本發明涉及一種(zhong)海洋活(huo)性(xing)多(duo)肽(tai)，特(te)別涉及一種(zhong)雙(shuang)齒圍(wei)沙蠶抗肺癌多(duo)肽(tai)的制(zhi)備方法。

背景技術：

肺(fei)癌是(shi)(shi)全球(qiu)范(fan)圍內發病率(lv)最高(gao)的(de)(de)惡性(xing)腫(zhong)瘤(liu)，近年(nian)來發病率(lv)、死(si)亡率(lv)逐(zhu)年(nian)上升，已成(cheng)(cheng)為(wei)(wei)腫(zhong)瘤(liu)相關死(si)亡的(de)(de)首要(yao)病因。肺(fei)癌約80％是(shi)(shi)非小(xiao)(xiao)細(xi)(xi)胞肺(fei)癌，在晚(wan)期(qi)(qi)肺(fei)癌中(zhong)的(de)(de)比例達到總數的(de)(de)40％～50％。目前(qian)對于(yu)非小(xiao)(xiao)細(xi)(xi)胞肺(fei)癌的(de)(de)治療(liao)(liao)早期(qi)(qi)是(shi)(shi)手術切(qie)除，晚(wan)期(qi)(qi)主(zhu)要(yao)是(shi)(shi)化(hua)(hua)療(liao)(liao)，但化(hua)(hua)療(liao)(liao)的(de)(de)毒副作(zuo)用及產生的(de)(de)耐(nai)藥(yao)(yao)性(xing)，影(ying)響治療(liao)(liao)的(de)(de)有效性(xing)，因此尋(xun)找精準治療(liao)(liao)是(shi)(shi)熱(re)門話題。海(hai)(hai)(hai)洋是(shi)(shi)一(yi)個巨大的(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)寶庫(ku)，從海(hai)(hai)(hai)洋中(zhong)尋(xun)找活性(xing)物(wu)(wu)質(zhi)已成(cheng)(cheng)為(wei)(wei)熱(re)點，并從中(zhong)分離獲得多(duo)種(zhong)活性(xing)物(wu)(wu)質(zhi)，如(ru)(ru)肽(tai)類、多(duo)糖、生物(wu)(wu)堿、萜(tie)類、大環(huan)內脂等，有望開發成(cheng)(cheng)新(xin)型的(de)(de)抗腫(zhong)瘤(liu)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)，如(ru)(ru)從海(hai)(hai)(hai)兔(tu)獲得的(de)(de)dolastatin 10已進入臨床試(shi)驗。沙(sha)(sha)蠶(Nereis)屬于(yu)環(huan)節動(dong)物(wu)(wu)門(Annelida)多(duo)毛綱(Polychaeta)沙(sha)(sha)蠶科(ke)(Nereididae)，又稱(cheng)為(wei)(wei)海(hai)(hai)(hai)蟲、海(hai)(hai)(hai)蜈蚣、海(hai)(hai)(hai)螞蟥等，其生物(wu)(wu)資源豐(feng)富，廣泛分布在我國沿海(hai)(hai)(hai)地區，近年(nian)來人工養(yang)殖用于(yu)鉤魚的(de)(de)誘(you)餌。沙(sha)(sha)蠶是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)傳統的(de)(de)海(hai)(hai)(hai)洋中(zhong)藥(yao)(yao)，有清熱(re)解毒，消腫(zhong)止痛，斂瘡生肌(ji)，主(zhu)治癰瘡腫(zhong)毒等功效。學(xue)者(zhe)們從沙(sha)(sha)蠶體內獲得了具有良好藥(yao)(yao)理活性(xing)的(de)(de)物(wu)(wu)質(zhi)。吉林大學(xue)從日本刺沙(sha)(sha)蠶體內分離出一(yi)種(zhong)沙(sha)(sha)蠶絲氨酸(suan)蛋白(bai)酶，該蛋白(bai)酶抑制(zhi)血小(xiao)(xiao)板聚(ju)集，改變(bian)血液(ye)流變(bian)學(xue)特(te)性(xing)，可作(zuo)為(wei)(wei)降(jiang)纖和溶(rong)栓藥(yao)(yao)物(wu)(wu)，預(yu)防和治療(liao)(liao)心、腦梗塞，腦動(dong)脈、肺(fei)動(dong)脈血栓形成(cheng)(cheng)等疾(ji)病。然(ran)沙(sha)(sha)蠶酶解多(duo)肽(tai)的(de)(de)研究較少，而對非小(xiao)(xiao)細(xi)(xi)胞肺(fei)癌A549細(xi)(xi)胞的(de)(de)抑制(zhi)活性(xing)目前(qian)尚未見報(bao)道(dao)。

技術實現要素：

本發明(ming)的(de)(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)(de)在于提供(gong)一種(zhong)雙(shuang)齒(chi)圍沙蠶抗肺(fei)癌(ai)多(duo)肽的(de)(de)(de)(de)制(zhi)備方(fang)法，安全性好，反應條件(jian)溫和(he)(he)，過程控(kong)制(zhi)容易，所得(de)雙(shuang)齒(chi)圍沙蠶抗肺(fei)癌(ai)多(duo)肽純度高，對肺(fei)癌(ai)細(xi)胞(bao)A549和(he)(he)H1299有(you)明(ming)顯(xian)的(de)(de)(de)(de)增殖抑制(zhi)作用(yong)，具有(you)較好的(de)(de)(de)(de)醫學應用(yong)價值。

本(ben)發(fa)明解決其技(ji)術問題所采用的技(ji)術方(fang)案是(shi)：

一種雙齒圍沙蠶抗肺癌(ai)多肽的制備方法，步驟如下：

(1)樣品預處理：將雙齒圍沙蠶(can)解凍后，清洗干凈(jing)，勻漿，得到勻漿液；

(2)酶(mei)解(jie)(jie)：按照每克(ke)勻漿液加1mL純(chun)凈(jing)水的配(pei)比，將勻漿液與純(chun)凈(jing)水混勻，調節pH至11，加入(ru)堿性蛋(dan)白酶(mei)，酶(mei)解(jie)(jie)后(hou)得酶(mei)解(jie)(jie)液；

(3)超(chao)濾(lv)：酶解液滅活(huo)，離心，取上清液，經(jing)超(chao)濾(lv)獲得分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)(liang)(liang)1ku以下、1ku<分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)(liang)(liang)≤3ku、3ku<分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)(liang)(liang)≤5ku、5ku<分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)(liang)(liang)≤8ku以及8ku<分(fen)(fen)子(zi)量(liang)(liang)(liang)(liang)≤30ku的(de)(de)五種組分(fen)(fen)的(de)(de)活(huo)性組分(fen)(fen)，MTT法篩選對肺癌細(xi)胞A549增殖抑制率最(zui)高的(de)(de)活(huo)性組分(fen)(fen)；

