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一種米卡芬凈母核FR179642的制備方法與流程

文(wen)檔序(xu)號(hao):12412471閱讀(du):970來源:國知(zhi)局

本發(fa)明涉(she)及生物制藥技(ji)術領(ling)域,尤(you)其涉(she)及一種米卡芬凈母核FR179642的(de)制備方(fang)法。



背景技術:

近年來,隨(sui)著廣(guang)譜抗菌(jun)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)和免疫(yi)(yi)抑制(zhi)劑的(de)(de)(de)(de)(de)大量應(ying)用、腫(zhong)瘤化療、器官移植以(yi)及(ji)艾滋病的(de)(de)(de)(de)(de)蔓延等,導致免疫(yi)(yi)系統受到(dao)抑制(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)群不斷(duan)增多,深部真(zhen)菌(jun)感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)(de)發病率開(kai)始呈現明(ming)顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)上升趨勢(shi),且隨(sui)著抗真(zhen)菌(jun)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)運用,真(zhen)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)(de)耐藥(yao)(yao)性(xing)也越來越強,使得抗真(zhen)菌(jun)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)用有迅(xun)猛增加的(de)(de)(de)(de)(de)趨勢(shi)。因此,抗深部真(zhen)菌(jun)感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)已成為抗感(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)研究熱點之一,日益(yi)引起人(ren)們的(de)(de)(de)(de)(de)關注。

棘(ji)白菌(jun)素(su)是一(yi)類新(xin)型(xing)的(de)抗(kang)真(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)藥(yao),與目前臨(lin)床(chuang)常用(yong)(yong)抗(kang)真(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)藥(yao)物的(de)作(zuo)用(yong)(yong)機(ji)制明顯不同(tong),是β-1,3-葡聚糖合成酶的(de)抑制劑,作(zuo)用(yong)(yong)于(yu)真(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)的(de)細(xi)胞(bao)壁(bi)。細(xi)胞(bao)壁(bi)是真(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)與哺乳動(dong)物細(xi)胞(bao)之間最大的(de)差別,所以(yi)干(gan)擾細(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)合成,影響細(xi)胞(bao)壁(bi)的(de)完整性將(jiang)導致(zhi)真(zhen)(zhen)(zhen)(zhen)菌(jun)細(xi)胞(bao)死亡而對人無傷害,因此副作(zuo)用(yong)(yong)較小,安全性較高。

米卡芬凈是一種水溶性半合成棘白菌素類抗真菌藥物,而FR179642是合成米卡芬凈母核,CAS登錄號:168110-44-9,化學式:C35H52N8O20S,分子量:936.90。FR179642的化學結構(gou)式如下所示:

目(mu)前,有(you)關(guan)FR179642合成或(huo)者制備(bei)方面的(de)報(bao)道僅見于公開號KR20140039753(A)的(de)韓國發(fa)明(ming)專利(li)中。其通過中間體FR901379經脫乙酰(xian)基反應,并以FR901379為起(qi)始物制備(bei)FR179642。具體的(de)制備(bei)路(lu)線如下所示:

但是,上述現有(you)技(ji)術存在(zai)制備成(cheng)本高(gao)的(de)缺陷。同(tong)時,現有(you)技(ji)術中尚無針對FR179642發酵制備的(de)相關報道(dao),屬于目前業界的(de)空白技(ji)術。



技術實現要素:

本發明的目的在于公開一(yi)種米卡芬凈母核FR179642的制備方法,

為實現(xian)上(shang)述發(fa)(fa)明(ming)目的,本發(fa)(fa)明(ming)提供了米卡芬凈(jing)母核(he)FR179642的制備方法(fa),包括以(yi)下(xia)步(bu)驟:

步驟(1)、取(qu)少量米卡芬凈母核FR179642產生菌孢子(zi)(zi)懸液(ye),接種于(yu)(yu)種子(zi)(zi)培養(yang)基上,于(yu)(yu)24~28℃下,培養(yang)40~50h;

步驟(zou)(2)、將(jiang)種子培養基(ji)接(jie)種于(yu)發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)罐內并添(tian)加發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)培養基(ji),當(dang)發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)罐內的菌濃達到穩定狀態(tai)后添(tian)加米(mi)卡(ka)芬(fen)凈(jing)前體(ti)FR901379,繼續發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)40~60h后補(bu)加米(mi)卡(ka)芬(fen)凈(jing)前體(ti)FR901379,所述步驟(zou)(2)中采用雙階段溫(wen)控,發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)完成進行放罐以提取發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)液;

步(bu)驟(3)、向發酵液中添加(jia)(jia)酸使(shi)發酵液的(de)pH呈(cheng)3~4,板(ban)框(kuang)過(guo)濾,然后添加(jia)(jia)極性(xing)溶(rong)劑進行抽提(ti)濃縮,得濃縮液;

