一種血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種血管緊張素轉化酶抑制肽，其氨基酸序列為：Trp?Tyr?Leu?His?Tyr?Ala。本發明還提供其制備方法，以酪蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶進行水解，將水解液加熱使蛋白酶失活，再以鎳磁性瓊脂糖微粒富集活性組分，高效液相色譜進一步分離，然后冷凍干燥，從而制備出ACE抑制肽。采用本發明制備工藝可以直接制得可食用的ACE抑制肽，也可以將其作為功能因子制成各類食品添加劑，或直接作為食品輔料添加到各類食品。
【專利說明】
一種血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]高血壓是危及人類身體健康的主要疾病之一。根據世界衛生組織預測，至2020年，非傳染性疾病將占我國死亡原因79%，其中高血壓等心血管疾病將占首位。作用于腎素-血管緊張素系統的藥物推出后被廣泛應用于各種心血管疾病的治療，并已被證明對高血壓有較好的降壓作用。血管緊張素抑制劑是臨床上廣泛應用的一種降血壓藥物，天然產物來源的血管緊張素抑制劑由于其以食物蛋白為原料，對于日漸追求天然綠色保健品與藥品的人們來說將具有更大的吸引力。
[0003]食品蛋白經過水解可以獲得含有豐富氨基酸蛋白質片段的生物活性肽，生物活性肽對人體生理節律起到調節作用，具有如清除自由基、抗疲勞、抗菌、抗血栓、免疫調節和降血壓等多種功能，可達到預防或輔助治療疾病、促進健康的目的。在發現的諸多生物活性肽中，血管緊張素轉換酶(ACE)抑制肽(ACE抑制肽)尤為引人注目，它是通過抑制ACE的活性達到降低人或動物血壓的作用，這就為更好地利用蛋白質資源，特別是一些原來認為生物效價不高的蛋白質資源提供了新的機遇和可能。
[0004]至今為止，人們已經利用多種蛋白酶水解各種食物蛋白，得到了超過200多種的ACE抑制肽，酪蛋白是較好的制備ACE抑制肽蛋白源，目前雖然已有多個ACE抑制肽從酪蛋白中分離得到，但酪蛋白仍是制備、分離新的ACE抑制肽的重要蛋白源。

【發明內容】

[0005]本發明提供了一種血管緊張轉化酶抑制肽，是利用酪蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶水解，經鎳磁性瓊脂糖微粒吸附分離、反相高效液相色譜分離得到的。用串聯飛行時間質譜MALD1-T0F-T0F質譜測定的氨基酸序列為 Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala (WYLHYA)。對ACE具有較高的抑制作用，半數抑制濃度(IC5q)為16.22 μΜ。
[0006]本發明的第一個目的是提供一種血管緊張素轉化酶抑制肽，其多肽序列為:Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala0
[0007]本發明的第二個目的是提供上述血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，是利用酪蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶水解得到酶解液，將酶解液分離純化得到的。
[0008]作為優選，所述將酶解液分離純化包括將酶解液用鎳磁性瓊脂糖微粒分離、反相高效液相分離純化的步驟。
[0009]作為優選，所述反相高效液相的參數為:高效液相色譜系統為Agilent1200;色譜柱為C18色譜柱(4.6 mmX150 mm,5 Mi);檢測器為DAD二極管陣列檢測器;流動相由兩溶劑組成，其中溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(V/V);洗脫梯度為60min以內，B相比例可由0%勻速升至100%;流速:0.5 -1mL.min—1;色譜柱溫度控制在30-40°C;檢測波長220 nm。
[0010]作為優選，所述采用木瓜蛋白酶水解制備酶解液的具體方法為:在pH6.5?8.5的酪蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶，水解溫度為30?50°C，水解過程中維持體系pH恒定，水解時間為0.5-8h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100 °C滅酶5?15min。
[0011]作為優選，所述酪蛋白與木瓜蛋白酶的質量比為10:1?100:1。
[0012]作為優選，所述將酶解液用鎳磁性瓊脂糖微粒分離的具體方法為:用磁性鎳磁性瓊脂糖微粒吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，往沉淀中加入5-50 mL 0.05M鹽酸，在30°C，振蕩頻率為50_120r/min下震蕩30-60min;離心，取上清液用0.45μπι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥。
[0013]本發明的第三個目的是提供上述抑制肽在制備血管素緊張轉化酶抑制劑中的應用。
[0014]本發明的第四個目的是提供一種血管素緊張轉化酶抑制劑，其包括權利要求1所述的抑制肽。
[0015]本發明的第五個目的是提供上述抑制劑在制備用于減緩高血壓的癥狀的功能食品中的應用。
[0016]本發明的優點如下:
1、本發明原料來源廣泛、廉價，資源豐富。分離方法簡單，成本低易操作。
[0017]2、工藝科學合理，簡單易行。
[0018]3、所得的ACE抑制肽為首次從酪蛋白木瓜蛋白酶水解物中所得的血管緊張素轉換酶抑制肽，具有良好的活性。
【附圖說明】
[0019]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中:
圖1為反相高效液相色譜法分離鎳磁性瓊脂糖微粒酪蛋白木瓜蛋白酶水解物所得組分的色譜圖；
圖2為基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜(MALD1-T0F-T0F)測定酪蛋白來源ACE抑制肽氨基酸序列的質譜圖。
【具體實施方式】
[0020]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
[0021]本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的氨基酸序列為:
Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala0
[0022]本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為:
(I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉(干酪素)(國藥集團化學試劑有限公司)，加水使蛋白含量約為0.3?3%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH6.0?8.5，形成反應原料液。往反應原料液中，加入酪蛋白質量的1/100?1/10木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在30?50°C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為0.5-8 h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100°C滅酶5?15min。