(4)陰離(li)子(zi)交換(huan)(huan)(huan)層(ceng)析(xi)：收集步驟(zou)(3)獲得的(de)對(dui)肺癌細胞A549增殖抑制率最(zui)高(gao)的(de)活(huo)性組分(fen)，冷凍(dong)干(gan)燥，經(jing)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離(li)子(zi)交換(huan)(huan)(huan)層(ceng)析(xi)，梯(ti)度洗(xi)脫，在280nm進行檢測，分(fen)別(bie)收集各洗(xi)脫峰(feng)并冷凍(dong)干(gan)燥，MTT法篩選對(dui)肺癌細胞A549增殖抑制率最(zui)高(gao)的(de)陰離(li)子(zi)交換(huan)(huan)(huan)層(ceng)析(xi)產物；

(5)Sephadex G25凝膠層析(xi)：將步(bu)驟(zou)(4)獲得的(de)對肺(fei)癌細胞(bao)(bao)A549增殖抑制率(lv)最高的(de)陰離子交(jiao)換(huan)層析(xi)產物采用(yong)Sephadex G-25凝膠層析(xi)分(fen)(fen)離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進行檢測，分(fen)(fen)別收集各洗脫峰并冷凍(dong)干(gan)燥，MTT法篩選對肺(fei)癌細胞(bao)(bao)A549增殖抑制率(lv)最高的(de)Sephadex G25凝膠層析(xi)產物；

(6)高效液相(xiang)色(se)譜(pu)分離(li)(li)純化：對步(bu)驟(zou)(5)獲得的對肺(fei)癌(ai)細胞A549增(zeng)殖抑制率(lv)最高的Sephadex G25凝膠層析產物經(jing)濾膜過濾后(hou)用(yong)(yong)采(cai)用(yong)(yong)反相(xiang)高效液相(xiang)色(se)譜(pu)法分離(li)(li)純化，收集主峰，冷(leng)凍干燥后(hou)獲得雙齒圍沙蠶抗肺(fei)癌(ai)多肽。

本(ben)發(fa)明首(shou)次通過酶解的方法從(cong)沙蠶體(ti)內提取獲(huo)得具(ju)有抗肺癌作(zuo)(zuo)用的多(duo)肽，對肺癌細(xi)胞(bao)A549和(he)H1299有明顯的增殖抑制作(zuo)(zuo)用，具(ju)有較好(hao)的醫學應用價(jia)值。

作為優選(xuan)，步驟(2)按照每克(ke)勻漿液(ye)加300U的加酶量(liang)加入堿性蛋(dan)白酶，50℃酶解6小時得酶解液(ye)。

作(zuo)為(wei)優(you)選，步驟(4)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離(li)子(zi)交換層析的(de)分離(li)條件為(wei)：pH 7.2、0.2mM的(de)Tris-HCl緩沖溶液平衡柱子(zi)后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為(wei)2mL，每次上樣前(qian)過0.22μm的(de)膜(mo)。

作為優(you)選(xuan)，步(bu)驟(5)蒸餾水洗脫的(de)洗脫流速(su)為1.1mL/min。

作(zuo)為(wei)優選，步驟(6)反(fan)相(xiang)(xiang)高效液相(xiang)(xiang)色(se)譜法分(fen)離(li)純化的(de)(de)色(se)譜條(tiao)件(jian)：色(se)譜柱(zhu)：ZORBAX SB-C18分(fen)析型色(se)譜柱(zhu)；檢測(ce)波長：280nm；流(liu)速：0.5mL/min；流(liu)動相(xiang)(xiang)A為(wei)含(han)0.05％三(san)氟乙(yi)(yi)酸的(de)(de)乙(yi)(yi)腈，流(liu)動相(xiang)(xiang)B為(wei)含(han)0.05％三(san)氟乙(yi)(yi)酸的(de)(de)超純水，采用梯度洗脫方式：20％～100％A洗脫5～20min；平(ping)衡(heng)時(shi)：流(liu)動相(xiang)(xiang)A與流(liu)動相(xiang)(xiang)B的(de)(de)流(liu)動相(xiang)(xiang)體(ti)積比為(wei)20：80；柱(zhu)溫：25℃；自(zi)動進樣，進樣量：10μL。

本發(fa)明的(de)有(you)(you)益效(xiao)果是：安全性(xing)好，反(fan)應(ying)條件溫和，過(guo)程(cheng)控制(zhi)容易，所得(de)雙齒(chi)圍沙(sha)蠶抗肺癌(ai)多肽純(chun)度高，對肺癌(ai)細胞A549和H1299有(you)(you)明顯(xian)的(de)增殖(zhi)抑制(zhi)作用，具有(you)(you)較好的(de)醫學應(ying)用價值(zhi)。

附圖說明

圖1五種蛋白酶酶解(jie)物對A549細胞(bao)的抑制率。

圖2不(bu)同分子(zi)量(liang)的沙蠶多肽對A549細胞(bao)增殖的影響。

圖(tu)3陰(yin)離子(zi)DEAE Sepharose Fast Flow洗(xi)脫峰。

圖4葡聚糖凝膠柱洗脫峰。

圖(tu)5反相高(gao)效液(ye)相色譜柱洗脫峰(feng)。

圖6 PAP對(dui)A549細胞活性的(de)影響(xiang)。

圖7 PAP對H1299細(xi)胞活性(xing)的(de)影響(xiang)。

圖(tu)8倒置(zhi)顯微鏡下的A549細胞(×200)。

圖(tu)9倒置顯微鏡(jing)下的H1299細胞(×200)。

圖(tu)10 A549細胞形態,AO/EB染色(se)(×200)。

圖11 H1299細(xi)胞(bao)形態,AO/EB染色(×200)。

圖12 PAP對A549細胞形態變(bian)化的(de)影響(xiang)，24h Hoechst 33258染色(se)(×200)。

圖(tu)13 PAP對H1299細胞形態變化的影響，24h Hoechst 33258染色(×200)。

圖14 A549細胞Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖15 H1299細(xi)胞(bao)Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖(tu)16 A549細胞線粒體膜電位(wei)的變(bian)化(hua)24h。

圖17 H1299細胞線粒體膜(mo)電位(wei)的變化(hua)24h。

具體實施方式

下(xia)面通過具體(ti)實施(shi)例，對本發明的(de)(de)技術(shu)方案作(zuo)進一步的(de)(de)具體(ti)說(shuo)明。

本(ben)發明中，若非(fei)特指，所采用的(de)原料(liao)和(he)設(she)備等(deng)均可從(cong)市(shi)場購得或是本(ben)領域常用的(de)。下述實施(shi)例(li)中的(de)方(fang)法(fa)，如無特別說(shuo)明，均為本(ben)領域的(de)常規方(fang)法(fa)。