步驟(zou)(4)、將濃縮液經大(da)孔(kong)樹脂(zhi)吸附,使用極性溶劑(ji)解(jie)析,得到米(mi)卡(ka)芬凈母(mu)核FR179642解(jie)析液;

步驟(5)、將(jiang)米卡芬凈母(mu)核FR179642解析液(ye)經結晶,干(gan)燥(zao),得呈粉(fen)末狀的(de)米卡芬凈母(mu)核FR179642。

作為(wei)本發明的進一(yi)步(bu)(bu)改進,所述步(bu)(bu)驟(1)中的種(zhong)子培養基的組分(fen)為(wei):葡萄糖20~35g/L,酵母粉(fen)5~15g/L,黃(huang)豆餅粉(fen)5~15g/L,磷酸(suan)(suan)氫二鉀0.5~1.5g/L,氯化(hua)鈉(na)0.1~1.0g/L,硫酸(suan)(suan)鎂0.1~1.0g/L,碳酸(suan)(suan)鈣(gai)0.1~0.5g/L,余量為(wei)水(shui)。

作為本(ben)發明的(de)進一步(bu)改進,所述步(bu)驟(zou)(2)中的(de)發酵培(pei)養基的(de)組分為:葡萄糖5~15g/L,酵母(mu)粉70~90g/L,黃豆餅粉6~10g/L,磷(lin)酸氫二鉀1~5g/L,氯化鈉1~5g/L,硫(liu)酸鎂0.2~0.4g/L,碳酸鈣0.1~0.5g/L,余(yu)量為水。

作(zuo)為(wei)本發明的(de)進一步(bu)改進,所述步(bu)驟(2)中(zhong),發酵罐中(zhong)的(de)米(mi)卡芬凈(jing)前體FR901379的(de)濃度穩定(ding)在500~2000μg/mL之(zhi)間。

作為本(ben)發(fa)明的(de)進一步(bu)(bu)改進,所述步(bu)(bu)驟(2)中,所述步(bu)(bu)驟(2)中,自初始狀態(tai)到(dao)發(fa)酵罐內(nei)(nei)(nei)的(de)菌(jun)濃(nong)達到(dao)穩定狀態(tai)的(de)發(fa)酵階段(duan)中,發(fa)酵罐內(nei)(nei)(nei)的(de)溫度(du)控制在30~34℃;發(fa)酵罐內(nei)(nei)(nei)的(de)菌(jun)濃(nong)達到(dao)穩定狀態(tai)至放罐階段(duan)中,發(fa)酵罐內(nei)(nei)(nei)的(de)溫度(du)控制在26~30℃。

作為本發明(ming)的(de)進一步改進,所述(shu)步驟(zou)(3)中的(de)酸(suan)(suan)選(xuan)自(zi)濃(nong)度為5~10wt%的(de)稀硫(liu)酸(suan)(suan)、5~10wt%的(de)稀硫(liu)酸(suan)(suan)或者5~10wt%的(de)稀磷酸(suan)(suan)。

作為本發(fa)明的(de)(de)進一步(bu)改(gai)進,所述(shu)步(bu)驟(4)中(zhong)的(de)(de)極性溶劑(ji)選自C1~C4的(de)(de)醇;所述(shu)步(bu)驟(4)中(zhong)的(de)(de)大孔(kong)樹(shu)(shu)脂選自HP20大孔(kong)樹(shu)(shu)脂、D1300大孔(kong)樹(shu)(shu)脂或者SP207大孔(kong)樹(shu)(shu)脂。

作為(wei)本發明的進(jin)一步改(gai)進(jin),所述步驟(5)中的結晶方式(shi)為(wei)溶劑沉降結晶或者(zhe)濃縮結晶。

作為本發明(ming)的進(jin)一步(bu)改(gai)進(jin),所述溶(rong)(rong)劑(ji)沉降結晶所使用的溶(rong)(rong)劑(ji)選(xuan)自石油醚(mi)、正己(ji)烷(wan)或者環己(ji)烷(wan)。

作為(wei)本(ben)發明的(de)(de)進一步改進,所(suo)述(shu)步驟(5)中的(de)(de)干(gan)(gan)(gan)燥(zao)(zao)方式為(wei)真(zhen)(zhen)空干(gan)(gan)(gan)燥(zao)(zao),真(zhen)(zhen)空干(gan)(gan)(gan)燥(zao)(zao)的(de)(de)干(gan)(gan)(gan)燥(zao)(zao)溫(wen)度為(wei)40~50℃,真(zhen)(zhen)空度為(wei)0.1~0.5MPa。

