.1M的(de)(de)(de)(de)(de)硼酸(suan)鹽緩(huan)沖溶液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)配成(cheng)50g/L濃度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)水泡(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)。取(qu)上述(shu)制(zhi)備的(de)(de)(de)(de)(de)Zn-SBA-15固定化(hua)(hua)血管(guan)緊張素(su)(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)，按質量體積比1:20(g/mL)加(jia)(jia)入本步前(qian)述(shu)所配置的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)，在30℃恒(heng)溫(wen)震蕩水浴(yu)鍋中(zhong)水浴(yu)震蕩60min，然(ran)后(hou)將吸(xi)附血管(guan)緊張素(su)(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)肽的(de)(de)(de)(de)(de)Zn-SBA-15固定化(hua)(hua)ACE從溶液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)用pH8.3的(de)(de)(de)(de)(de)0.1mol/L硼酸(suan)鹽緩(huan)沖溶液(ye)(ye)(ye)(ye)抽濾洗凈，然(ran)后(hou)將其加(jia)(jia)入到(dao)pH 7的(de)(de)(de)(de)(de)2mol/L的(de)(de)(de)(de)(de)NaCl溶液(ye)(ye)(ye)(ye)中(zhong)30℃水浴(yu)60min，將吸(xi)附的(de)(de)(de)(de)(de)血管(guan)緊張素(su)(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)肽洗脫(tuo)下來，收集洗脫(tuo)液(ye)(ye)(ye)(ye)凍(dong)干(gan)，獲得(de)(de)血管(guan)緊張素(su)(su)轉化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)肽。
上述水泡蛾螺凍干粉(fen)中，每1g原料制得的酶解液(ye)可(ke)獲得0.021g的血管緊張素轉化酶抑制肽，即其收(shou)率為2.1％。
ACE抑(yi)制活性(xing)的測定
主要試劑配制方法：
ACE溶液：將(jiang)1U ACE溶于冷的1M pH 8.3的硼酸鹽(yan)緩沖液(含0.3M NaCl)10mL配制成0.1U/mLACE溶液，分(fen)裝，儲存于-20℃，備用(yong)。
HHL(馬尿酰(xian)(xian)組氨酰(xian)(xian)亮(liang)氨酸(suan))溶液：取HHL適(shi)量，以(yi)0.1M pH 8.3的硼酸(suan)鹽緩沖液(含0.3M NaCl)配制成濃度為5mmol/L HHL溶液，備用。
馬尿(niao)酸標準溶(rong)(rong)液：準確稱取馬尿(niao)酸標準樣品，加超純(chun)水溶(rong)(rong)解配制成濃度為(wei)50μg/mL馬尿(niao)酸標準溶(rong)(rong)液，備(bei)用(yong)。
反應體(ti)系環(huan)境為pH 8.3,0.1M硼酸鹽緩沖液(含有0.3M NaCl)。于(yu)1.5mL離心管中(zhong)(zhong)，取50μL，5mmol/L HHL，加(jia)入(ru)(ru)20μL樣品溶(rong)液，混合均勻，37℃±0.5℃恒溫水(shui)浴(yu)中(zhong)(zhong)預熱5min，然后加(jia)入(ru)(ru)20μL，0.1U/mL ACE，充(chong)分混勻。37℃恒溫水(shui)浴(yu)保溫60min后，加(jia)入(ru)(ru)10μL，0.2M HCl中(zhong)(zhong)止反應。同時(shi)用20μL水(shui)代替樣品作為空白對(dui)照組。反應液離心后用HPLC(Waters)檢測Hip生(sheng)成量。
色(se)譜(pu)條件：Ghall 12S05-2546C18柱(250mm×4.6mm)；乙腈(jing)：水(shui)(含0.05％TFA)＝25:75，等梯度洗脫；流速(su)0.5mL/min；檢測波(bo)長228nm；進(jin)樣量(liang)10μL。ACE抑制(zhi)率按下式進(jin)行計算。
式(shi)中(zhong)(zhong)：A樣品——加入(ru)抑制劑組中(zhong)(zhong)馬尿(niao)酸的峰(feng)面積(ji)；
A對照——空白對照組中(zhong)馬尿(niao)酸(suan)的峰面積(ji)。
采(cai)用高效液相法測得(de)其對(dui)ACE的(de)半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(IC50)為0.85g/L。這一半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度較(jiao)水泡蛾螺(luo)酶(mei)解(jie)(jie)液的(de)ACE的(de)半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(IC50)為15.27g/L低(di)且達17倍，說(shuo)明(ming)經過(guo)(guo)親和分(fen)離(li)后(hou)得(de)到的(de)組分(fen)的(de)ACE抑(yi)制(zhi)(zhi)率較(jiao)原酶(mei)解(jie)(jie)液明(ming)顯提高。同時說(shuo)明(ming)經過(guo)(guo)本發明(ming)的(de)方法對(dui)酶(mei)解(jie)(jie)液中的(de)ACEIP達到了較(jiao)好的(de)分(fen)離(li)效果(guo)。
