專利名稱：一種定標測定血管緊張素轉換酶的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物樣本中測定血管緊張素轉換酶活性的技術方案以及有此方案制造的試劑。特別是涉及一種將定量測定血管緊張素轉換酶活性的FAPGG速率法標準化的技術方案。
背景技術：
Buttery(1993)應用血管緊張素轉換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)酶解苯丙氨酰雙甘氨肽類化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，FAPGG)生成苯丙氨酰類化合物(furylacryloylphenylalanine，FAP)及雙甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反應造成340nm處吸光度下降。通過連續監測測定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度可計算出ACE的活性。
一個單位ACE活性定義為在Buttery氏法條件下37℃每分鐘消耗一個微摩爾(μmol)底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反應方程式如下 Buttery JE，Stuart S.評估和優化血漿測定血管緊張素轉換酶的動力學方法。臨床化學雜志。1993年2月；39(2)312-6。[Buttery JE，Stuart S.Assessment and optimization of kineticmethods for angiotensin-converting enzyme in plasma.Clin Chem.1993Feb；39(2)312-6.]Buttery氏法缺點在于沒能使用一種公認的標準法定標的標準品，從而造成測試精確度下降，不同實驗室應用不同生化分析儀引起的儀器誤差，這是ACE正常參考范圍數據混亂、不可比性的主要原因。
Hurst(1981)應用ACE酶解馬尿組氨酰亮氨酸(N-hippuryl-l-histidyl-l-leucine，HHL)生成馬尿酸(hippuric acid)和二肽組氨酰亮氨酸(histidyl-leucine)。馬尿酸和氰尿酸氯化物(2，4，6-trichloro-s-triazine，Cyanuric Chloride)/1，4-二惡烷(1，4-dioxane)反應生成有色終點產物，該產物可在382nm處定量測定。通過制定馬尿酸標準曲線，可定量ACE活性。ACE活性(單位/升，U/L)定義為在Hurst氏法條件下37℃每分鐘產生一個μmol馬尿酸所需ACE酶量。
Paul L.Hurst和Chris J.Lovell-Smith.優化血清血管緊張素轉換酶的測定。臨床化學雜志。27/12，2048-2052(1981)[Paul L.Hurst and Chris J.Lovell-Smith.Optimized Assayfor Serum Angiotensin-Converting Enzyme Activity.Clin.Chem.27/12，2048-2052(1981)]盡管Hurst氏法可定量測定ACE活性，但實驗步驟復雜，不適于臨床生化檢驗。

發明內容
本發明在Buttery氏法中加入ACE標準品。用Hurst氏法確定ACE標準品的活性。再應用Buttery氏法以ACE標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的ACE活性。本發明解決了Buttery氏法的缺陷，提高了測試精確度、減少了儀器誤差和增強了ACE正常參考范圍數據的可比性。
以本發明的定標測定ACE的方法配制了測定ACE的試劑盒。
具體實施例方式
1.ACE標準品和其活性的確定1)ACE標準品成分0-200U/L人源基因重組ACE2)ACE標準品活性的確定參照Hurst氏法，在含0.2ml孵育緩沖液(200mM硼酸，2M氯化納pH 8.3)試管中加入0.1ml蒸餾水和0.1ml ACE標準品(0-200U/L)，37℃孵育5分鐘。加入0.1ml 20mM HHL底物溶液啟動反應15分鐘。加入0.5ml 1M鹽酸(HCl)溶液終止反應，30秒后加入0.5ml 1M氫氧化鈉(NaOH)中和反應。加入2ml 200mM磷酸鉀稀釋液pH 8.3，隨后1.5ml顯色液(3％氰尿酸氯化物溶于1，4-二惡烷)，混勻，靜止5分鐘，再混勻，每分3000轉離心10分鐘。取上清液在382nm處定量測定吸光度。用不同濃度馬尿酸(μmol/L)代替底物HHL，按上述方法同樣測取上清液在382nm處吸光度，以此畫出標準曲線。有ACE標準品的吸光度從標準曲線上求出對應的馬尿酸濃度(μmol/L)，將其除以反應時間15分鐘即得出ACE標準品活性(U/L)。ACE活性(U/L)定義為在Hurst氏法條件下37℃每分鐘產生一個μmol馬尿酸所需ACE酶量。
2.樣本ACE活性的測定參照Buttery氏法用ACE標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的ACE活性。
1)試劑組成ACE底物溶液含FAPGG的硼酸鹽緩沖液pH 8.22)生物樣本0-200U/L人源基因重組ACE。
3)試驗參數與操作步驟溫度37℃波長340nm比色杯光徑 1.0cm測試方法定時速率法反應方向負反應時間10分鐘樣本/試劑 1∶10水調零(340nm)予孵育 ACE底物溶液和樣本預溫至37℃啟動反應0.25ml ACE底物溶液+0.025ml樣本讀吸光值A0(340nm)孵育時間10分鐘終止反應讀吸光值A10(340nm)測試儀 Shimadzu UV-160
4)計算計算測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(ΔA/min)。
ΔA/min=(A10-A0)10]]>樣本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec其中ΔAx＝樣本ΔA/minΔAc＝標準品ΔA/minEc＝ACE標準品的活性(U/L)5)結果ACE線性范圍0-200(U/L)3.ACE測定試劑盒產品名稱血管緊張素轉換酶(ACE)檢測試劑盒型號生化試劑產品代碼DC-ACE規格ACE底物溶液150ml，ACE標準品(凍干)1ml/1瓶，ACE正常血清(凍干)1ml/1瓶，ACE異常血清(凍干)1ml/1瓶，600測試/盒。