實施例：

1材料與方法

1.1原料

1.1.1樣(yang)品與試劑

沙(sha)蠶(can)購于舟山市水產養殖(zhi)場(chang)，經浙(zhe)江海洋大學趙(zhao)盛龍教授鑒定為(wei)雙齒圍沙(sha)蠶(can)(Perinereies aibuhitensis)，鮮活購買后待(dai)用。Folin試(shi)劑，上海如(ru)吉(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)科技(ji)(ji)發展有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；酪氨酸，上海如(ru)吉(ji)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)科技(ji)(ji)發展有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；胰蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶、木(mu)瓜蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶、堿性蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶、中性蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶和(he)胃蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)酶，北(bei)京(jing)亞太(tai)恒信(xin)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)科技(ji)(ji)有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；酪蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，北(bei)京(jing)亞太(tai)恒信(xin)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)科技(ji)(ji)有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；胎牛血(xue)清，杭州四季(ji)青(qing)生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)工(gong)程有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；1640粉末培養基，Gibco公(gong)司(si)(si)；四甲基偶氮唑藍(lan)(MTT)，美(mei)國(guo)(guo)sigma公(gong)司(si)(si)；二甲基亞砜(feng)(DMSO)，美(mei)國(guo)(guo)sigma公(gong)司(si)(si)；美(mei)國(guo)(guo)sigma公(gong)司(si)(si)；JC-1線粒體膜電位檢測(ce)試(shi)劑盒(he)，南京(jing)凱基生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)發展有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；細胞凋亡(wang)檢測(ce)試(shi)劑盒(he)，北(bei)京(jing)貝博生(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)科技(ji)(ji)有限(xian)(xian)(xian)(xian)公(gong)司(si)(si)；其它試(shi)劑均為(wei)分(fen)析純。

1.1.2細胞

人肺癌(ai)A549和(he)H1299細胞株均購自中科院上海細胞庫，由本(ben)實驗室傳代(dai)培養。

1.2主要儀器與設備

DS-1組織搗碎機，上海標準模型廠；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；GF16RXII日立高速低溫離心機，日本HITACHI公司；ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機，德國CHRIST公司；BSA124S型電子天平，德國SatoriusAG公司；ZHJH-C1209C型超凈工作臺，上海智證分析儀器制造公司；Forma3111型CO₂培養箱，美(mei)國Thermo公(gong)司；酶標儀，美(mei)國Bio-Rad公(gong)司產品；BX2-FLB3熒光顯微鏡(jing)和(he)CCD-NC6051顯微攝像，日(ri)本OLYMPUS公(gong)司；WRO-70型(xing)超純(chun)水儀和(he)easy Cyte6 HT-2L流式細胞儀，美(mei)國Millipore公(gong)司。

1.3方法

1.3.1沙蠶酶解液(ye)的制備(bei)工藝過程

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種蛋白酶對原料進行酶解。利用正交試驗設計酶解實驗，以氨基氮含量和抗肺癌A549細胞增殖活性為指標的影響，考慮到A(溫度)、B(pH)、C(料液比)、D(酶解時間)和E(加酶量)這五個因素對指標的影響，每個因素設定四個水平進行L₁₆(4⁵)的(de)(de)(de)正交實驗。根據實驗結(jie)果(guo)比較五種酶(mei)在不同水解(jie)條(tiao)件下的(de)(de)(de)水解(jie)度和(he)抗腫(zhong)瘤活(huo)性(xing)，從而(er)確定(ding)原料(liao)的(de)(de)(de)最(zui)佳酶(mei)種及最(zui)佳的(de)(de)(de)酶(mei)解(jie)條(tiao)件。酶(mei)解(jie)工藝如下：首先將保存(cun)在-80℃的(de)(de)(de)沙蠶解(jie)凍后進行勻(yun)漿，用0.1mol/L的(de)(de)(de)HCL和(he)0.5mol/L的(de)(de)(de)NaOH溶液將勻(yun)漿液調到蛋(dan)白(bai)酶(mei)最(zui)適pH值(zhi)，再(zai)加入適量蛋(dan)白(bai)酶(mei)，在水浴(yu)鍋中進行酶(mei)解(jie)。酶(mei)解(jie)完(wan)成后，在100℃中滅活(huo)10min，使(shi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)失去活(huo)性(xing)。將酶(mei)解(jie)液12000r/min離心15min，取上清(qing)液測定(ding)氨基氮(ANN)含量，將其余酶(mei)解(jie)液冷(leng)凍干燥后測定(ding)酶(mei)解(jie)物的(de)(de)(de)抗腫(zhong)瘤活(huo)性(xing)。

1.3.1.1最(zui)佳蛋白酶種類的選擇

通過上(shang)述正交試驗結果可知，胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)、木瓜(gua)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)、堿性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)、中(zhong)性(xing)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)和胃(wei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)五種蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)解沙蠶(can)(can)的最(zui)佳酶(mei)(mei)(mei)解條件，在上(shang)述最(zui)佳酶(mei)(mei)(mei)解條件下(xia)，分別對沙蠶(can)(can)進行酶(mei)(mei)(mei)解，12000r/min條件下(xia)離(li)心得上(shang)清液，冷凍干燥后測定(ding)各種蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)解物的IR值選擇最(zui)佳蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)(mei)。

1.3.1.2沙蠶多(duo)肽的制備

將沙蠶全(quan)體洗干凈后(hou)進行勻漿，按照(zhao)最(zui)佳(jia)(jia)蛋白酶的最(zui)佳(jia)(jia)酶解(jie)條件對沙蠶進行酶解(jie)。酶解(jie)結(jie)束后(hou)在100℃下在水浴中(zhong)滅(mie)活(huo)10min。冷卻后(hou)在12000r/min在冷凍高(gao)速離(li)心(xin)機中(zhong)離(li)心(xin)15min后(hou)收集(ji)上清液(ye)，-20℃冰箱中(zhong)保(bao)存備用。

1.3.1.3酶解多肽的初(chu)步分離(li)

酶解獲得的上(shang)清液(ye)用超(chao)濾(lv)系統進行(xing)超(chao)濾(lv)分離，獲得了分子(zi)量(liang)(liang)(liang)1ku以下、1ku<分子(zi)量(liang)(liang)(liang)≤3ku、3ku<分子(zi)量(liang)(liang)(liang)≤5ku、5ku<分子(zi)量(liang)(liang)(liang)≤8ku以及8ku<分子(zi)量(liang)(liang)(liang)≤30ku的五種組分的活(huo)(huo)性(xing)(xing)組分，并命名為PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。將以上(shang)組分收(shou)集(ji)冷(leng)凍干燥后(hou)，經抗肺(fei)癌細(xi)胞A549細(xi)胞進行(xing)細(xi)胞增(zeng)殖(zhi)抑(yi)制活(huo)(huo)性(xing)(xing)篩選后(hou)，大量(liang)(liang)(liang)收(shou)集(ji)抗肺(fei)癌活(huo)(huo)性(xing)(xing)較(jiao)高的組分，濃縮(suo)冷(leng)凍干燥，-20℃冰(bing)箱中保存備用。