實施例2
1)介孔分子篩SBA-15載體的制備：取1g聚環氧乙烷-聚環氧丙烷-聚環氧乙烷三嵌段共聚物(P123)溶解于50mL 1.6mol/L鹽酸溶液中30℃水浴攪拌3h，然后逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)5mL，并在40℃水浴持續攪拌20h；隨后將反應物轉移至反應釜中，放入烘箱110℃靜置條件下反應24h；最后收集固體產物，水洗抽濾干凈后放入烘箱80℃放置12h，取出后放入馬弗爐550℃燒8h，得介孔分子篩SBA-15；0.5g SBA-15加入175mL無水乙醇再加入2mLGLYMO，30℃水浴震蕩15h，反應結束后抽濾，洗凈后連接IDA，按1:10(g/mL)加入0.7mol/L IDA溶液(IDA溶液用1.5mol/L碳酸鈉溶液配制)，35℃水浴震蕩反應70min，反應結束抽濾后，以的質量體積比為1：10(g/mL)加入0.05mol/L的ZnSO4溶(rong)液，30℃水浴震(zhen)蕩75min，從而(er)獲得相應的載(zai)體。
2)血管緊張素(su)轉(zhuan)化酶在(zai)上步制備Zn-SBA-15載體上的固定(ding)化
稱取1)步(bu)制(zhi)備的Zn-SBA-15載體(ti)0.5g加入10mL的血管(guan)緊(jin)張素轉化酶(mei)(酶(mei)活(huo)為(wei)(wei)0.17U/mL，用pH 8.3的0.1mol/L硼(peng)酸(suan)鹽緩沖溶液(ye)配置而成(cheng))，50℃，恒溫水(shui)浴鍋中(zhong)水(shui)浴震蕩30min。反應結(jie)束后抽濾洗凈未(wei)吸附結(jie)合(he)的酶(mei)，從而獲得(de)固定化血管(guan)緊(jin)張素轉化酶(mei)，酶(mei)活(huo)為(wei)(wei)0.3074U/g。
3)100g水(shui)(shui)泡(pao)(pao)蛾(e)螺凍干(gan)粉以1：10(g/ml)的(de)比(bi)例(li)加(jia)(jia)入(ru)(ru)去離(li)子水(shui)(shui)中(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)一定溫度(du)水(shui)(shui)浴中(zhong)(zhong)(zhong)預熱10min，調節pH為中(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)最適pH7.0，加(jia)(jia)入(ru)(ru)加(jia)(jia)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)量(liang)為2500U/g的(de)中(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)后開始反應，反應過程中(zhong)(zhong)(zhong)通(tong)過滴加(jia)(jia)標(biao)準堿(jian)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)或酸溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)，維(wei)持初始pH值7.0，水(shui)(shui)解(jie)(jie)2h后，沸水(shui)(shui)浴滅酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)15min，4℃，10000rpm，冷凍離(li)心20min，取上清液(ye)(ye)，冷凍干(gan)燥，得到水(shui)(shui)泡(pao)(pao)蛾(e)螺蛋(dan)白(bai)水(shui)(shui)解(jie)(jie)產(chan)物。取制(zhi)(zhi)得的(de)水(shui)(shui)泡(pao)(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)(jie)液(ye)(ye)凍干(gan)粉溶(rong)(rong)(rong)于含0.1mol/LNaCl的(de)pH8.3的(de)0.1M的(de)硼(peng)酸鹽(yan)緩沖溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)配成50g/L濃度(du)的(de)水(shui)(shui)泡(pao)(pao)蛾(e)螺酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)(jie)液(ye)(ye)。