專利名稱：降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種降壓肽的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性的檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
高血壓嚴重威脅著人類的健康，我國高血壓患者達I. 8億人，每年因高血壓死亡的人數超過100萬人。人體的升壓系統體腎素-血管緊張素系統和降壓系統激肽釋放酶-激肽系統在血壓調節及心血管功能方面扮演著重要角色。ACE (血管緊張素轉化酶)通過對上述兩個系統的調控達到升高血壓的作用。降壓肽通過抑制ACE的活性，起到降壓作用。
降壓肽具有高安全性、無副作用、效果明顯等特點成為降壓藥物、保健品的研究重點，具有巨大的市場前景。因此，高效、靈敏、可靠的ACE抑制活性檢測方法的建立是非常必要的。Cushman等建立了紫外分光光度法，ACE在37°C，pH8. 3的條件下催化分解血管緊張素I的模擬物馬尿酸一組氨酸一亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)產生血管緊張素II的模擬物馬尿酸(Hip)，該物質在紫外228nm處具有特征吸收峰，當加入ACE抑制肽時，ACE對HHL的催化分解作用受到抑制，Hip的生成量減少。通過測定加入抑制肽前后所生成Hip紫外吸收峰的差別確定抑制活性。在該方法中，反應所生成的Hip和HHL不能有效分離，而且均在 228nm處有吸收，易產生實驗誤差。在此基礎上，許多學者建立高效液相色譜法，利用高效液相色譜分離Hip，通過測定加入抑制肽前后所生成Hip峰面積的差別確定樣品的抑制活性。 高效液相色譜法利用Hip色譜峰與雜質峰具有不同的保留時間，定量分析Hip，準確度高于紫外分光光度法。但有些樣品在紫外檢測中出現弱吸收峰或無吸收峰，高效液相色譜法無法檢測這些樣品的ACE抑制活性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種簡便、快捷、精密度、準確性高的降壓肽 ACE抑制活性檢測方法，為降壓藥物、保健品的研發提供技術支持。為解決上述技術問題，本發明的技術解決方案是
一種降壓肽的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性的檢測方法，包括如下步驟
(1)降壓肽的抑制ACE活性實驗
將一定量的降壓肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸緩沖液中，吸取25 μ L的降壓肽，加 Λ 75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C保溫5min，隨后加入112 μ L5. OmmoI/L的馬尿酸一組氨酸一亮氨酸；空白對照組則用相同體積的硼酸緩沖液代替降壓肽，在37°C，恒溫水浴中保溫60min,然后加入25 μ L0. 1%三氟乙酸中止反應,在ACE的作用下,馬尿酸一組氨酸一亮氨酸生成馬尿酸即Hip ；
(2)利用高效液相色譜一質譜聯用LC-MS技術檢測分析反應產物
LC-MS檢測分析反應組和空白對照組的反應產物，液相色譜條件為反相色譜柱，流動相為乙腈超純水為20 :80，含體積比為O. 1%三氟乙酸，流速I. OmL/min，檢測波長228nm，進樣量10 μ L ;質譜條件為電噴霧離子源(ESI )，電離電壓3. 5KV，一級錐孔電壓35V，二級錐孔電壓3. 0V,六級桿透鏡電壓O. IV，源溫度120°C，脫溶劑溫度350°C，脫溶劑氮氣流速 500L/h,錐孔氮氣流速50L/h，離子能量O. 5 ;利用反應產物的總離子流色譜圖和紫外檢測色譜圖檢測反應產物，確保Hip純度；定量分析SIM模型下 Λ180的提取離子圖的Hip峰面積，計算Hip的峰面積；