1.3.1.4沙蠶多肽經過(guo)陰(yin)離(li)子(zi)交換(huan)柱DEAE Sepharose Fast Flow層析(xi)分(fen)離(li)

將(jiang)(jiang)1.3.1.3步(bu)中得(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)抑制肺癌細(xi)胞A549增殖(zhi)活性最強的(de)(de)(de)(de)組分(fen)用(yong)陰離子柱DEAE Sepharose Fast Flow進(jin)一步(bu)分(fen)離。分(fen)離條件(jian)：0.2mM的(de)(de)(de)(de)Tris-HCl(pH 7.2)緩(huan)沖溶(rong)液平衡柱子后，將(jiang)(jiang)樣(yang)品(pin)配成250mg/mL，每次(ci)上(shang)(shang)樣(yang)量(liang)(liang)為(wei)(wei)2mL，每次(ci)上(shang)(shang)樣(yang)前(qian)過0.22μm的(de)(de)(de)(de)膜。分(fen)別(bie)用(yong)Tris-HCl(pH 7.2)與NaCl溶(rong)液(0～1mol/L)進(jin)行(xing)(xing)梯度洗脫(tuo)(tuo)，每個濃度洗脫(tuo)(tuo)一個柱體(ti)積，洗脫(tuo)(tuo)速度為(wei)(wei)5mL/min，在280nm進(jin)行(xing)(xing)檢測(ce)，分(fen)別(bie)收集各洗脫(tuo)(tuo)峰(feng)(feng)，并冷凍干燥，-20℃冰箱中保存(cun)備(bei)用(yong)。將(jiang)(jiang)干燥后得(de)到(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)各個峰(feng)(feng)組分(fen)采用(yong)MTT法(fa)進(jin)行(xing)(xing)A549細(xi)胞增殖(zhi)抑制率(lv)測(ce)定，確定目標肽所在的(de)(de)(de)(de)洗脫(tuo)(tuo)峰(feng)(feng)，并對該(gai)峰(feng)(feng)大量(liang)(liang)收集，冷凍干燥，作為(wei)(wei)進(jin)一步(bu)分(fen)離純化所用(yong)樣(yang)品(pin)。

1.3.1.5沙蠶多(duo)肽經過葡(pu)聚(ju)糖凝膠Sephadex G-25層析(xi)分離(li)

將上(shang)(shang)步中收(shou)集(ji)到(dao)的(de)增(zeng)殖活性最強(qiang)的(de)組分(fen)(fen)(fen)(fen)進行進一(yi)步分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)純(chun)化。將冷凍(dong)干(gan)燥的(de)樣品(pin)配置成(cheng)200mg/mL溶液(ye)(ye)，上(shang)(shang)樣量2mL。離(li)心取上(shang)(shang)清液(ye)(ye)，經(jing)0.22μm濾膜過(guo)(guo)濾后(hou)，將溶液(ye)(ye)過(guo)(guo)Sephadex G-25柱(zhu)進行層析分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)，以蒸(zheng)餾水(shui)為(wei)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)液(ye)(ye)將柱(zhu)平衡和(he)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)；調(diao)節洗脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)流(liu)速為(wei)1.1mL/min，每(mei)管(guan)收(shou)集(ji)3.5min，在(zai)280nm處檢測(ce)吸光度(du)，收(shou)集(ji)各峰分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)液(ye)(ye)，將其進行濃(nong)縮冷凍(dong)干(gan)燥。將干(gan)燥后(hou)得到(dao)的(de)各個峰組分(fen)(fen)(fen)(fen)采(cai)用MTT法進行A549細胞增(zeng)殖抑制率測(ce)定，確定目標肽(tai)所在(zai)的(de)洗脫(tuo)(tuo)(tuo)(tuo)峰，并(bing)對(dui)該峰大量收(shou)集(ji)，濃(nong)縮冷凍(dong)干(gan)燥，-20℃冰箱中冷凍(dong)備用。

1.3.1.6高效液相分離純化(hua)

將上(shang)步抑制A549細胞增殖最強的收(shou)集的峰分(fen)(fen)進(jin)(jin)一步的分(fen)(fen)離純(chun)化，反相(xiang)(xiang)高效液相(xiang)(xiang)純(chun)化色譜(pu)條(tiao)件：色譜(pu)柱(zhu)：ZORBAX SB-C18分(fen)(fen)析型色譜(pu)柱(zhu)(填料粒(li)徑5μm 4.6×150mm)；檢測波長：280nm；流(liu)(liu)速：0.5mL/min；流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)A為乙(yi)腈(jing)(含(han)0.05％三氟(fu)乙(yi)酸(suan))，流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)B為超純(chun)水(含(han)0.05％三氟(fu)乙(yi)酸(suan))，采用梯度洗脫(tuo)(tuo)方(fang)式(shi)(20％～100％A洗脫(tuo)(tuo)5～20min)，平衡時：流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)A與流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)B的流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)體(ti)積比為20：80；柱(zhu)溫：25℃；自動(dong)進(jin)(jin)樣，進(jin)(jin)樣量：10μL。

1.3.1.7目標肽(tai)的N端測(ce)序

使用氨(an)(an)基酸測(ce)序儀采用N端氨(an)(an)基酸測(ce)序法對純化的多肽的氨(an)(an)基酸序列進行測(ce)定(ding)，最終以PAP命名(ming)該活性(xing)多肽。

1.3.2細胞培養

將肺癌細胞A549和H1299在含有雙抗溶液(青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)以及10％胎牛血清的1640培養液中培養。置于37℃、含有5％CO₂的(de)培養箱中孵育，待長滿80％以上(shang)時用含0.25％的(de)胰(yi)蛋(dan)白酶進行消化傳(chuan)代，取處于對數生長期的(de)細胞進行實(shi)驗。

1.3.3抗肺癌(ai)細胞(bao)活性檢測

1.3.3.1 MTT法測定細胞抑(yi)制活性

配制實驗所需要的PBS緩沖液(PH值為7.2)、MTT、適量濃度的沙蠶酶解液。將人肺癌細胞每孔1×10⁵個/mL細(xi)(xi)胞(bao)數(shu)接(jie)種于96孔培養板(ban)中，每(mei)孔培養液(ye)200μL。常(chang)規(gui)條件下培養24小時(shi)后(hou)，分別設(she)置(zhi)正常(chang)對(dui)照(zhao)組(zu)、空白對(dui)照(zhao)組(zu)和(he)用藥組(zu)，每(mei)組(zu)設(she)定(ding)3～4個復孔，置(zhi)常(chang)規(gui)培養條件下培養一(yi)段時(shi)間(jian)，加入含有10％MTT的200μL的PBS緩沖溶液(ye)，在常(chang)規(gui)培養條件下孵育4小時(shi)。實驗畢(bi)，棄(qi)去96孔板(ban)中的液(ye)體，每(mei)孔加入150μL的DMSO，充分震(zhen)蕩10min。置(zhi)于酶標儀中，490nm處測定(ding)吸(xi)光值，計算(suan)(suan)細(xi)(xi)胞(bao)增(zeng)殖抑制率(IR)，計算(suan)(suan)公式如下：