取上述制(zhi)(zhi)備的(de)Zn-SBA-15固定化(hua)血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉化(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)，按質(zhi)量(liang)體積比(bi)1:15(g/ml)加(jia)(jia)入(ru)(ru)本(ben)步前述所配置的(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解(jie)(jie)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)30℃恒溫震蕩水(shui)(shui)浴鍋中(zhong)(zhong)(zhong)水(shui)(shui)浴震蕩60min，然后將(jiang)吸(xi)附血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉化(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)(zhi)肽(tai)的(de)Zn-SBA-15固定化(hua)ACE從(cong)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)用(yong)pH8.3的(de)0.1mol/L硼(peng)酸鹽(yan)緩沖溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)抽濾洗凈(jing)，然后將(jiang)其加(jia)(jia)入(ru)(ru)到pH 7的(de)2mol/L的(de)NaCl溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)30℃水(shui)(shui)浴60min，將(jiang)吸(xi)附的(de)血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉化(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)(zhi)肽(tai)洗脫(tuo)下來，收(shou)集洗脫(tuo)液(ye)(ye)凍干(gan)，獲得血(xue)(xue)管緊(jin)張(zhang)(zhang)(zhang)素(su)轉化(hua)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)抑制(zhi)(zhi)肽(tai)。
上(shang)述水泡蛾螺凍干粉(fen)中，每1g原(yuan)料制得的酶解液可獲得0.0199g的血管緊張素轉化酶抑制肽，即其收率為1.99％。
采用高(gao)效液(ye)(ye)相法(fa)測得其對ACE的(de)(de)(de)(de)半(ban)抑制濃(nong)度(du)(IC50)為1.0g/L。這一半(ban)抑制濃(nong)度(du)較水泡蛾螺(luo)酶解液(ye)(ye)的(de)(de)(de)(de)ACE的(de)(de)(de)(de)半(ban)抑制濃(nong)度(du)(IC50)為15.27g/L低且達(da)15倍，說明(ming)經過(guo)親和分(fen)離(li)(li)后(hou)得到(dao)的(de)(de)(de)(de)組分(fen)的(de)(de)(de)(de)ACE抑制率較原酶解液(ye)(ye)明(ming)顯提(ti)高(gao)。對酶解液(ye)(ye)中的(de)(de)(de)(de)ACEIP達(da)到(dao)了較好的(de)(de)(de)(de)分(fen)離(li)(li)效果(guo)。同時說明(ming)經過(guo)本發(fa)明(ming)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)對酶解液(ye)(ye)中的(de)(de)(de)(de)ACEIP達(da)到(dao)了較好的(de)(de)(de)(de)分(fen)離(li)(li)效果(guo)。
實驗例3
本實驗的步驟1)和(he)2)與實施例(li)1的1)和(he)2)相同。
3)100g水(shui)(shui)泡(pao)蛾(e)(e)螺(luo)凍干粉以1：10(g/mL)的(de)(de)(de)比(bi)例加(jia)(jia)入(ru)去離(li)子(zi)水(shui)(shui)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)45℃水(shui)(shui)浴(yu)(yu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)預熱(re)10min，調(diao)節pH為中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)性蛋(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)最適pH 7.0，加(jia)(jia)入(ru)2500U/g中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)性蛋(dan)(dan)(dan)白酶(mei)(mei)開始反應，反應過(guo)程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)通(tong)過(guo)滴(di)加(jia)(jia)標準堿溶(rong)液(ye)(ye)(ye)或酸(suan)(suan)溶(rong)液(ye)(ye)(ye)，維(wei)持初(chu)始pH值7.0，水(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)2h后，沸水(shui)(shui)浴(yu)(yu)滅酶(mei)(mei)15min，4℃，10000rpm，冷凍離(li)心(xin)20min，取(qu)上清液(ye)(ye)(ye)，冷凍干燥，得到水(shui)(shui)泡(pao)蛾(e)(e)螺(luo)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)蛋(dan)(dan)(dan)白水(shui)(shui)解(jie)(jie)(jie)產物。