(3)降壓活性的計算
通過上述方法得到反應組和空白對照組反應產物Hip的峰面積，降壓肽的ACE抑制活性IP為(Ac-As) X 100/AC，其中IP為樣品對ACE的抑制率；AC為空白對照組中Hip的峰面積；AS為反應組中Hip的峰面積。所述步驟(2)所用反相色譜柱為Ugl20_C18分析柱。所述步驟(2)所用電噴霧離子源(ESI)為電噴霧電離正離子模式。所述步驟(2)所述反應組反應產物重復測三次，峰面積的相對偏差(RSD)為
O.1-0. 4%。所述步驟(3)所述的空白對照組以不加降壓肽時ACE與HHL反應生成Hip在LC-MS 中的峰面積來表示；反應組以加降壓肽時ACE與HHL反應生成Hip在LC-MS中的峰面積來表不。采用上述方案后，本發明利用LC-MS檢測反應產物，通過檢測SM模型下》Λ180 的提取離子圖的馬尿酸(Hip)峰面積變化表征降壓肽的降壓活性。在高效液相色譜紫外檢測器和電噴霧離子源(ESI)質譜的監測下，利用總離子流色譜圖和紫外檢測色譜圖，判斷 Hip的分離度，確保降壓肽檢測方法的準確性。本發明將LC-MS技術應用于降壓肽的活性篩選，和以往的分光光度法、色譜法相比，具有以下優點
I、本發明利用液質聯用技術(LC-MS)檢測降壓肽的ACE抑制活性，通過檢測SM模型下《Λ180的提取離子圖的馬尿酸(Hip)峰面積的變化表征降壓肽的降壓活性。利用高效液相紫外色譜協同質譜總離子流色譜圖，確定Hip的純度，避免傳統液相色譜法在檢測具紫外弱吸收峰或無吸收峰樣品的ACE抑制活性時，出現準確率低的現象，提高ACE抑制活性檢測方法的準確性。2、本發明利用液質聯用技術(LC-MS)檢測降壓肽的ACE抑制活性，在高效液相分離的同時利用質譜檢測反應產物的純度、峰面積，可以節約一半的檢測時間。


圖I是實施例一 LC-MS檢測空白對照組的色譜圖，其中1-1為SM模型下》Λ180 的提取離子圖，1-2為總離子流色譜圖，1-3為紫外色譜圖2是實施例一 LC-MS檢測反應組的色譜圖，其中2-1為SM模型下 Λ180的提取離子圖，2-2為總離子流色譜圖，2-3為紫外色譜圖3是實施例二 LC-MS檢測反應組的色譜圖，其中3-1為SM模型下》Λ180的提取離子圖，3-2為總離子流色譜圖，3-3為紫外色譜圖4是實施例三LC-MS檢測反應組的色譜圖，其中4-1為SM模型下》Λ180的提取離子圖，4-2為總離子流色譜圖，4-3為紫外色譜圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳述。實例一
I、將一定量的魚鱗降壓肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸緩沖液中，配置濃度為lmg/ml 的樣品溶液，吸取25 μ L的降壓肽，加入75 μ L 60mU -πιΓ1的ACE于37°C保溫5min，隨后加 Λ 112μ L5. Ommo I/L的HHL，空白對照組則用相同體積的硼酸緩沖液代替降壓肽的體積，在 37°C恒溫水浴中保溫60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反應。2、LC-MS檢測檢測分析反應產物，高效液相色譜條件為Ugl20_C18反相色譜柱、 流動相為乙腈超純水=20:80 (含O. 1%TFA,為體積比)、流速I. OmLmin'檢測波長228nm、 進樣量10 μ L0質譜條件為電噴霧電離正離子模式，電離電壓3. 5KV，一級錐孔電壓35V， 二級錐孔電壓3. 0V,六級桿透鏡電壓O. IV，源溫度120°C，脫溶劑溫度350°C，脫溶劑氮氣流速500L/h，錐孔氮氣流速50L/h，離子能量O. 5。3、利用反應產物的總離子流色譜圖(圖1-2、圖2-2)和紫外色譜圖(圖1_3、圖2_3) 確定反應產物中Hip不含其它雜質，此時Hip的出峰時間為5. 02min。利用軟件計算對SIM 模型下》/^180的提取離子圖(圖1-1、圖2-1)的Hip峰面積進行定量分析。反應組反應產物中Hip的峰面積為15134. 13，空白對照組中Hip的峰面積為118954. 55，魚鱗降壓肽的 ACE的抑制率為87. 28%。反應組中Hip的峰面積重復測定3次，其RSD為O. 4%。該方法精密度高、重復性好。實例二
