本發明(ming)屬于生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)工程(cheng)技術領(ling)域，涉及(ji)抗真菌藥物(wu)(wu)的(de)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)發酵(jiao)，具體涉及(ji)紐莫康(kang)定B0的(de)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)發酵(jiao)方法。
背景技術：
棘白菌素化合物發現于20世紀70年代，是一類具有六元環肽和不同脂肪酸側鏈的微生物次級代謝產物，能夠特異性地作用于真菌細胞壁，非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，從而能夠起到抗菌效果，且不對人體產生影響。紐莫康定B0的(de)(de)半合(he)成衍(yan)生(sheng)物卡泊芬(fen)(fen)凈是首個(ge)被(bei)報(bao)道的(de)(de)棘白菌(jun)(jun)素類化(hua)合(he)物，2001年被(bei)美國FDA批(pi)準用于曲(qu)霉菌(jun)(jun)感(gan)染(ran)的(de)(de)治療(liao)。目前(qian)，卡泊芬(fen)(fen)凈已成為全身用抗(kang)真菌(jun)(jun)藥市(shi)場的(de)(de)王牌(pai)藥物。
紐莫康(kang)定B0是由霉菌Glarea lozoyensis發酵合成(cheng)的(de)次(ci)級代謝(xie)產物(wu)。
紐莫康(kang)定B0 Cas：135575-42-7
Glarea lozoyensis的(de)(de)(de)發(fa)酵產(chan)(chan)物(wu)主要(yao)有(you)A0和(he)B0兩(liang)(liang)種有(you)效(xiao)產(chan)(chan)物(wu)，除此之外，發(fa)酵過程中(zhong)也會(hui)多種環(huan)狀六肽的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)類似物(wu)，其中(zhong)C0的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)和(he)B0最為接(jie)近，兩(liang)(liang)者的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)差異在于(yu)B0中(zhong)的(de)(de)(de)反(fan)式(shi)3-羥基(ji)脯(fu)氨酸，在C0中(zhong)是反(fan)式(shi)4-羥基(ji)脯(fu)氨酸。在實際生(sheng)產(chan)(chan)中(zhong)，主要(yao)采(cai)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)是樹脂柱工(gong)藝對紐(niu)莫(mo)(mo)(mo)康定(ding)B0進行提(ti)純，柱層析(xi)應(ying)用(yong)(yong)于(yu)工(gong)業化生(sheng)產(chan)(chan)時，費時，溶劑使(shi)用(yong)(yong)量大(da)，易造成環(huan)境污染(ran)，且(qie)原料損耗大(da)，使(shi)得(de)生(sheng)產(chan)(chan)成本大(da)幅提(ti)高，C0是紐(niu)莫(mo)(mo)(mo)康定(ding)B0的(de)(de)(de)異構(gou)(gou)體，在結(jie)構(gou)(gou)上的(de)(de)(de)差異表現為一個(ge)羥基(ji)位(wei)置的(de)(de)(de)不(bu)同；C0雜(za)質不(bu)能(neng)在反(fan)相色譜中(zhong)與紐(niu)莫(mo)(mo)(mo)康定(ding)B0分離，只有(you)通過正(zheng)相色譜分離。發(fa)酵液中(zhong)的(de)(de)(de)C0雜(za)質一般10％，如果不(bu)能(neng)得(de)到(dao)有(you)效(xiao)的(de)(de)(de)控制，最后(hou)得(de)到(dao)的(de)(de)(de)是紐(niu)莫(mo)(mo)(mo)康定(ding)B0和(he)C0的(de)(de)(de)混合物(wu)。C0雜(za)質能(neng)參與后(hou)續反(fan)應(ying)，嚴重影響醋(cu)酸卡泊(bo)芬凈的(de)(de)(de)質量。
紐莫康定(ding)C0 Cas：144074-96-4
發酵過程中結構類似(si)物(wu)的有(you)效(xiao)(xiao)控制，能提高后期(qi)的分(fen)離(li)效(xiao)(xiao)率，降低生產成(cheng)本，因(yin)此(ci)如(ru)何(he)提高B0效(xiao)(xiao)價同時降低副產物(wu)的比例，是研究人員關注的方向。
技術實現要素：
本發(fa)明提(ti)供一種(zhong)(zhong)新的(de)紐(niu)莫(mo)康(kang)定(ding)B0的(de)發(fa)酵(jiao)方(fang)(fang)法，該(gai)方(fang)(fang)法在(zai)提(ti)高紐(niu)莫(mo)康(kang)定(ding)B0發(fa)酵(jiao)單位的(de)同(tong)時，還(huan)能降低發(fa)酵(jiao)液中紐(niu)莫(mo)康(kang)定(ding)C0的(de)含量，在(zai)該(gai)方(fang)(fang)法中使用的(de)菌(jun)種(zhong)(zhong)為Glarea lozoyensis，所(suo)述發(fa)酵(jiao)條(tiao)件如下：
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合(he)硫酸(suan)鎂(mei)0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
發(fa)(fa)酵(jiao)過程(cheng)(cheng)中溫(wen)度24～26℃，起始通氣(qi)(qi)量0.5～1.0VVM，罐(guan)壓0.04～0.06Mpa。發(fa)(fa)酵(jiao)過程(cheng)(cheng)中逐漸調(diao)高通氣(qi)(qi)量與轉速使溶氧不低于20％，轉速最大600轉，通氣(qi)(qi)量最大1.2VVM。
發酵24h后，開始流加氨水，控制pH5.0～5.4。
發酵48h后，開始(shi)補加(jia)維生(sheng)素b5，按照培(pei)養(yang)基的體積，添(tian)加(jia)量(liang)為20～40mg/l。
發酵60h后(hou)，開始(shi)流(liu)加乳糖，流(liu)加速度為1.5～2.5％/天(質量體積比)，使(shi)發酵液總糖濃度控制在1～3％之(zhi)間，直到(dao)發酵結(jie)束(shu)。
