本發(fa)(fa)明屬(shu)于(yu)生物(wu)工程技(ji)術(shu)領域(yu)，涉及(ji)抗真菌藥物(wu)的微生物(wu)發(fa)(fa)酵(jiao)，具(ju)體涉及(ji)紐莫康定B0的微生物(wu)發(fa)(fa)酵(jiao)方法。
背景技術：
棘白菌素化合物發現于20世紀70年代，是一類具有六元環肽和不同脂肪酸側鏈的微生物次級代謝產物，能夠特異性地作用于真菌細胞壁，非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性，從而能夠起到抗菌效果，且不對人體產生影響。紐莫康定B0的(de)半合(he)成衍生物卡(ka)泊芬凈是首個被報道的(de)棘白菌素類化合(he)物，2001年被美國(guo)FDA批準用(yong)于曲霉菌感(gan)染的(de)治療。目前(qian)，卡(ka)泊芬凈已成為全身用(yong)抗真菌藥市場的(de)王(wang)牌藥物。
紐(niu)莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis發酵合成(cheng)的次級代謝產物。
紐莫康定B0 Cas：135575-42-7
Glarea lozoyensis的發(fa)酵產(chan)物(wu)(wu)主要有(you)A0和B0兩種有(you)效(xiao)(xiao)產(chan)物(wu)(wu)，除此之外，發(fa)酵過(guo)程中(zhong)也(ye)會多種環(huan)狀六肽的結構類似物(wu)(wu)，發(fa)酵過(guo)程中(zhong)結構類似物(wu)(wu)的有(you)效(xiao)(xiao)控制，能提高后(hou)期的分離效(xiao)(xiao)率，降(jiang)低生產(chan)成本，因此如何提高B0效(xiao)(xiao)價同時降(jiang)低副(fu)產(chan)物(wu)(wu)的比例(li)，是(shi)研(yan)究人員關(guan)注的方向。
技術實現要素：
本(ben)發明提(ti)供(gong)一(yi)種新的紐莫康定(ding)B0的發酵方(fang)法，該方(fang)法是一(yi)種提(ti)高紐莫康定(ding)B0發酵單位的方(fang)法，在該方(fang)法中使用的菌種為(wei)Glarea lozoyensis，所述發酵條件(jian)如(ru)下：
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七(qi)水合硫酸鎂0.05％，MES緩沖鹽1.5％，pH 5.3。
發(fa)酵過程中溫度24～26℃，起始(shi)通(tong)氣量(liang)0.5～1.0VVM，罐(guan)壓0.04～0.06Mpa。發(fa)酵過程中逐漸調高通(tong)氣量(liang)與轉(zhuan)速使(shi)溶氧(yang)不低于(yu)20％，轉(zhuan)速最大(da)600轉(zhuan)，通(tong)氣量(liang)最大(da)1.2VVM。
發酵24h后，開(kai)始流(liu)加氨(an)水，控制(zhi)pH5.0～5.4。
發酵60h后，開(kai)始流加乳糖，流加速(su)度為1.5～2.5％/天(質(zhi)量體積比)，使(shi)發酵液總糖濃度控制在(zai)1～3％之間，直到發酵結束。
發酵72h后(hou)(通氣量(liang)與轉速已調至(zhi)上限)，根據溶氧量(liang)變化調節pH控(kong)(kong)(kong)制范圍，直到發酵結束：溶氧量(liang)不低于(yu)45％時，控(kong)(kong)(kong)制pH5.0～5.4；溶氧量(liang)為35％～45％時，控(kong)(kong)(kong)制pH5.4～5.8；溶氧量(liang)為25％～35％時，控(kong)(kong)(kong)制pH5.8～6.2；溶氧量(liang)低于(yu)25％時，控(kong)(kong)(kong)制pH6.2～6.6。
發酵培養期共(gong)10天(tian)，10天(tian)后放罐。
本發明培養基采用稀(xi)配(pei)方，發酵過程中(zhong)流加乳糖和(he)氨(an)水，能(neng)夠有效降低菌體(ti)粘度，提高通(tong)氣效果，同(tong)時在發酵過程中(zhong)嚴格(ge)控(kong)制(zhi)pH。
流加乳糖(tang)后，發酵液總糖(tang)濃度控制在(zai)1～3％之間，在(zai)這個范(fan)圍內菌(jun)絲的(de)正常生長代謝(xie)是穩定的(de)，過低則影響正常代謝(xie)，過高(gao)則不利于下一(yi)步的(de)放罐提取。
現有(you)紐莫康定B0的發(fa)酵技術(shu)中(zhong)，紐莫康定B0的發(fa)酵單位約為(wei)800～1000mg/l，本(ben)發(fa)明發(fa)酵方(fang)法(fa)可將發(fa)酵單位提高(gao)至2000～2500mg/l。
具體實施例
實施例1
發(fa)酵(jiao)菌(jun)種：Glarea lozoyensis
發酵培養基(wt)：乳糖3.0％，蘇氨酸1.0％，酵母粉1.0％，脯氨酸1.2％，KH2PO40.15％，七水合硫酸(suan)鎂(mei)0.05％，MES緩沖鹽(yan)1.5％，pH 5.3。
50L發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)罐培(pei)養(yang)，培(pei)養(yang)基(ji)30L，121℃消毒30分鐘。種量(liang)(liang)1.5L，發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)液培(pei)養(yang)溫(wen)度25℃，起始(shi)(shi)通氣(qi)(qi)量(liang)(liang)0.9VVM，200轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)，罐壓0.05Mpa，發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)過程(cheng)中逐漸調(diao)(diao)高通氣(qi)(qi)量(liang)(liang)與轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)速使溶(rong)氧(yang)不低于20，轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)速最大(da)600轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)，通氣(qi)(qi)量(liang)(liang)最大(da)1.2VVM。發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)24h后(hou)(hou)，開(kai)(kai)始(shi)(shi)流加氨水，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.0～5.4。發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)60h后(hou)(hou)，開(kai)(kai)始(shi)(shi)流加乳(ru)糖(tang)，流加速度為(wei)(wei)2.0％/天(質量(liang)(liang)體積比)，使發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)液總糖(tang)濃度控(kong)(kong)(kong)制(zhi)在(zai)1～3％之間，直(zhi)(zhi)到發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)結束。發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)72h后(hou)(hou)(此時(shi)通氣(qi)(qi)量(liang)(liang)與轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)速已調(diao)(diao)至上(shang)限)，根據(ju)溶(rong)氧(yang)變化調(diao)(diao)節pH控(kong)(kong)(kong)制(zhi)范圍，直(zhi)(zhi)到發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)結束：溶(rong)氧(yang)量(liang)(liang)不低于45％時(shi)，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.0～5.4，96h溶(rong)氧(yang)量(liang)(liang)為(wei)(wei)35％～45％，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.4～5.8，110h溶(rong)氧(yang)量(liang)(liang)為(wei)(wei)25％～35％，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.8～6.2，130h溶(rong)氧(yang)低于25％，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH6.2～6.6，144h溶(rong)氧(yang)回升至25％，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.8～6.2，168h溶(rong)氧(yang)回升至35％，并維(wei)持在(zai)35％～45％之間，控(kong)(kong)(kong)制(zhi)pH5.4～5.8，240h發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)結束，放罐，測定紐莫康(kang)定B0的發(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)單位為(wei)(wei)2314mg/l。