本發(fa)明屬(shu)于生物(wu)工程技(ji)術領域(yu)，涉(she)及(ji)抗真菌藥物(wu)的微(wei)生物(wu)發(fa)酵，具體涉(she)及(ji)紐(niu)莫(mo)康(kang)定B0的微(wei)生物(wu)發(fa)酵方法。
背景技術：
紐莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis發酵合成的次級代謝產物。Glarea lozoyensis發酵產物除目標產物B0之外，有A0、B1、B2、C0、D0、E0等12種類(lei)似物，其中(zhong)(zhong)C0的結構和B0最為接近(jin)，兩者的結構差(cha)異(yi)在(zai)于B0中(zhong)(zhong)的反(fan)(fan)式3-羥基(ji)脯氨酸，在(zai)C0中(zhong)(zhong)是(shi)反(fan)(fan)式4-羥基(ji)脯氨酸。
紐莫(mo)康(kang)定B0 Cas：135575-42-7
紐莫康定C0 Cas：144074-96-4
現有技術主要采用的(de)是(shi)樹脂(zhi)柱工藝對紐(niu)(niu)莫(mo)康(kang)(kang)定B0進行提純(chun)，柱層(ceng)析應用于工業(ye)化生(sheng)產時，費時，溶劑(ji)使用量大，易造成(cheng)環境污染，且原料(liao)損耗大，使得生(sheng)產成(cheng)本大幅提高(gao)。C0是(shi)紐(niu)(niu)莫(mo)康(kang)(kang)定B0的(de)異(yi)構體，在(zai)(zai)結(jie)構上的(de)差異(yi)表現為一(yi)個羥基位(wei)置的(de)不(bu)同；C0雜(za)(za)質不(bu)能(neng)(neng)在(zai)(zai)反(fan)相(xiang)色譜中(zhong)與紐(niu)(niu)莫(mo)康(kang)(kang)定B0分離，只(zhi)有通過正相(xiang)色譜分離。發酵(jiao)液中(zhong)的(de)C0雜(za)(za)質一(yi)般10％，如果不(bu)能(neng)(neng)得到有效的(de)控(kong)制(zhi)，最后得到的(de)是(shi)紐(niu)(niu)莫(mo)康(kang)(kang)定B0和C0的(de)混合物。C0雜(za)(za)質能(neng)(neng)參(can)與后續(xu)反(fan)應，嚴重影響醋酸卡泊芬凈的(de)質量。
技術實現要素：
為解決(jue)上述問題，本發明人經過摸索，開(kai)發出了一套新(xin)的紐(niu)(niu)莫康(kang)(kang)定B0的發酵(jiao)方法(fa)，該方法(fa)能夠(gou)降低(di)發酵(jiao)過程中紐(niu)(niu)莫康(kang)(kang)定C0的含量(liang)，大幅降低(di)下游提取工(gong)藝的成本。
在該方法中使用的菌種(zhong)為Glarea lozoyensis，所述發酵條(tiao)件如下：
發酵培養基(wt)：乳糖15.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合(he)硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
發(fa)酵(jiao)過程中溫(wen)度24～26℃，起始通氣量0.5～1.0VVM，罐壓0.04～0.06Mpa。發(fa)酵(jiao)過程中逐(zhu)漸調(diao)高通氣量與轉速使(shi)溶氧不低于20％，轉速最(zui)大(da)600轉，通氣量最(zui)大(da)1.2VVM。
發酵48h后，開(kai)始補加(jia)(jia)維生素b5，按照培養基的體(ti)積(ji)，添加(jia)(jia)量(liang)為20～40mg/l。
發(fa)酵72h后(通氣量(liang)(liang)與轉速(su)已調至上限(xian))，根據溶(rong)氧(yang)(yang)量(liang)(liang)變(bian)化(hua)調節(jie)pH控(kong)制范圍(wei)，直到發(fa)酵結束：溶(rong)氧(yang)(yang)量(liang)(liang)不低于(yu)45％時(shi)，控(kong)制pH5.0～5.4；溶(rong)氧(yang)(yang)量(liang)(liang)為35％～45％時(shi)，控(kong)制pH5.4～5.8；溶(rong)氧(yang)(yang)量(liang)(liang)為25％～35％時(shi)，控(kong)制pH5.8～6.2；溶(rong)氧(yang)(yang)量(liang)(liang)低于(yu)25％時(shi)，控(kong)制pH6.2～6.6。
經過發(fa)酵(jiao)獲(huo)得的(de)發(fa)酵(jiao)液(ye)中紐莫(mo)康定(ding)C0的(de)含量可由原來的(de)6％降至1.5％。
具體實施例
實施例1
發酵菌種：Glarea lozoyensis
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合硫酸鎂(mei)0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