發(fa)酵72h后(hou)(通氣量與(yu)轉速已調至(zhi)上(shang)限)，根據(ju)溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量變化調節pH控(kong)制(zhi)(zhi)范圍，直(zhi)到發(fa)酵結束：溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量不(bu)低于45％時(shi)(shi)(shi)，控(kong)制(zhi)(zhi)pH5.0～5.4；溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量為35％～45％時(shi)(shi)(shi)，控(kong)制(zhi)(zhi)pH5.4～5.8；溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量為25％～35％時(shi)(shi)(shi)，控(kong)制(zhi)(zhi)pH5.8～6.2；溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量低于25％時(shi)(shi)(shi)，控(kong)制(zhi)(zhi)pH6.2～6.6。
發酵培養期共10天，10天后放罐。
本(ben)發(fa)明培養基采用稀配(pei)方(fang)，發(fa)酵過程中流加乳(ru)糖和氨水(shui)，能夠(gou)有效(xiao)降低菌(jun)體粘度，提(ti)高通氣效(xiao)果，同(tong)時在發(fa)酵過程中嚴格控制pH。
流加乳糖后，發酵(jiao)液(ye)總糖濃度控制在1～3％之(zhi)間，在這個范圍(wei)內菌絲的正(zheng)常生長(chang)代謝(xie)是穩定的，過(guo)低則(ze)影(ying)響正(zheng)常代謝(xie)，過(guo)高則(ze)不利于下一(yi)步的放罐(guan)提取。
且(qie)該(gai)方法在發酵液(ye)中補加維生素b5，使得紐(niu)莫康定C0的含(han)量可(ke)由原來(lai)的約6％降(jiang)至1.5％。
現有(you)紐(niu)莫康定B0的(de)發(fa)酵技術(shu)中(zhong)，紐(niu)莫康定B0的(de)發(fa)酵單位約為800～1000mg/l，本(ben)發(fa)明(ming)發(fa)酵方(fang)法可(ke)將發(fa)酵單位提高至(zhi)2000～2500mg/l，且紐(niu)莫康定C0的(de)含量大幅下降。
具體實施例
實施例1
發酵菌種：Glarea lozoyensis
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合(he)硫酸(suan)鎂0.05％，MES緩沖鹽(yan)1.5％，pH 5.3。
50L發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)(guan)培(pei)養(yang)，培(pei)養(yang)基(ji)30L，121℃消毒30分(fen)鐘。種(zhong)量1.5L，發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)培(pei)養(yang)溫度25℃，起始(shi)(shi)通氣量0.9VVM，200轉(zhuan)，罐(guan)(guan)(guan)壓0.05Mpa，發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)過程中(zhong)逐漸調(diao)高通氣量與轉(zhuan)速(su)(su)使溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)不低于(yu)20，轉(zhuan)速(su)(su)最(zui)大600轉(zhuan)，通氣量最(zui)大1.2VVM。發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)24h后，開始(shi)(shi)流(liu)加(jia)(jia)氨水，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.0～5.4。發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)48h后，開始(shi)(shi)補加(jia)(jia)維生素(su)b5，添加(jia)(jia)量為(wei)30mg/l。發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)60h后，開始(shi)(shi)流(liu)加(jia)(jia)乳(ru)糖，流(liu)加(jia)(jia)速(su)(su)度為(wei)2.0％/天(質(zhi)量體積比)，使發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)總(zong)糖濃度控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)1～3％之間，直到發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)結(jie)束。發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)72h后(此時通氣量與轉(zhuan)速(su)(su)已(yi)調(diao)至(zhi)(zhi)上限)，根據(ju)溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)變化調(diao)節(jie)pH控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)范(fan)圍，直到發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)結(jie)束：溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量不低于(yu)45％時，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.0～5.4，96h溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量為(wei)35％～45％，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.4～5.8，110h溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)量為(wei)25％～35％，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.8～6.2，130h溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)低于(yu)25％，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH6.2～6.6，144h溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)回升至(zhi)(zhi)25％，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.8～6.2，168h溶(rong)(rong)氧(yang)(yang)回升至(zhi)(zhi)35％，并維持在(zai)35％～45％之間，控(kong)(kong)制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.4～5.8，240h發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)結(jie)束，放罐(guan)(guan)(guan)，測定紐(niu)莫康定B0的發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)單位為(wei)2345mg/l，紐(niu)莫康定C0的含量為(wei)1.5％。