與現有技術相比,本(ben)發明的(de)有益(yi)效果是:在(zai)本(ben)發明中(zhong),米(mi)卡芬(fen)(fen)凈母(mu)(mu)核(he)FR179642菌(jun)株在(zai)培養基中(zhong)發酵,在(zai)發酵過程中(zhong)分(fen)兩次添(tian)加(jia)米(mi)卡芬(fen)(fen)凈前體FR901379并(bing)通過多階段控(kong)溫的(de)方法,提高了米(mi)卡芬(fen)(fen)凈母(mu)(mu)核(he)FR179642的(de)產量;發酵液經(jing)酸化破壁處理(li),用有機溶劑(ji)提取,大孔樹(shu)脂吸(xi)附解(jie)析(xi)得解(jie)析(xi)液,再(zai)由(you)解(jie)析(xi)液通過結晶得到米(mi)卡芬(fen)(fen)凈母(mu)(mu)核(he)粉末(mo)。本(ben)發明能夠得用于合成米(mi)卡芬(fen)(fen)凈母(mu)(mu)核(he)FR179642,并(bing)且(qie)操(cao)作(zuo)程序簡單,方法穩定,重(zhong)現性(xing)好(hao)。

具體實施方式

下面結(jie)合各實施方式(shi)對本發明(ming)(ming)進行(xing)詳細說明(ming)(ming),但應當說明(ming)(ming)的(de)是,這些(xie)實施方式(shi)并非對本發明(ming)(ming)的(de)限制(zhi),本領(ling)域普通(tong)技術(shu)人(ren)員根(gen)據這些(xie)實施方式(shi)所作的(de)功能、方法、或者結(jie)構上的(de)等效變換或替代,均屬于本發明(ming)(ming)的(de)保護(hu)范圍之(zhi)內。

除(chu)非(fei)說明(ming)書中(zhong)有特(te)殊說明(ming),本(ben)發明(ming)中(zhong)的各(ge)個實施例(li)中(zhong)的組(zu)分(fen)(fen)、原(yuan)料均(jun)采用分(fen)(fen)析純級別。另外(wai),各(ge)實施例(li)中(zhong)的“g”為(wei)(wei)(wei)重量單(dan)(dan)位(wei)“克”;“h”為(wei)(wei)(wei)時間(jian)單(dan)(dan)位(wei)“小(xiao)時”;“ml”為(wei)(wei)(wei)體(ti)積單(dan)(dan)位(wei)“毫(hao)升(sheng)”;“室溫”為(wei)(wei)(wei)23℃;“BV/H”:空間(jian)流(liu)速(su)的表示,即(ji)是指柱內單(dan)(dan)位(wei)時間(jian)(小(xiao)時)流(liu)經(jing)單(dan)(dan)位(wei)體(ti)積樹脂平均(jun)液(ye)量。“HPLC”:高效液(ye)相色(se)譜法。

實施例一:

該(gai)米卡芬凈母核FR179642的制備方法,包(bao)括以下步(bu)驟。

步驟(1)、取(qu)少量米卡芬(fen)凈母(mu)核FR179642產生菌孢子懸液(ye),接種(zhong)(zhong)于(yu)種(zhong)(zhong)子培(pei)(pei)養(yang)基(ji)上,于(yu)24℃下,培(pei)(pei)養(yang)50h。該種(zhong)(zhong)子培(pei)(pei)養(yang)基(ji)中的組(zu)分為(單(dan)位:g/L):葡(pu)萄糖20,酵母(mu)粉5,黃豆(dou)餅粉5,磷酸氫二鉀0.5,氯化鈉0.1,硫酸鎂(mei)0.1,碳酸鈣0.1,余量為水(shui)。

步驟(2)、將種子(zi)培(pei)(pei)養(yang)基接種于發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)并添加發(fa)(fa)(fa)酵培(pei)(pei)養(yang)基,于24~28℃下培(pei)(pei)養(yang)60~70h。當發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的菌(jun)濃達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀(zhuang)態后(hou)添加米卡芬凈(jing)前(qian)體(ti)FR901379,繼續(xu)發(fa)(fa)(fa)酵40h后(hou),補加米卡芬凈(jing)前(qian)體(ti)FR901379。在(zai)這(zhe)兩個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵階段(duan)中(zhong),自初始狀(zhuang)態到(dao)發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的菌(jun)濃達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀(zhuang)態的第(di)(di)一個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵階段(duan),發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的溫(wen)度(du)控(kong)制在(zai)30℃。自發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的菌(jun)濃達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀(zhuang)態至放罐(guan)(guan)的第(di)(di)二個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵階段(duan)中(zhong),發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的溫(wen)度(du)控(kong)制在(zai)26℃。該發(fa)(fa)(fa)酵培(pei)(pei)養(yang)基中(zhong)的組分為(wei)(單位(wei):g/L):葡萄糖(tang)5,酵母(mu)粉(fen)70,黃豆餅粉(fen)6,磷酸氫二鉀1,氯化(hua)鈉1,硫酸鎂0.2,碳酸鈣0.1,余量(liang)為(wei)水。在(zai)本實施例中(zhong),在(zai)第(di)(di)二個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵階段(duan)中(zhong),發(fa)(fa)(fa)酵罐(guan)(guan)內(nei)(nei)(nei)的米卡芬凈(jing)前(qian)體(ti)FR901379的濃度(du)穩(wen)(wen)定(ding)在(zai)500μg/mL左(zuo)右。