式中：A₁為正常對照組的吸光度；A₂為用藥組的吸光度；A₀為空白對照組的(de)吸光度。

1.3.3.2倒置顯(xian)微鏡下觀察(cha)細胞形態

將濃度約為1×10⁵/mL的肺癌細(xi)胞A549細(xi)胞和H1299細(xi)胞接種于六(liu)孔板的載玻片(pian)上，在常(chang)規的培(pei)養(yang)條件下培(pei)養(yang)24小(xiao)時，使細(xi)胞長到80％左右(you)。棄去(qu)培(pei)養(yang)液，按(an)250mg/L、500mg/L、1000mg/L的藥(yao)物(wu)濃度加入到六(liu)孔板中，并設立空(kong)白對照(zhao)組，繼續培(pei)養(yang)24小(xiao)時，在倒置(zhi)顯(xian)微鏡(jing)下觀察(cha)并拍照(zhao)。1.3.3.3 AO/EB熒光染色觀察(cha)細(xi)胞形態

細胞(bao)接種與實驗分組同上。24h后，取(qu)蓋玻片(pian)，用95％乙醇固定30min。取(qu)AO和EB各(ge)1mg分別溶解于10mL pH 7.2的(de)PBS緩(huan)沖液(ye)中，搖勻混合(he)，現配現用，避(bi)光(guang)保存(cun)。觀察(cha)(cha)前于載玻片(pian)上滴加50μL PBS和6μL AO/EB混合(he)液(ye)，有細胞(bao)的(de)一面(mian)朝下，熒光(guang)顯微鏡下觀察(cha)(cha)并(bing)拍(pai)照(zhao)。

1.3.3.4 Hoechst 33258染(ran)色

通過Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞的凋亡過程中細胞的形態變化，實驗操作步驟如下所述，選取對數生長期的肺癌細胞株A549和H1299細胞制成約為1×10⁵/mL個單細胞懸液，均勻接種于六孔細胞培養板中，每孔約2mL，放置于37℃、5％CO₂細(xi)(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)條件下(xia)(xia)24h，分別給(gei)予(yu)不(bu)同濃度的250mg/L、500mg/L和(he)1000mg/L作(zuo)用(yong)(yong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，另外設置(zhi)(zhi)實驗空白對(dui)(dui)照組(zu)(zu)，繼(ji)續進(jin)行(xing)培養(yang)。24h后終止對(dui)(dui)各組(zu)(zu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的培養(yang)，每(mei)孔中給(gei)予(yu)4％多聚甲醛固定20min，然后再用(yong)(yong)PBS沖洗，用(yong)(yong)Hoechst 33258熒光染液(終濃度為0.5～10mg/L)常(chang)溫(wen)染色15min，再次用(yong)(yong)PBS沖洗，最(zui)后置(zhi)(zhi)于(yu)倒置(zhi)(zhi)熒光顯(xian)微鏡下(xia)(xia)觀察PAP作(zuo)用(yong)(yong)后的A549和(he)H1299細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的形態學變化并(bing)拍照。1.3.3.5流式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)儀分析細(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡率

A549細胞和H1299細胞約為1×10⁵/mL接(jie)種(zhong)于25mL的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)瓶中，常規培(pei)養(yang)(yang)(yang)24h后(hou)(hou)分別加入(ru)含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的(de)PAP的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)液(ye)繼(ji)續(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)，設立(li)空白對照(zhao)組。繼(ji)續(xu)培(pei)養(yang)(yang)(yang)24h后(hou)(hou)，參(can)照(zhao)凋(diao)亡(wang)試(shi)劑(ji)盒中的(de)操作(zuo)方(fang)法進行(xing)。胰蛋(dan)白酶消化，預冷的(de)PBS懸浮細胞，1000r/min離心5min。去上清，加入(ru)1×Annexin V結合液(ye)400μL吹(chui)打混(hun)勻(yun)。加入(ru)5μL Annexin V-FITC染(ran)液(ye)，混(hun)勻(yun)后(hou)(hou)避光孵育(yu)15min后(hou)(hou)，再(zai)加入(ru)10μL的(de)PI染(ran)液(ye)，室溫下暗室靜置5min后(hou)(hou)過200目(mu)篩(shai)子，再(zai)用流式細胞儀進行(xing)檢測。

1.3.3.6細胞線粒體(ti)膜電位的檢測

A549細胞和H1299細胞約為1×10⁵/mL接種在25mL的培養瓶中，常規培養24h后加入分別含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的PAP的培養液繼續培養，設立空白對照組。繼續培養24h后，細胞膜電位檢測參照試劑盒中的操作方法進行。培養結束，胰酶消化細胞轉移到離心管中，再用3mL PBS洗滌細胞兩次，1000r/min離心5min，收集細胞；取500μL 1×Incubation Buffer，加1μL的JC-1；吸取500μL的JC-1工作液將細胞懸浮，放置于37℃、5％CO₂條件下的細(xi)(xi)胞培養箱中孵育20min；1500r/min離(li)心5min并收集細(xi)(xi)胞，用1×Incubation Buffer懸浮細(xi)(xi)胞，重(zhong)復兩次；最后將用1×Incubation Buffer懸浮均(jun)勻的細(xi)(xi)胞過(guo)200目篩子，置于流式細(xi)(xi)胞儀進(jin)行檢(jian)測(ce)。

1.3.4數據處理

采用SPSS19.0統計軟件，對數據進行分析，結果以x±s表示(shi)。

2結果與分析

2.1最佳蛋白(bai)酶種類(lei)的選擇

Trypsin(胰蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Papain(木瓜蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Alcalase(堿性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Dispase(中性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))和(he)Pepsin(胃(wei)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))五種蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)在(zai)最(zui)佳(jia)(jia)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解條件(jian)(jian)下，分(fen)別(bie)對(dui)沙蠶(can)進行酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解，12000r/min條件(jian)(jian)下離心15min得(de)上清(qing)液(ye)，冷凍干燥(zao)后測定各種蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解物的IR值，結果如(ru)圖1所示，由圖1可知，Trypsin(胰蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Papain(木瓜蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Alcalase(堿性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))、Dispase(中性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))和(he)Pepsin(胃(wei)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei))五種蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解物對(dui)H1299細胞增殖的抑制率分(fen)別(bie)為56.67％、46.29％、62.07％、47.78％、60.51％，其活(huo)性(xing)大小順序(xu)為：Alcalase＞Pepsin＞Trypsin＞Dispase＞Papain。由此可見，在(zai)最(zui)佳(jia)(jia)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解條件(jian)(jian)下，堿性(xing)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)(mei)(mei)解物的抗肺癌(ai)的活(huo)性(xing)最(zui)強。