[0023](2 )酪蛋白來源ACE抑制肽的制備:用鎳磁性瓊脂糖微粒(sigma公司)吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往沉淀中加入5-50 mL 0.05M鹽酸，在30°C，振蕩頻率為50_120r/min下震蕩30_60min。離心，取上清液用0.45μηι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0024]然后用高效液相色譜柱分離(色譜條件:Agilent1200高效液相色譜系統；色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA)(V/V);洗脫梯度:0-60 min,B相比例由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定其體外ACE抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0025]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-T0F-T0F質譜測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0026]測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度(IC5q，抑制50%ACE活性所需抑制劑的濃度):50yL 5mmol HHL、ImU血管緊張素轉化酶(ACE)和不同濃度30yL的0.02_2mg/ml酪蛋白來源ACE抑制肽混合得到若干組樣品。所述的系列樣品反應液和酪蛋白來源ACE抑制肽用的硼酸緩沖液(含0.3M Nacl,pH 8.3)。反應液在37 V反應60min后，加入0.15 mLlmol/L HCl中止反應，離心15 min后，取上清液用高效液相(HPLC)法分析馬尿酸的含量并計算被測物對ACE的活性。采用統計軟件SPSS13.0(P>0.05)分析其IC50。
[0027]實施例1
本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為:
(I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉，加水使蛋白含量約為l%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH6.5，形成反應原料液。往反應原料液中，加入酪蛋白質量的1/10木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在40 0C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為4h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100 °C滅酶15 min。
[0028](2 )酪蛋白來源ACE抑制肽的制備:用鎳磁性瓊脂糖微粒(sigma公司)吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往沉淀中加入20 mL 0.05M鹽酸，在30°C、振蕩頻率為100r/min下震蕩40min。離心，取上清液用0.45μηι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0029]然后用反相高效液相色譜柱分離(色譜條件:Agilent1200高效液相色譜系統;色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA) (V/V);洗脫梯度:0-60min，B相由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據反相高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定體外血管緊張素轉化酶抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0030]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-T0F-T0F質譜測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0031 ]經測定，本發明的酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度IC5q為16.22μΜ。
[0032]實施例2 本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為:
(I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉，加水使蛋白含量約為2%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH7.0，形成反應原料液。往反應原料液中，加入酪蛋白質量的1/20木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在40 0C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為0.5h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100°C滅酶lOmin。
[0033](2)酪蛋白來源ACE抑制肽的制備:用鎳磁性瓊脂糖微粒(sigma公司)吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往沉淀中加入25 mL 0.05M鹽酸，在30°C、振蕩頻率為100r/min下震蕩40min。離心，取上清液用0.45μηι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0034]然后用反相高效液相色譜柱分離(色譜條件:Agilent1200高效液相色譜系統;色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA) (V/V);洗脫梯度:0-60min，B相由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據反相高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定體外血管緊張素轉化酶抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0035]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-TOF-TOF質譜測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0036]經測定，本發明的酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度IC5q為16.22μΜ。
[0037]實施例3
本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為:
(I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉，加水使蛋白含量約為1.5%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH 7.5，形成反應原料液。往反應原料液中，加入1/25木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在45 0C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為8h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100°c滅酶lOmin。
[0038](2)酪蛋白血管緊張素轉化酶抑制肽的制備:用以鎳磁性瓊脂糖微粒吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往磁性微粒中再加入30 mL 0.05M鹽酸，在30°C，振蕩頻率為90r/min下震蕩50min。離心，取上清液用0.45μm的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0039]然后用高效液相色譜柱分離，(色譜條件=Agilent 1200高效液相色譜系統；色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA)(V/V);洗脫梯度:0-60 min,B相比例由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定ACE抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0040]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-TOF-TOF質譜測定氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0041]經測定，本發明的酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度IC5q為16.22μΜ。