步驟(zou)(3)、發(fa)酵(jiao)(jiao)完成進行放罐后(hou)提取。提取發(fa)酵(jiao)(jiao)液(ye)時,先向發(fa)酵(jiao)(jiao)罐中添加(jia)濃(nong)度為5wt%的稀硫酸(suan),以使發(fa)酵(jiao)(jiao)罐內(nei)發(fa)酵(jiao)(jiao)液(ye)的體(ti)系(xi)酸(suan)化至pH呈3,過板框后(hou),加(jia)甲醇(chun)作為極性溶劑(ji)抽提濃(nong)縮,得米卡芬凈(jing)母(mu)核FR179642濃(nong)縮液(ye)。

步驟(zou)(4)、將米卡(ka)芬凈母核(he)FR179642濃縮液使(shi)用裝(zhuang)填有HP20的大孔樹脂吸附(fu)柱進行(xing)吸附(fu)。吸附(fu)流(liu)速(su)控制(zhi)0.5~1.5BV/H,吸附(fu)完成(cheng)后水洗,用濃度為60wt%甲醇作為極性溶劑進行(xing)解(jie)析,解(jie)析流(liu)速(su)1~2BV/H,合(he)并(bing)有效組分,得到米卡(ka)芬凈母核(he)FR179642解(jie)析液。

步驟(5)、米卡芬凈母核FR179642解析液結晶(jing)(jing),干(gan)燥(zao)(zao),得呈粉狀(zhuang)的米卡芬凈母核FR179642。本(ben)實施例中(zhong),結晶(jing)(jing)方式(shi)為(wei)濃縮結晶(jing)(jing),結晶(jing)(jing)溫(wen)度為(wei)40℃。干(gan)燥(zao)(zao)方式(shi)為(wei)真(zhen)空(kong)干(gan)燥(zao)(zao),干(gan)燥(zao)(zao)溫(wen)度40℃,真(zhen)空(kong)干(gan)燥(zao)(zao)的真(zhen)空(kong)度為(wei)0.1MPa。

本實施例所制得的米卡芬(fen)凈母核FR179642經HPLC檢(jian)測,歸一(yi)化純度85.5%。

實施例二:

該米卡芬凈(jing)母核FR179642的制備方法,包括以下步驟。

步驟(1)、取少(shao)量米卡芬凈母(mu)核FR179642產生(sheng)菌孢子(zi)懸液,接種于(yu)種子(zi)培(pei)(pei)養基上,于(yu)28℃下,培(pei)(pei)養40h。該種子(zi)培(pei)(pei)養基中的組分(fen)為(單位(wei):g/L):葡萄糖35,酵母(mu)粉15,黃豆餅粉15,磷酸氫二(er)鉀1.5,氯化鈉1.0,硫(liu)酸鎂1.0,碳(tan)酸鈣0.5,余量為水。

步驟(2)、將(jiang)種(zhong)子培養(yang)(yang)基(ji)(ji)接(jie)種(zhong)于發酵罐并添加發酵培養(yang)(yang)基(ji)(ji),于24~28℃下培養(yang)(yang)60~70h。

當發(fa)(fa)酵罐內(nei)(nei)的(de)(de)菌濃達(da)到(dao)(dao)穩(wen)定(ding)狀態(tai)(tai)后添(tian)加米卡(ka)芬凈前(qian)體(ti)FR901379,繼(ji)續發(fa)(fa)酵60h后,補加米卡(ka)芬凈前(qian)體(ti)FR901379。在這兩個(ge)發(fa)(fa)酵階(jie)段中(zhong)(zhong),自初始狀態(tai)(tai)到(dao)(dao)發(fa)(fa)酵罐內(nei)(nei)的(de)(de)菌濃達(da)到(dao)(dao)穩(wen)定(ding)狀態(tai)(tai)的(de)(de)第一個(ge)發(fa)(fa)酵階(jie)段,發(fa)(fa)酵罐內(nei)(nei)的(de)(de)溫(wen)度(du)(du)控制在31℃。自發(fa)(fa)酵罐的(de)(de)菌濃達(da)到(dao)(dao)穩(wen)定(ding)狀態(tai)(tai)至放罐的(de)(de)第二個(ge)發(fa)(fa)酵階(jie)段中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)酵罐內(nei)(nei)的(de)(de)溫(wen)度(du)(du)控制在27℃。該發(fa)(fa)酵培養(yang)基組分中(zhong)(zhong)的(de)(de)組分為(wei)(單位:g/L):葡萄糖15,酵母粉90,黃豆餅粉10,磷酸(suan)氫二鉀5,氯化(hua)鈉5,硫酸(suan)鎂0.4,碳酸(suan)鈣(gai)0.5,余量(liang)為(wei)水。在本(ben)實施(shi)例中(zhong)(zhong),在第二個(ge)發(fa)(fa)酵階(jie)段中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)酵罐內(nei)(nei)的(de)(de)米卡(ka)芬凈前(qian)體(ti)濃度(du)(du)穩(wen)定(ding)在2000μg/mL左右。