檢測介質血清適用于體外診斷用途血管緊張素轉換酶(ACE)檢測試劑盒適用于體外定量測定人血清中血管緊張素轉換酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性。ACE測定有助于結節病的診斷、激素治療、高血壓和心衰ACE阻斷劑用藥療效的監測。
概述血管緊張素轉化酶(ACE)亦稱為激肽酶II是分子量為129KDa的二肽酰羧肽酶(EC3.4.15.1)。ACE在許多細胞上表達，諸如神經元細胞，近端腎小管細胞，尤其是內皮細胞。膜蛋白ACE可從膜上切除成為可溶性ACE進入血液循環。血清ACE顯著增高見于節結病和高血壓。
ACE連續監測法不僅適用于診斷/預后節結病，高血壓和心衰ACE阻斷劑用藥療效的監測，該法亦可用于篩選ACE阻斷物，后者是高血壓的有效治療藥物。ACE連續監測法準確性好、精密度高，適宜在臨床和新藥開發上推廣應用。
原理應用ACE酶解苯丙氨酰雙甘氨肽類化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，FAPGG)生成苯丙氨酰類化合物(furylacryloylphenylalanine，FAP)及雙甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反應造成340nm處吸光度下降。通過連續監測測定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度，再以ACE標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的ACE活性。
一個單位ACE活性定義為在本法條件下37℃每分鐘消耗一個微摩爾底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反應方程式如下 試劑盒組份每個ACE試劑盒含有1.ACE底物溶液150ml/1瓶2.ACE標準品(凍干)1ml/1瓶3.ACE正常血清(凍干) 1ml/1瓶4.ACE異常血清(凍干) 1ml/1瓶5.檢驗證明6.1份使用說明。
試劑組成ACE底物溶液 FAPGG緩沖液pH8.2ACE標準品人源基因重組蛋白ACE質控血清 人源基因重組蛋白和人血清試劑配制ACE底物溶液為液體試劑，可直接上機使用。
ACE標準品和ACE質控血清是凍干品，需要溶于1ml蒸餾水中方可使用。
試劑的穩定與貯存期試劑避光保存2-8℃一年。配制好的ACE標準品和ACE質控血清2-8℃可至少保存一月，-20℃冷凍可保存半年。
樣本收集僅用非溶血的血清。抗凝血漿含EDTA，它抑制ACE活性。血清中ACE活性2-8℃穩定7天，-20℃中半年。
試驗參數與操作步驟溫度37℃波長340nm比色杯光徑 1.0cm測試方法定時速率法反應方向負反應時間10分鐘樣本/試劑 1∶10水調零(340nm)予孵育 ACE底物溶液和樣本預溫至37℃啟動反應0.25ml ACE底物溶液+0.025ml樣本讀吸光值A0(340nm)孵育時間10分鐘終止反應 讀吸光值A10(340nm)計算計算測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(ΔA/min)。
ΔA/min=(A10-A0)10]]>樣本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec其中ΔAx＝樣本ΔA/minΔAc＝標準品ΔA/minEc＝ACE標準品的活性(U/L)注意事項1.試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。
2.若樣品ACE＞200U/L，也即用1cm比色杯光徑反應吸光值變化(A0-A10)大于0.1，須用生理鹽水稀釋樣品，結果乘以稀釋倍數。
3.如保存不當，試劑發現有混濁時，應棄用。
試劑性能線性范圍0-200U/L(r2＞0.998)精密度 批內CV 2.9％和批間CV 5.2％特異性 1.32mM Angiotensin I、4.68mM EDTA和15.6mM H-val-Trp-OH*2H2O分別抑制ACE活性82％、94％和93％。
穩定性 ACE底物溶液置于37℃下72小時對其效力無影響。
參考值正常人血清ACE活性參考值37-110U/L。建議各實驗室根據自身實驗條件自行訂定正常人血清ACE活性范圍。
儀器全自動、半自動生化分析儀或可見光分光光度計產品特征液體單試劑特異性測定ACE測定精密度高抗干擾能力強適合自動化快速測定參考文獻參閱實申參考資料。
權利要求
1.一種測定生物樣本中血管緊張素轉換酶活性的方法，其特征是借助Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉換酶標準品的活性，再應用Buttery氏法(1993)通過血管緊張素轉換酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以連續監測測定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的血管緊張素轉換酶的活性。
2.一種按權利要求1制造的測定生物樣本中血管緊張素轉換酶活性的產品，其特征是借助Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉換酶標準品的活性，再應用Buttery氏法(1993)通過血管緊張素轉換酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以連續監測測定FAPGG在340nm處吸光度下降的速度結合標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的血管緊張素轉換酶的活性。
全文摘要
Buttery(1993)的FAPGG速率法定量測定血管緊張素轉換酶活性在臨床化學檢驗上應用較為普遍。但是，Buttery氏法缺點在于沒能使用一種公認的標準法定標的血管緊張素轉換酶標準品，從而造成測試精確度下降，不同實驗室應用不同生化分析儀引起的儀器誤差，還是血管緊張素轉換酶正常參考范圍數據混亂、不可比性的主要原因。本發明用Hurst氏法(1981)確定血管緊張素轉換酶標準品的活性。再應用Buttery氏法以標準品的活性為參照，定量測定生物樣本中的血管緊張素轉換酶的活性。本發明解決了Buttery氏法的缺陷，提高了測試精確度、減少了儀器誤差和增強了血管緊張素轉換酶正常參考范圍數據的可比性。本發明還涉及用于進行上述方法的試劑盒。
文檔編號G01N21/33GK1693878SQ200510053208
公開日2005年11月9日 申請日期2005年2月6日 優先權日2005年2月6日
發明者蔡楓 申請人:浙江亞克藥業有限公司, 蔡楓