胰蛋(dan)白酶(mei)(mei)的最(zui)佳(jia)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)條(tiao)件為(wei)(wei)(wei)溫度為(wei)(wei)(wei)45℃、pH值(zhi)(zhi)為(wei)(wei)(wei)9、料(liao)(liao)液(ye)比(bi)為(wei)(wei)(wei)1:3、酶(mei)(mei)解(jie)(jie)時(shi)間(jian)為(wei)(wei)(wei)4h、加(jia)酶(mei)(mei)量(liang)為(wei)(wei)(wei)300U/g。木瓜蛋(dan)白酶(mei)(mei)的最(zui)佳(jia)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)條(tiao)件為(wei)(wei)(wei)：溫度為(wei)(wei)(wei)55℃、pH值(zhi)(zhi)為(wei)(wei)(wei)7、料(liao)(liao)液(ye)比(bi)為(wei)(wei)(wei)1:2、酶(mei)(mei)解(jie)(jie)時(shi)間(jian)為(wei)(wei)(wei)4h、加(jia)酶(mei)(mei)量(liang)為(wei)(wei)(wei)300U/g。中性蛋(dan)白酶(mei)(mei)的最(zui)佳(jia)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)條(tiao)件為(wei)(wei)(wei)：溫度為(wei)(wei)(wei)45℃、pH值(zhi)(zhi)為(wei)(wei)(wei)8、料(liao)(liao)液(ye)比(bi)為(wei)(wei)(wei)1:1、酶(mei)(mei)解(jie)(jie)時(shi)間(jian)為(wei)(wei)(wei)6h、加(jia)酶(mei)(mei)量(liang)為(wei)(wei)(wei)900U/g。胃蛋(dan)白酶(mei)(mei)的最(zui)佳(jia)酶(mei)(mei)解(jie)(jie)條(tiao)件為(wei)(wei)(wei)：溫度為(wei)(wei)(wei)35℃、pH值(zhi)(zhi)為(wei)(wei)(wei)1、料(liao)(liao)液(ye)比(bi)為(wei)(wei)(wei)1:1、酶(mei)(mei)解(jie)(jie)時(shi)間(jian)為(wei)(wei)(wei)8h、加(jia)酶(mei)(mei)量(liang)為(wei)(wei)(wei)300U/g。

2.1.1堿性(xing)蛋白(bai)酶正(zheng)交實驗結果

以(yi)溫度、pH值、料液比、時間和(he)加(jia)酶(mei)量為因素，以(yi)ANN和(he)IR值為測量指標進行正交實(shi)驗，考查了堿性蛋白(bai)酶(mei)酶(mei)解物在不同酶(mei)解條(tiao)件下的水解程(cheng)度和(he)抗腫瘤活性，其結(jie)果(guo)如表3。

表1堿性蛋白酶正交實驗設計及結果L₁₆(4⁵)

利用極差法對表1進行分析，比較極差R的大小可以看出，影響ANN值的的各因素的主次關系為：A＞B＞C＞E＞D。對于ANN值影響最大的因素是A(溫度)；此時的最佳酶解條件為A₂B₂C₂D₃E₃，即(ji)為(wei)：溫度(du)為(wei)40℃、pH值(zhi)為(wei)9、料液比(bi)為(wei)1:2、酶(mei)解時間為(wei)6h、加酶(mei)量為(wei)900U/g。

影響IR值的的各因素的主次關系為：C＞E＞A＞B＞D。對于IR值影響最大的因素是C(料液比)；此時的最佳酶解條件為A₄B₄C₁D₃E₁，即(ji)為(wei)(wei)(wei)：溫度(du)為(wei)(wei)(wei)50℃、pH值(zhi)為(wei)(wei)(wei)11、料液比為(wei)(wei)(wei)1:1、酶(mei)解時間為(wei)(wei)(wei)6h、加(jia)酶(mei)量為(wei)(wei)(wei)300U/g。

2.2沙蠶多肽(tai)的分離純(chun)化(hua)

2.2.1沙蠶多(duo)肽的超濾(lv)截留

將堿性蛋白酶(mei)酶(mei)解獲得的沙蠶多肽經超濾得到五個組分(fen)PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。采(cai)用MTT法得到對(dui)(dui)A549細(xi)胞(bao)的IR值，結果如圖2所示，PAP-2對(dui)(dui)A549細(xi)胞(bao)的增殖(zhi)抑(yi)制率最高。故選定PAP-2進行進一步分(fen)離純化。

2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow分離結果

將上述步驟得到的(de)(de)PAP-2經DEAE Sepharose Fast Flow分離(li)得到PAP-2-1、PAP-2-2、PAP-2-3、PAP-2-4四個(ge)洗脫峰如(ru)下圖3所示，以2000mg/L的(de)(de)濃(nong)度作用于(yu)A549細(xi)胞(bao)24h后(hou)的(de)(de)IR為14.1±2.7％、24.3±3％、41.9±1.5％、46.7±5.0％；4000mg/L對A549細(xi)胞(bao)的(de)(de)IR值則為28.0±3.0％、49.6±2.2％、79.3±4.1％、77.3±1.8％。故選定(ding)PAP-2-3進行進一步分離(li)純化。

2.2.3 Sephadex G-25分(fen)離結果

將上述(shu)步驟得到的(de)PAP-2-3經(jing)Sephadex G-25分(fen)離得到PAP-2-3-1、PAP-2-3-2兩(liang)個洗(xi)脫(tuo)峰如(ru)圖4所示(shi)，采用(yong)MTT法檢(jian)測對A549細(xi)胞(bao)的(de)抑制活(huo)(huo)性。結果顯示(shi)當兩(liang)個峰的(de)濃度(du)為1000mg/L時，兩(liang)個峰的(de)IR值分(fen)別是(shi)48.2±3.3％，74.4±2.4％；2000mg/L時，IR值分(fen)別為75.9±2.1％，95.1±1.8％。峰ⅡPAP-2-3-2的(de)活(huo)(huo)性最高，故用(yong)高效液相色(se)譜儀將峰PAP-2-3-2進一步的(de)分(fen)離純(chun)化(hua)。

2.2.4活(huo)性肽的純化及其N端氨基酸檢測結果

PAP-2-3-2經反(fan)相(xiang)高效液相(xiang)色譜洗(xi)(xi)脫(tuo)純(chun)化，當洗(xi)(xi)脫(tuo)時間分(fen)別為：4.296min、4.584min、4.968min、5.602min、6.075min時，出現如圖5所示的峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ、峰Ⅳ、峰V四(si)個洗(xi)(xi)脫(tuo)峰，收(shou)集(ji)峰V(PAP)，冷凍干燥備用。經檢測，該(gai)目標肽的氮端氨(an)基(ji)酸序列(lie)是Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe(SEQ ID No.1)。