步驟(3)、發(fa)酵完成進行放罐后(hou)提取。提取發(fa)酵液時,先向發(fa)酵罐中添(tian)加(jia)濃度為5wt%的稀鹽酸,以(yi)使發(fa)酵罐內(nei)發(fa)酵液的體系酸化至pH呈3,過(guo)板(ban)框后(hou),加(jia)乙醇作(zuo)為極性溶劑(ji)進行抽提濃縮(suo),得米(mi)卡芬凈母(mu)核(he)FR179642濃縮(suo)液。

步驟(zou)(4)、將濃(nong)縮液(ye)使用裝填有SP207的(de)大孔樹脂吸附柱進(jin)行(xing)(xing)吸附。吸附流(liu)速控制0.5~1.5BV/H,吸附完成后水洗(xi),用濃(nong)度為60wt%的(de)乙醇作為極性溶劑進(jin)行(xing)(xing)解析(xi),解析(xi)流(liu)速1~2BV/H,合并有效組(zu)分,得到米卡芬(fen)凈母核FR179642解析(xi)液(ye)。

步驟(5)、將米(mi)卡芬凈母核FR179642解析液結(jie)晶,干燥,得到呈(cheng)粉(fen)狀的(de)米(mi)卡芬凈母核FR179642。結(jie)晶方式(shi)為(wei)50℃濃(nong)縮結(jie)晶。干燥方式(shi)為(wei)真空(kong)干燥,,干燥溫度(du)50℃,真空(kong)度(du)為(wei)0.5MPa。

本實施例(li)所(suo)制得的米卡芬凈母核FR179642經(jing)HPLC檢測(ce),歸一化純度85.7%。

實施例三:

該米卡芬凈母核FR179642的制備方法,包括(kuo)以下步驟(zou)。

步驟(zou)(1)、取少(shao)量(liang)的米卡芬凈(jing)母核FR179642產(chan)生菌孢子懸(xuan)液,接(jie)種于培養(yang)(yang)基上,于26℃下,培養(yang)(yang)48h。該種子培養(yang)(yang)基中的組分為(單(dan)位:g/L):葡(pu)萄糖25,酵母粉10,黃豆餅粉10,磷酸氫二鉀(jia)1,氯化鈉(na)0.5,硫(liu)酸鎂(mei)0.5,碳酸鈣0.2,余(yu)量(liang)為水。

步(bu)驟(zou)(2)、將種子(zi)培(pei)養(yang)基接種于(yu)發酵罐并添加發酵培(pei)養(yang)基,于(yu)24~28℃下培(pei)養(yang)60~70h。

當發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)菌(jun)濃(nong)達(da)到穩定(ding)狀態(tai)(tai)后(hou)添(tian)加米(mi)卡芬(fen)(fen)凈前體FR901379。繼續發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)50h后(hou),補加米(mi)卡芬(fen)(fen)凈前體FR901379。在(zai)(zai)這兩(liang)個(ge)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),自初(chu)始狀態(tai)(tai)到發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)菌(jun)濃(nong)達(da)到穩定(ding)狀態(tai)(tai)的(de)第(di)一個(ge)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan),發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)溫度(du)(du)控(kong)制(zhi)在(zai)(zai)33℃。自發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)菌(jun)濃(nong)達(da)到穩定(ding)狀態(tai)(tai)至放(fang)罐(guan)的(de)第(di)二(er)個(ge)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)溫度(du)(du)控(kong)制(zhi)在(zai)(zai)28℃。該發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)培(pei)養(yang)基中(zhong)(zhong)的(de)組分為(單(dan)位:g/L):葡萄糖10,酵(jiao)(jiao)母粉80,黃豆餅粉8,磷酸(suan)氫二(er)鉀(jia)2,氯化(hua)鈉2,硫酸(suan)鎂0.3,碳酸(suan)鈣0.3,余量為水。在(zai)(zai)本實(shi)施例中(zhong)(zhong),在(zai)(zai)第(di)二(er)個(ge)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)米(mi)卡芬(fen)(fen)凈前體FR901379的(de)穩定(ding)在(zai)(zai)700μg/mL。