I、將一定量的花生降壓肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸緩沖液中，配置濃度為lmg/ml 的樣品溶液，吸取25 μ L的降壓肽，加入75 μ L60mU · ml-1的ACE于37°C保溫5min,隨后加 Λ 112μ L5. Ommo I/L的HHL，空白對照組則用相同體積的硼酸緩沖液代替降壓肽的體積，在 37°C恒溫水浴中保溫60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反應。2、LC-MS檢測檢測分析反應產物，高效液相色譜條件為Ugl20_C18反相色譜柱、 流動相為乙腈超純水=20:80 (含O. 1%TFA)(體積比)、流速I. OmLmin'檢測波長228nm、 進樣量10 μ L0質譜條件為電噴霧電離正離子模式，電離電壓3. 5KV，一級錐孔電壓35V， 二級錐孔電壓3. 0V,六級桿透鏡電壓O. IV，源溫度120°C，脫溶劑溫度350°C，脫溶劑氮氣流速500L/h，錐孔氮氣流速50L/h，離子能量O. 5。3、利用反應產物的總離子流色譜圖(圖1-2、圖3-2)和紫外色譜圖(圖1_3、圖3_3) 確定反應產物中Hip不含其它雜質，此時Hip的出峰時間為5. 02min。利用軟件計算對SIM 模型下》/^180的提取離子圖(圖1-1、圖3-1)的Hip峰面積進行定量分析。反應組反應產物中Hip的峰面積為15691. 29，空白對照組中Hip的峰面積為118954. 55，故花生降壓肽 ACE的抑制率為86. 81 %。反應組反應產物Hip的峰面積重復測定3次，其RSD為O. 1%。該方法精密度高、重復性好。實例三
I、將一定量的甘氨酸一苯丙氨酸(Gly-Phe)溶于pH8. 3,0. lmol/L的硼酸緩沖液中，配置濃度為lmg/ml的樣品溶液，吸取25 μ L的降壓肽，加入75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C 保溫5min，隨后加入225 μ L5. OmmoI/L的HHL，空白對照組則用相同體積的硼酸緩沖液代替降壓肽的體積，在37°C恒溫水浴中保溫60min，然后加入25 μ L0. 1%TFA中止反應。 2、LC-MS檢測檢測分析反應產物，高效液相色譜條件為Ugl20_C18反相色譜柱、 流動相為乙腈超純水=20:80 (含O. 1%TFA)(體積比)、流速I. OmLmin'檢測波長228nm、 進樣量10 μ L0質譜條件為電噴霧電離正離子模式，電離電壓3. 5KV，一級錐孔電壓35V， 二級錐孔電壓3. 0V,六級桿透鏡電壓O. IV，源溫度120°C，脫溶劑溫度350°C，脫溶劑氮氣流速500L/h，錐孔氮氣流速50L/h，離子能量O. 5，
3、利用反應產物的總離子流色譜圖(圖1-2、圖4-2)和紫外色譜圖(圖1-3、圖4-3)確定反應產物中Hip不含其它雜質，此時Hip的出峰時間為5. 02min。利用軟件計算對SIM模型下》/zl80的提取離子圖(圖1-1、圖4-1)的Hip峰面積進行定量分析。反應組反應產物中Hip的峰面積為19668. 16，空白對照組中Hip的峰面積為118954. 55，故Gly-Phe降壓肽的ACE的抑制率為83. 47%,反應組Hip的峰面積重復測定3次，其RSD為O. 3%。該方法精密度高、重復性好。
權利要求