2.3抗肺(fei)癌細胞活(huo)性(xing)研究

2.3.1PAP對A549細胞活性的影響

不同濃度PAP作用后對A549和H1299細胞活性的影響如圖6，圖7所示，當PAP濃度為250mg/L作用細胞24h時，A549和H1299細胞活性的抑制率分別為17.02％和13.08％，當PAP濃度增加至1000mg/L時，抑制率分別達到83.44％和85.3％，半數抑制濃度率(IC₅₀)分別為662mg/L、665mg/L；隨著作用時間的延長，作用48h時，IC₅₀分別為571mg/L、561mg/L；作用72h時，IC₅₀分別為487mg/L、486mg/L。隨著PAP濃(nong)度的(de)增加(jia)和作用時間的(de)延長，抑制指數(shu)明顯上升，與對照組相(xiang)比有(you)統計學意義(P<0.05)。

2.3.2倒(dao)置顯微鏡下(xia)觀察結果(guo)

結果如(ru)圖8、9所示，正(zheng)常組(zu)(zu)的(de)A549和H1299細(xi)(xi)胞生長良好，細(xi)(xi)胞間排列緊密(mi)，形態(tai)飽滿。PAP作用(yong)24h后，如(ru)250mg/L組(zu)(zu)A549和H1299細(xi)(xi)胞出現細(xi)(xi)胞間隙增(zeng)大，輪廓模糊(hu)，形態(tai)不規(gui)則；高濃度1000mg/L組(zu)(zu)細(xi)(xi)胞變(bian)圓(yuan)變(bian)亮，形態(tai)和正(zheng)常細(xi)(xi)胞有明顯的(de)區(qu)別，同時可見在(zai)培養液中懸浮(fu)著較多(duo)的(de)死細(xi)(xi)胞。

2.3.3 AO/EB熒光觀察結果觀察細胞形態

PAP作用(yong)于A549和H1299細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)24h后，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)經(jing)AO/EB染色(se)，出(chu)現(xian)(xian)(xian)了明(ming)(ming)顯的(de)早期(qi)凋亡的(de)形(xing)態(tai)學特征。實驗結果(guo)如圖10、11所示，正常對照組(zu)無明(ming)(ming)顯凋亡細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)出(chu)現(xian)(xian)(xian)，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)大(da)小均勻，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核形(xing)態(tai)規則，胞(bao)(bao)(bao)核及(ji)胞(bao)(bao)(bao)漿均呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)綠(lv)色(se)熒光(guang)；250mg/L組(zu)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)出(chu)現(xian)(xian)(xian)早期(qi)凋亡的(de)現(xian)(xian)(xian)象，胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)及(ji)胞(bao)(bao)(bao)核發生了變化，胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)出(chu)現(xian)(xian)(xian)空泡(pao)，并呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)強(qiang)黃(huang)綠(lv)色(se)熒光(guang)。隨著用(yong)藥濃度的(de)增加，1000mg/L組(zu)早期(qi)凋亡的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和晚期(qi)凋亡的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)明(ming)(ming)顯增多(duo)，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)核呈(cheng)固(gu)縮(suo)狀，呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)橘紅色(se)熒光(guang)。

2.3.4 Hoechst 33258染(ran)色檢(jian)測結果(guo)

Hoechst 33258染色可以(yi)用來觀察沙(sha)蠶(can)(can)多(duo)肽(tai)對(dui)肺癌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)A549和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡的(de)(de)形(xing)態學(xue)變(bian)化(hua)(hua)。如(ru)圖12、13所示，當不同濃(nong)度的(de)(de)沙(sha)蠶(can)(can)多(duo)肽(tai)作用于A549和H1299細(xi)(xi)胞(bao)(bao)24h后(hou)，可以(yi)看到空白(bai)對(dui)照組(zu)呈(cheng)(cheng)現均(jun)勻的(de)(de)藍(lan)(lan)色熒光(guang)，沙(sha)蠶(can)(can)多(duo)肽(tai)作用后(hou)，可以(yi)看見細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)染色質聚集(ji)及邊(bian)集(ji)化(hua)(hua)明(ming)顯(xian)，而且藍(lan)(lan)色的(de)(de)熒光(guang)變(bian)亮，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)核斷裂皺縮呈(cheng)(cheng)現出(chu)塊狀或(huo)點狀的(de)(de)藍(lan)(lan)色熒光(guang)，視野中細(xi)(xi)胞(bao)(bao)數明(ming)顯(xian)減少，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)形(xing)態學(xue)的(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)隨著(zhu)藥物濃(nong)度的(de)(de)增加也顯(xian)得越(yue)明(ming)顯(xian)。

2.3.5流(liu)式細胞術(shu)檢測結果

本實驗采用(yong)(yong)Annexin V-FITC/PI雙染的(de)方(fang)法檢測細(xi)(xi)胞(bao)早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)率(lv)(lv)。以(yi)(yi)FITC和PI熒光作(zuo)雙參(can)數點圖，細(xi)(xi)胞(bao)分(fen)成4個區(qu)：左下象(xiang)限(xian)(xian)(xian)(LL)代表正常細(xi)(xi)胞(bao)；左上象(xiang)限(xian)(xian)(xian)(UL)代表機械損傷細(xi)(xi)胞(bao)；右下象(xiang)限(xian)(xian)(xian)(LR)為(wei)早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)細(xi)(xi)胞(bao)；右上象(xiang)限(xian)(xian)(xian)(UR)為(wei)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)晚期(qi)(qi)或(huo)壞死細(xi)(xi)胞(bao)。如圖14所(suo)示，對照(zhao)組A549細(xi)(xi)胞(bao)基本分(fen)布在(zai)LL區(qu)域(yu)，早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)率(lv)(lv)為(wei)7.52％，但(dan)以(yi)(yi)不同濃(nong)度(du)的(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)后(hou)，早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)細(xi)(xi)胞(bao)明顯增(zeng)多，當PAP濃(nong)度(du)達到(dao)1000mg/L時，早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)率(lv)(lv)達到(dao)33.44％。從圖15中可見，加(jia)以(yi)(yi)不同濃(nong)度(du)的(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)于H1299細(xi)(xi)胞(bao)24h后(hou)，LR早(zao)區(qu)域(yu)的(de)早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)細(xi)(xi)胞(bao)數量增(zeng)多，隨用(yong)(yong)藥濃(nong)度(du)的(de)增(zeng)加(jia)，H1299細(xi)(xi)胞(bao)的(de)早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)率(lv)(lv)也隨之增(zeng)加(jia)。當PH濃(nong)度(du)達到(dao)1000mg/L時，細(xi)(xi)胞(bao)早(zao)期(qi)(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)率(lv)(lv)達到(dao)44.42％。