步驟(3)、發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)完成后進(jin)行(xing)放罐(guan)提(ti)取(qu)。提(ti)取(qu)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)時(shi),先向發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)罐(guan)中(zhong)添(tian)加濃(nong)度為(wei)5wt%的(de)稀鹽酸(suan),以使發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)罐(guan)內發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)的(de)體系酸(suan)化至pH呈3.5,板框過濾,然后向發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)罐(guan)中(zhong)添(tian)加濃(nong)度為(wei)60wt%的(de)甲醇(chun)作(zuo)為(wei)極(ji)性溶(rong)劑(ji)進(jin)行(xing)抽提(ti)濃(nong)縮,得米卡芬凈母核FR179642解(jie)析液(ye)。

步(bu)驟(4)、將米(mi)(mi)卡芬(fen)凈(jing)母(mu)核(he)FR179642解(jie)析(xi)液(ye)使用(yong)裝填有(you)D1300大(da)孔樹脂吸附柱進行(xing)吸附,用(yong)濃(nong)度為60wt%的甲醇(chun)作為極(ji)性溶劑進行(xing)解(jie)析(xi),解(jie)析(xi)流速1~2BV/H,合并有(you)效(xiao)組分,濃(nong)縮得到(dao)米(mi)(mi)卡芬(fen)凈(jing)母(mu)核(he)FR179642解(jie)析(xi)液(ye)。

步驟(5)、將米(mi)卡芬凈母核(he)(he)FR179642解析液結晶,過(guo)濾,干燥,得到呈粉末(mo)狀(zhuang)的(de)米(mi)卡芬凈母核(he)(he)FR179642。結晶方(fang)式(shi)為溶劑沉降結晶,并具體(ti)為:向(xiang)米(mi)卡芬凈母核(he)(he)FR179642解析液中(zhong)加入15~20倍體(ti)積的(de)環己烷。在本實施(shi)例中(zhong),干燥方(fang)式(shi)為真空(kong)干燥,干燥溫度40℃,真空(kong)度為0.2MPa。

本實(shi)施例所制得的米(mi)卡芬凈母核(he)FR179642經HPLC檢測,歸一(yi)化純度86.1%。

實施例四:

該米卡芬(fen)凈母核FR179642的制備方法(fa),包括(kuo)以下步(bu)驟。

步驟(1)、取少量(liang)的(de)FR179642產生菌孢子懸液,接(jie)種于培養(yang)基上,于26℃下,培養(yang)44h。該種子培養(yang)基中的(de)組分為(單(dan)位:g/L):葡萄(tao)糖20,酵(jiao)母粉15,黃豆餅(bing)粉5,磷酸氫二鉀0.5,氯化鈉(na)0.1,硫酸鎂0.1,碳酸鈣0.1,余量(liang)為水。

步驟(zou)(2)、將(jiang)種子(zi)培養(yang)基接種于發酵罐內并添加發酵培養(yang)基,于24~28℃下(xia)培養(yang)60~70h。

當發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)菌(jun)(jun)濃(nong)達到穩定狀(zhuang)態(tai)后添加(jia)米(mi)卡(ka)芬凈(jing)前(qian)體FR901379,繼(ji)續發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)55h后,補加(jia)米(mi)卡(ka)芬凈(jing)前(qian)體FR901379。在(zai)這兩(liang)個發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),自初始狀(zhuang)態(tai)至發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)菌(jun)(jun)濃(nong)達到穩定狀(zhuang)態(tai)的(de)一個發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan),發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)溫度控(kong)(kong)制在(zai)32℃。自發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)菌(jun)(jun)濃(nong)達到穩定狀(zhuang)態(tai)至放罐(guan)(guan)的(de)第(di)二個發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)穩定控(kong)(kong)制在(zai)29℃。該發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)培(pei)養基組(zu)分中(zhong)(zhong)的(de)組(zu)分為(單位:g/L):葡萄糖5,酵(jiao)(jiao)母粉(fen)70,黃(huang)豆(dou)餅粉(fen)6,磷(lin)酸(suan)氫二鉀1,氯化鈉1,硫(liu)酸(suan)鎂0.2,碳酸(suan)鈣0.1,余(yu)量為水。在(zai)本實例中(zhong)(zhong),在(zai)第(di)二個發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階段(duan)中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)(guan)內(nei)的(de)米(mi)卡(ka)芬凈(jing)前(qian)體FR901379的(de)濃(nong)度穩定在(zai)800μg/mL左右。

步(bu)驟(3)、發酵完成進行放罐(guan)(guan)后提取(qu)(qu)。提取(qu)(qu)發酵液(ye)時,先向發酵罐(guan)(guan)中添加(jia)濃度為(wei)5wt%的(de)稀磷酸(suan),以使發酵罐(guan)(guan)內發酵液(ye)的(de)體系(xi)酸(suan)化至pH呈3,過板框后,加(jia)乙醇作(zuo)為(wei)極性溶(rong)劑抽提濃縮,得到米卡芬凈母核FR179642濃縮液(ye)。