50L發(fa)酵罐培養，培養基30L，121℃消(xiao)毒30分鐘(zhong)。種量(liang)1.5L，發(fa)酵液培養溫(wen)度25℃，起始通(tong)(tong)氣(qi)量(liang)0.9VVM，200轉，罐壓0.05Mpa，發(fa)酵過程中(zhong)逐漸調高(gao)通(tong)(tong)氣(qi)量(liang)與轉速(su)使溶(rong)氧不(bu)低于20，轉速(su)最大600轉，通(tong)(tong)氣(qi)量(liang)最大1.2VVM。
發酵48h后，開始補(bu)加(jia)維生素b5，添加(jia)量(liang)(liang)為(wei)(wei)(wei)30mg/l。發酵72h后(此時(shi)通氣(qi)量(liang)(liang)與(yu)轉速已調至上限)，根據溶氧(yang)(yang)(yang)變化調節(jie)pH控制(zhi)(zhi)(zhi)范圍，直到發酵結束(shu)：溶氧(yang)(yang)(yang)量(liang)(liang)不低于45％時(shi)，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.0～5.4，96h溶氧(yang)(yang)(yang)量(liang)(liang)為(wei)(wei)(wei)35％～45％，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.4～5.8，110h溶氧(yang)(yang)(yang)量(liang)(liang)為(wei)(wei)(wei)25％～35％，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.8～6.2，130h溶氧(yang)(yang)(yang)低于25％，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH6.2～6.6，144h溶氧(yang)(yang)(yang)回(hui)升(sheng)至25％，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.8～6.2，168h溶氧(yang)(yang)(yang)回(hui)升(sheng)至35％，并維持在35％～45％之(zhi)間，控制(zhi)(zhi)(zhi)pH5.4～5.8，240h發酵結束(shu)，放罐，測定紐莫(mo)康(kang)定B0的(de)發酵單位為(wei)(wei)(wei)1048mg/l，紐莫(mo)康(kang)定C0的(de)含量(liang)(liang)為(wei)(wei)(wei)1.5％。
實(shi)施例2(不(bu)補加維生素b5的比較例)
發酵菌種：Glarea lozoyensis
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合硫酸鎂(mei)0.05％，MES緩(huan)沖鹽(yan)1.5％，pH 5.3。
50L發酵(jiao)罐培(pei)養，培(pei)養基30L，121℃消毒30分鐘。種量(liang)1.5L，發酵(jiao)液培(pei)養溫度25℃，起(qi)始通(tong)氣量(liang)0.9VVM，200轉(zhuan)，罐壓(ya)0.05Mpa，發酵(jiao)過程中逐漸調高通(tong)氣量(liang)與轉(zhuan)速使溶氧(yang)不(bu)低于20，轉(zhuan)速最大600轉(zhuan)，通(tong)氣量(liang)最大1.2VVM。
發(fa)(fa)酵72h后(此(ci)時通(tong)氣(qi)量與轉(zhuan)速已調(diao)至(zhi)上限(xian))，根(gen)據溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)變化(hua)調(diao)節(jie)pH控(kong)制(zhi)范(fan)圍，直(zhi)到發(fa)(fa)酵結束(shu)：溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)量不低(di)(di)于45％時，控(kong)制(zhi)pH5.0～5.4，96h溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)量為35％～45％，控(kong)制(zhi)pH5.4～5.8，110h溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)量為25％～35％，控(kong)制(zhi)pH5.8～6.2，130h溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)低(di)(di)于25％，控(kong)制(zhi)pH6.2～6.6，144h溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)回升(sheng)至(zhi)25％，控(kong)制(zhi)pH5.8～6.2，168h溶(rong)氧(yang)(yang)(yang)回升(sheng)至(zhi)35％，并(bing)維持在35％～45％之間，控(kong)制(zhi)pH5.4～5.8，240h發(fa)(fa)酵結束(shu)，放(fang)罐，測定(ding)紐莫康(kang)定(ding)B0的發(fa)(fa)酵單位為1025mg/l，紐莫康(kang)定(ding)C0的含量為6％。