取(qu)水(shui)(shui)泡(pao)蛾(e)(e)螺(luo)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)凍干粉溶(rong)于(yu)含(han)0.3mol/L NaCl的(de)(de)(de)pH 8.3的(de)(de)(de)0.1M的(de)(de)(de)硼酸(suan)(suan)鹽緩(huan)沖溶(rong)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)配成50g/L濃度的(de)(de)(de)水(shui)(shui)泡(pao)蛾(e)(e)螺(luo)解(jie)(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)。取(qu)上述制(zhi)備的(de)(de)(de)Zn-SBA-15固定(ding)化(hua)血管緊張素(su)(su)(su)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)酶(mei)(mei)，按質(zhi)量體積(ji)比(bi)1:20(g/mL)加(jia)(jia)入(ru)本步前述所配置的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)(jie)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，在(zai)30℃恒溫震蕩水(shui)(shui)浴(yu)(yu)鍋中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)水(shui)(shui)浴(yu)(yu)震蕩60min，然(ran)后將(jiang)吸附(fu)血管緊張素(su)(su)(su)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)肽(tai)的(de)(de)(de)Zn-SBA-15固定(ding)化(hua)ACE從溶(rong)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)用(yong)pH8.3的(de)(de)(de)0.1mol/L硼酸(suan)(suan)鹽緩(huan)沖溶(rong)液(ye)(ye)(ye)抽濾洗(xi)凈(jing)，然(ran)后將(jiang)其(qi)加(jia)(jia)入(ru)到pH7的(de)(de)(de)2mol/L的(de)(de)(de)NaCl溶(rong)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)30℃水(shui)(shui)浴(yu)(yu)60min，將(jiang)吸附(fu)的(de)(de)(de)血管緊張素(su)(su)(su)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)肽(tai)洗(xi)脫(tuo)(tuo)下來(lai)，收集洗(xi)脫(tuo)(tuo)液(ye)(ye)(ye)凍干，獲(huo)得血管緊張素(su)(su)(su)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)酶(mei)(mei)抑(yi)制(zhi)肽(tai)。
上述水泡蛾螺(luo)凍干粉中，每1g原料制得(de)的酶解(jie)液可獲得(de)0.02g的血管緊張素轉(zhuan)化酶抑制肽，即其收率為2％。
采(cai)用高效液(ye)相法測得其對(dui)ACE的(de)(de)半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(du)(IC50)為(wei)1.2g/L。這一半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(du)較水(shui)泡蛾螺酶解(jie)液(ye)的(de)(de)ACE的(de)(de)半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(du)(IC50)為(wei)15.27g/L低(di)且達(da)15倍左(zuo)右，ACE的(de)(de)半(ban)抑(yi)制(zhi)(zhi)濃度(du)越低(di)說明肽(tai)的(de)(de)ACE抑(yi)制(zhi)(zhi)活性越好。說明經過親和分離(li)(li)后得到的(de)(de)組(zu)分的(de)(de)ACE抑(yi)制(zhi)(zhi)率較原酶解(jie)液(ye)明顯提高。同時說明經過本發(fa)明的(de)(de)方法對(dui)酶解(jie)液(ye)中的(de)(de)ACEIP達(da)到了較好的(de)(de)分離(li)(li)效果。
以上所述，僅為本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)較佳的具體實施方(fang)式，但本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的保護范(fan)圍并不局限(xian)于此，任何熟悉本(ben)技(ji)術(shu)領域的技(ji)術(shu)人員在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)披露的技(ji)術(shu)范(fan)圍內(nei)，根據本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的技(ji)術(shu)方(fang)案及其(qi)發(fa)明(ming)(ming)(ming)構思加以等同(tong)替換(huan)或改變，都(dou)應(ying)涵(han)蓋在本(ben)發(fa)明(ming)(ming)(ming)的保護范(fan)圍之內(nei)。