2.3.6細(xi)胞中線粒體膜(mo)電位(wei)的變化結果

細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內線粒體對JC-1染料的(de)(de)攝取依賴(lai)于(yu)線粒體的(de)(de)膜(mo)電位(wei)，正常情況下(xia)(xia)A549細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)線粒體的(de)(de)膜(mo)電位(wei)比較高，呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)出紅色熒(ying)光。當細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)受到損傷后，線粒體的(de)(de)膜(mo)電位(wei)就會下(xia)(xia)降(jiang)，出現(xian)(xian)(xian)由紅色熒(ying)光向綠(lv)色熒(ying)光的(de)(de)轉變。當PAP作(zuo)用A549細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)24h后，如圖(tu)16所示，右(you)上象限表(biao)示為正常線粒體膜(mo)電位(wei)所占(zhan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)百(bai)分率(lv)，右(you)下(xia)(xia)象限則(ze)為線粒體膜(mo)電位(wei)降(jiang)低(di)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)百(bai)分率(lv)。如實(shi)驗結果(guo)顯(xian)示，250mg/L組(zu)可(ke)使(shi)(shi)(shi)4.91％的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)呈(cheng)綠(lv)色熒(ying)光(即膜(mo)電位(wei)降(jiang)低(di))，500mg/L、1000mg/L組(zu)分別可(ke)使(shi)(shi)(shi)12.91％、26.69％的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)綠(lv)色熒(ying)光。當PAP作(zuo)用H1299細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)24h后，如圖(tu)17所示，250mg/L組(zu)可(ke)使(shi)(shi)(shi)8.58％的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)呈(cheng)綠(lv)色熒(ying)光(即膜(mo)電位(wei)降(jiang)低(di))，500mg/L、1000mg/L組(zu)分別可(ke)使(shi)(shi)(shi)11.51％、22.69％的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)呈(cheng)現(xian)(xian)(xian)綠(lv)色熒(ying)光。

3討論

本發明使用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種酶，以細胞增殖抑制率IR為指標，確定沙蠶多肽的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。為確定堿性蛋白酶的適宜酶解條件范圍，試驗以酶解物ANN含量為指標，對每個因素分別進行試驗，根據單因素試驗結果設計正交試驗。通過L₁₆(4⁵)正交實驗優化酶解工藝，得到沙(sha)蠶多肽的關鍵技術是溫(wen)度為(wei)(wei)50℃、pH值(zhi)為(wei)(wei)11、料(liao)液(ye)比為(wei)(wei)1:1、酶解時(shi)間為(wei)(wei)6h、氨(an)基(ji)酸(suan)序(xu)列為(wei)(wei)Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。

本發明采用MTT法對PAP對A549和H1299細胞的增殖抑制活性進行了檢測，實驗結果表明，沙蠶多肽對于A549和H1299細胞的抑制活性具有時間和劑量依賴關系，即隨著PAP濃度的增加和時間的延長，細胞的抑制率明顯上升。當濃度為1000mg/L的PAP作用于A549細胞72h后，IR值達到95.08％，IC₅₀為487mg/L；作用于H1299細胞72h后，IR值達到91.36％，IC₅₀為486mg/L。

細(xi)胞(bao)在形態(tai)(tai)學(xue)上(shang)的特(te)征性改變(bian)是(shi)證明(ming)其發(fa)生凋亡(wang)的有力(li)證據。通過倒置(zhi)顯微鏡(jing)、熒光染色實(shi)驗的變(bian)化可(ke)以(yi)很直觀地(di)看(kan)到細(xi)胞(bao)早期凋亡(wang)的形態(tai)(tai)學(xue)上(shang)變(bian)化。在本發(fa)明(ming)中(zhong)，通過細(xi)胞(bao)形態(tai)(tai)學(xue)實(shi)驗，觀察到PAP作用后(hou)，A549和H1299細(xi)胞(bao)表現出明(ming)顯的細(xi)胞(bao)形態(tai)(tai)學(xue)變(bian)化，如(ru)細(xi)胞(bao)間隙(xi)變(bian)大、形態(tai)(tai)不規則、體積變(bian)小(xiao)、部分細(xi)胞(bao)出現空泡及(ji)凋亡(wang)小(xiao)體等(deng)，隨(sui)濃度增(zeng)加效果更(geng)加顯著。

細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)是一(yi)種由(you)(you)基因調控的(de)(de)(de)高度保守的(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)主動死亡(wang)(wang)(wang)過程，在(zai)多細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)有機(ji)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)生長發(fa)育、維(wei)持組織同源性等過程中起重要作(zuo)用(yong)(yong)(yong)。線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)下降(jiang)(jiang)是凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)的(de)(de)(de)早(zao)期(qi)表現(xian)，一(yi)旦線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)損耗,細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)就會(hui)進(jin)入不可逆的(de)(de)(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)過程。通(tong)過流式細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)儀對細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)早(zao)期(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)和(he)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)進(jin)行檢(jian)查(cha)發(fa)現(xian)，250mg/L的(de)(de)(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)(yong)于肺(fei)癌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)A549 24h后(hou)，早(zao)期(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)7.52％，線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)出(chu)現(xian)小(xiao)幅下降(jiang)(jiang)，而(er)(er)1000mg/L的(de)(de)(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)(yong)后(hou)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)達到33.44％，下降(jiang)(jiang)率(lv)(lv)(lv)達到26.69％。250mg/L的(de)(de)(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)(yong)于肺(fei)癌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)H1299 24h后(hou)，早(zao)期(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)4.18％，線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)出(chu)現(xian)小(xiao)幅下降(jiang)(jiang)，而(er)(er)1000mg/L的(de)(de)(de)PAP作(zuo)用(yong)(yong)(yong)后(hou)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)達到39.95％，下降(jiang)(jiang)率(lv)(lv)(lv)達到22.91％。細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)早(zao)期(qi)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)率(lv)(lv)(lv)和(he)，線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)膜(mo)電(dian)(dian)位(wei)下降(jiang)(jiang)所占(zhan)百分率(lv)(lv)(lv)都隨藥物(wu)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)濃(nong)度增加明顯(xian)增加，由(you)(you)此推測肺(fei)癌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)A549和(he)H1299的(de)(de)(de)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)與(yu)線(xian)粒(li)體(ti)(ti)(ti)凋(diao)(diao)亡(wang)(wang)(wang)信(xin)號(hao)通(tong)路有關。

總之，經堿性蛋白酶提取(qu)的沙蠶多肽PAP在體外可以有效抑制A549和H1299細胞(bao)的增(zeng)殖，并(bing)具有劑(ji)量和時間依賴性，作用24h后A549和H1299細胞(bao)即表現(xian)出(chu)明顯的細胞(bao)凋亡(wang)特征。

以(yi)上所述(shu)的(de)實施例只是(shi)本(ben)發明的(de)一(yi)種較佳(jia)的(de)方(fang)案，并非對本(ben)發明作任(ren)何形式上的(de)限制，在不(bu)超出權利要求(qiu)所記載(zai)的(de)技術方(fang)案的(de)前提下還有(you)其(qi)它(ta)的(de)變體(ti)及改型(xing)。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋(yang)大學(xue)

<120> 一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備(bei)方法

<130> 2016.11

<160> 1

<170> PatentIn version  3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 雙齒圍沙(sha)蠶

<400> 1

Ile Glu Pro Gly Thr Val Gly Met Met Phe

1 5 10