1.一種降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法，血管緊張素轉化酶縮寫為 ACE，其特征在于包括如下步驟(1)降壓肽的抑制ACE活性實驗將一定量的降壓肽溶于PH8. 3,0. lmol/L的硼酸緩沖液中，吸取25 μ L的降壓肽，加 Λ 75 μ L60mU · πιΓ1的ACE于37°C保溫5min，隨后加入112 μ L5. OmmoI/L的馬尿酸一組氨酸一亮氨酸；空白對照組則用相同體積的硼酸緩沖液代替降壓肽，在37°C，恒溫水浴中保溫60min,然后加入25 μ L0. 1%三氟乙酸中止反應,在ACE的作用下,馬尿酸一組氨酸一亮氨酸生成馬尿酸即Hip ；(2)利用高效液相色譜一質譜聯用LC-MS技術檢測分析反應產物LC-MS檢測分析反應組和空白對照組的反應產物，液相色譜條件為反相色譜柱，流動相為乙腈超純水為20 :80，含體積比為O. 1%三氟乙酸，流速I. OmL/min，檢測波長228nm， 進樣量10 μ L ;質譜條件為電噴霧離子源，電離電壓3. 5KV，一級錐孔電壓35V，二級錐孔電壓3. 0V,六級桿透鏡電壓O. IV，源溫度120°C，脫溶劑溫度350°C，脫溶劑氮氣流速500L/h， 錐孔氮氣流速50L/h，離子能量O. 5 ;利用反應產物的總離子流色譜圖和紫外檢測色譜圖檢測反應產物，確保Hip純度；定量分析SIM模型下》/zl80的提取離子圖的Hip峰面積,計算 Hip的峰面積；(3)降壓活性的計算通過上述方法得到反應組和空白對照組反應產物Hip的峰面積，降壓肽的ACE抑制活性IP為(Ae-As) X 100/A。，其中IP為樣品對ACE的抑制率;A。為空白對照組中Hip的峰面積；AS為反應組中Hip的峰面積。
2.根據權利要求I所述的降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)所用反相色譜柱為Ugl20-C18分析柱。
3.根據權利要求I所述的降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法，其特征在于所述步驟(2 )所用電噴霧離子源為電噴霧電離正離子模式。
4.根據權利要求I所述的降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)所述反應組反應產物重復測三次，峰面積的相對偏差為O. 1-0. 4%。
5.根據權利要求I所述的降壓肽的血管緊張素轉化酶抑制活性的檢測方法，其特征在于所述步驟(3)所述的空白對照組以不加降壓肽時ACE與HHL反應生成Hip在LC-MS中的峰面積來表示；反應組以加降壓肽時ACE與HHL反應生成Hip在LC-MS中的峰面積來表
全文摘要
一種降壓肽的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性的檢測方法，包括如下步驟(1)配置硼酸緩沖液，進行降壓肽的ACE活性抑制實驗。(2)利用LC-MS檢測分析反應產物，通過檢測馬尿酸(Hip)峰面積的變化表征降壓肽的降壓活性。在高效液相色譜紫外檢測器和電噴霧離子源質譜的監測下，利用總離子流色譜圖和紫外檢測色譜圖，保證Hip的純度，定量分析SIM模型下m/z180的提取離子圖的Hip峰面積，計算Hip的峰面積。(3)通過上述方法得到反應組和空白對照組反應產物Hip的峰面積，以此可得樣品對ACE的抑制率。本發明將LC-MS技術應用于降壓肽的活性篩選，可以減少雜質對活性檢測的影響，具有精確性高、重復性好、靈敏度高的特點。
文檔編號G01N30/02GK102608234SQ20121008990
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者余琳, 劉穎, 孫繼鵬, 張怡評, 徐建, 易瑞灶, 朱偉翔, 許諾華, 謝全靈, 鄭美華, 陳俊德, 陳思謹, 陳暉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所