步(bu)驟(4)、將米(mi)卡芬凈母核(he)(he)FR179642濃縮(suo)液(ye)使用(yong)裝填有D1300的(de)大孔樹脂吸附(fu)(fu)柱進(jin)行(xing)吸附(fu)(fu)。吸附(fu)(fu)流(liu)(liu)速(su)控制(zhi)0.5~1.5BV/H,吸附(fu)(fu)完成后水洗,用(yong)濃度為(wei)60wt%的(de)乙醇作(zuo)為(wei)極(ji)性溶劑進(jin)行(xing)解(jie)(jie)析(xi),解(jie)(jie)析(xi)流(liu)(liu)速(su)1~2BV/H,合并有效組分,得到米(mi)卡芬凈母核(he)(he)FR179642解(jie)(jie)析(xi)液(ye)。

步(bu)驟(5)、將米卡芬(fen)凈(jing)(jing)母(mu)(mu)(mu)核(he)FR179642解(jie)析液結(jie)晶,干(gan)燥(zao)(zao)(zao),得到(dao)呈粉末狀的(de)米卡芬(fen)凈(jing)(jing)母(mu)(mu)(mu)核(he)FR179642。結(jie)晶方式為(wei)(wei)溶(rong)劑(ji)沉(chen)降結(jie)晶,并(bing)具體為(wei)(wei):向米卡芬(fen)凈(jing)(jing)母(mu)(mu)(mu)核(he)FR179642解(jie)析液中加(jia)入15~20倍體積(ji)的(de)正己烷。結(jie)晶后過(guo)濾并(bing)干(gan)燥(zao)(zao)(zao)。具體的(de),干(gan)燥(zao)(zao)(zao)方式為(wei)(wei)真空(kong)干(gan)燥(zao)(zao)(zao),干(gan)燥(zao)(zao)(zao)溫度40℃,真空(kong)度為(wei)(wei)0.3MPa。

本實施例(li)所制得的米(mi)卡(ka)芬(fen)凈母核FR179642經HPLC檢測,歸一(yi)化純度85.7%。

實施例五:

該米卡芬凈母核FR179642的制備(bei)方法,包括(kuo)以下步驟。

步驟(zou)(1)、取少量(liang)的FR179642產生(sheng)菌孢子懸液,接種于培養(yang)基上,于26℃下,培養(yang)40h。該種子培養(yang)基中的組分為(wei)(單位:g/L):葡萄糖35,酵母粉(fen)(fen)15,黃豆餅粉(fen)(fen)15,磷酸(suan)氫二(er)鉀(jia)1.5,氯(lv)化鈉1.0,硫酸(suan)鎂1.0,碳酸(suan)鈣0.5,余量(liang)為(wei)水。

步驟(zou)(2)、將(jiang)種子(zi)培(pei)養基(ji)接種于發酵(jiao)罐(guan)內并添加發酵(jiao)培(pei)養基(ji),于24~28℃下培(pei)養60~70h。

當發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)菌濃(nong)達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀態(tai)后添加米(mi)卡芬(fen)(fen)凈(jing)前體(ti)FR901379,繼續發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)60h后,補加米(mi)卡芬(fen)(fen)凈(jing)前體(ti)FR901379。在這兩個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階(jie)段中(zhong)(zhong),自初(chu)始狀態(tai)至發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)菌濃(nong)達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀態(tai)的(de)(de)一個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階(jie)段,發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)溫(wen)度控制(zhi)在34℃。自發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)菌濃(nong)達(da)到(dao)穩(wen)(wen)定(ding)狀態(tai)至放罐(guan)的(de)(de)第(di)(di)二(er)個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階(jie)段中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)穩(wen)(wen)定(ding)控制(zhi)在30℃。該發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)培養基組分(fen)中(zhong)(zhong)的(de)(de)組分(fen)為(單位(wei):g/L):葡萄糖15,酵(jiao)(jiao)母粉90,黃豆餅(bing)粉10,磷(lin)酸(suan)氫二(er)鉀5,氯化鈉5,硫酸(suan)鎂(mei)0.4,碳酸(suan)鈣(gai)0.5,余量為水。在本實例中(zhong)(zhong),在第(di)(di)二(er)個(ge)發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)階(jie)段中(zhong)(zhong),發(fa)(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)罐(guan)內的(de)(de)米(mi)卡芬(fen)(fen)凈(jing)前體(ti)FR901379的(de)(de)濃(nong)度穩(wen)(wen)定(ding)在2000μg/mL左右。

步驟(3)、發酵(jiao)(jiao)完成進行(xing)放罐后(hou)提(ti)取(qu);提(ti)取(qu)發酵(jiao)(jiao)液時(shi),先向發酵(jiao)(jiao)罐中添(tian)加(jia)濃度為(wei)5wt%的稀(xi)鹽酸,以使發酵(jiao)(jiao)罐內發酵(jiao)(jiao)液的體系酸化(hua)至(zhi)pH呈3,過板框后(hou),加(jia)甲醇作(zuo)為(wei)極性溶劑抽提(ti)濃縮,得(de)米卡(ka)芬凈母核(he)FR179642濃縮液。