[0042]實施例4
本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為: (I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉，加水使蛋白含量約為2.5%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH6.8，形成反應原料液。往反應原料液中，加入酪蛋白質量的1/30木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在40 0C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為6h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100°C滅酶lOmin。
[0043](2)酪蛋白來源ACE抑制肽的制備:用以鎳磁性瓊脂糖微粒吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往沉淀中加入40 mL
0.05M鹽酸，在40 0C、振蕩頻率為100r/min下震蕩40min。離心，取上清液用0.45μπι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0044]然后用反相高效液相色譜柱分離，(色譜條件:Agilent1200高效液相色譜系統；色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA)(V/V);洗脫梯度:0-60min，B相由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據反相高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定體外血管緊張素轉化酶抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0045]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-TOF-TOF質譜測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0046]經測定，本發明的酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度IC5q為16.22μΜ。
[0047]實施例5
本發明的血管緊張轉化酶抑制肽的制備方法為:
(I)酪蛋白酶解液的制備:取酪蛋白粉，加水使蛋白含量約為2%(w/w)，用NaOH溶液將其調至pH7.3，形成反應原料液。往反應原料液中，加入酪蛋白質量的1/40木瓜蛋白酶啟動反應。溫度控制在40 0C，水解過程中加入NaOH溶液維持體系pH恒定，水解時間為2h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100°C滅酶lOmin。
[0048](2)酪蛋白來源ACE抑制肽的制備:用以鎳磁性瓊脂糖微粒吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，備用。往沉淀中加入50 mL0.05M鹽酸，在40 0C、振蕩頻率為100r/min下震蕩40 min。離心，取上清液用0.45μπι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥，備用。
[0049]然后用反相高效液相色譜柱分離，(色譜條件:Agilent1200高效液相色譜系統；色譜柱:Zorbax SB Cis色譜柱(4.6 mmX 150 mm,5 μπι);檢測器:DAD二極管陣列檢測器;流動相:溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(TFA)(V/V);洗脫梯度:0-60min，B相由0%勻速上升到100%;流速:0.5 -1.0mL.min—1;柱溫:30-40 °C;檢測波長220nm)。根據反相高效液相色譜柱分離所得的肽譜圖，分別收集各吸收峰的活性組分，測定體外血管緊張素轉化酶抑制活性，將活性高的組分多次收集，冷凍干燥。
[0050]用基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜MALD1-TOF-TOF質譜測定該酪蛋白來源ACE抑制肽的氨基酸序列，譜圖如圖2所示，序列為WYLHYA。
[0051 ]經測定，本發明的酪蛋白來源ACE抑制肽的半數抑制濃度IC5q為16.22μΜ。
[0052]最后應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種血管緊張素轉化酶抑制肽，其特征在于:其多肽序列為:Trp-Tyr-Leu-His-Tyr-Ala02.權利要求1所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其特征在于:是利用酪蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶水解得到酶解液，將酶解液分離純化得到的。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述將酶解液分離純化包括將酶解液用鎳磁性瓊脂糖微粒吸附分離、反相高效液相色譜法分離純化的步驟。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述反相高效液相的參數為:高效液相色譜系統為Agilent 1200;色譜柱為C18色譜柱;檢測器為DAD二極管陣列檢測器;流動相由兩溶劑組成，其中溶劑A相為水、B相為乙腈，A、B相均含0.05-0.2%三氟乙酸(V/V);洗脫梯度為60min以內，B相比例可由0%勻速升至100% ;流速:0.5 -1mL.min—1;色譜柱溫度控制在30-40 °C;檢測波長220 nm。5.根據權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于:所述采用木瓜蛋白酶水解制備酶解液的具體方法為:在PH6.0?8.5的酪蛋白水溶液中加入木瓜蛋白酶，水解溫度為30?50 °C，水解過程中維持體系pH恒定，水解時間為0.5-8h，水解結束后，調pH至中性，加熱至100 °C滅酶5?15min;作為優選，所述酪蛋白與木瓜蛋白酶的質量比為10:1?100:1。6.根據權利要求2-4任一所述的方法，其特征在于:所述將酶解液用鎳磁性瓊脂糖微粒分離的具體方法為:用鎳磁性瓊脂糖微粒吸附酶解液，離心，將上清液去掉，并用去離子水多次清洗沉淀以去掉游離蛋白，抽濾，往沉淀中加入5-50 mL 0.05M鹽酸，在30°C、振蕩頻率為50-120r/min下震蕩30_60min;離心，取上清液用0.45μπι的濾膜過濾后，將濾液冷凍干燥。7.權利要求1所述的抑制肽在制備血管素緊張轉化酶抑制劑中的應用。8.一種血管素緊張轉化酶抑制劑，其特征在于:其包括權利要求1所述的抑制肽。9.權利要求1所述的抑制劑在制備用于減緩高血壓的癥狀的功能食品中的應用。
【文檔編號】C12P21/06GK105859868SQ201610400930
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】伍善廣, 田玉紅, 馮學珍, 陸玉婷, 陸苑, 蒙華琳, 劉賽賽
【申請人】廣西科技大學