步驟(4)、得(de)到的米(mi)卡芬(fen)凈母核FR179642濃(nong)縮液使用裝填有(you)D1300的大孔樹脂吸(xi)附(fu)柱(zhu)進(jin)行吸(xi)附(fu)。吸(xi)附(fu)流速控制0.5~1.5BV/H,吸(xi)附(fu)完成后水洗(xi),用濃(nong)度(du)為60wt%的甲醇進(jin)行解(jie)(jie)析,解(jie)(jie)析流速1~2BV/H,合并有(you)效組分,得(de)米(mi)卡芬(fen)凈母核FR179642解(jie)(jie)析液。

步驟(5)、將(jiang)米(mi)(mi)卡芬(fen)凈(jing)母(mu)核(he)FR179642解析(xi)液結(jie)晶(jing)(jing),干燥,得到呈(cheng)粉(fen)末(mo)狀(zhuang)的米(mi)(mi)卡芬(fen)凈(jing)母(mu)核(he)FR179642。結(jie)晶(jing)(jing)方式為溶劑沉降結(jie)晶(jing)(jing),并具(ju)體(ti)為:向(xiang)米(mi)(mi)卡芬(fen)凈(jing)母(mu)核(he)FR179642解析(xi)液中加入(ru)15~20倍體(ti)積的石油醚。結(jie)晶(jing)(jing)后(hou)過濾并干燥。具(ju)體(ti)的,干燥方式為真空干燥,干燥溫度40℃,真空度為0.4MPa。

本實施例所制得的米卡芬凈母核FR179642經HPLC檢測,歸(gui)一化純(chun)度86.3%。

上文(wen)所列(lie)出(chu)的(de)一系列(lie)的(de)詳細說(shuo)明(ming)僅僅是針(zhen)對本發(fa)明(ming)的(de)可行性實(shi)施(shi)方(fang)式的(de)具體說(shuo)明(ming),它(ta)們并非用以限制本發(fa)明(ming)的(de)保護范(fan)圍,凡未脫離本發(fa)明(ming)技(ji)藝精神所作的(de)等效實(shi)施(shi)方(fang)式或變更均應包含在(zai)本發(fa)明(ming)的(de)保護范(fan)圍之內(nei)。

對于(yu)本(ben)(ben)領域技術人員而言,顯然本(ben)(ben)發(fa)明不(bu)限(xian)(xian)于(yu)上述示(shi)范(fan)(fan)性(xing)(xing)實(shi)施(shi)例的(de)(de)細節,而且在不(bu)背(bei)離本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)精神或基本(ben)(ben)特征的(de)(de)情況(kuang)下,能夠以其(qi)他(ta)的(de)(de)具體形式(shi)實(shi)現本(ben)(ben)發(fa)明。因(yin)此(ci),無論從哪一點來(lai)看,均應將實(shi)施(shi)例看作是示(shi)范(fan)(fan)性(xing)(xing)的(de)(de),而且是非限(xian)(xian)制性(xing)(xing)的(de)(de),本(ben)(ben)發(fa)明的(de)(de)范(fan)(fan)圍由所(suo)附(fu)權利要(yao)求而不(bu)是上述說明限(xian)(xian)定(ding),因(yin)此(ci)旨在將落在權利要(yao)求的(de)(de)等同要(yao)件的(de)(de)含(han)義(yi)和范(fan)(fan)圍內的(de)(de)所(suo)有變化囊括在本(ben)(ben)發(fa)明內。

此外,應當(dang)理解(jie),雖然本(ben)說(shuo)明書(shu)按照實(shi)施方(fang)(fang)式(shi)(shi)(shi)加(jia)以(yi)(yi)描述,但并(bing)非(fei)每(mei)個實(shi)施方(fang)(fang)式(shi)(shi)(shi)僅(jin)(jin)包含一個獨立的技(ji)(ji)術方(fang)(fang)案,說(shuo)明書(shu)的這種敘述方(fang)(fang)式(shi)(shi)(shi)僅(jin)(jin)僅(jin)(jin)是為清楚起見,本(ben)領域技(ji)(ji)術人(ren)員應當(dang)將說(shuo)明書(shu)作為一個整體(ti),各實(shi)施例中的技(ji)(ji)術方(fang)(fang)案也可(ke)以(yi)(yi)經(jing)適(shi)當(dang)組合,形成本(ben)領域技(ji)(ji)術人(ren)員可(ke)以(yi)(yi)理解(jie)的其他實(shi)施方(fang)(fang)式(shi)(shi)(shi)。

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