一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法
【專利摘要】本發明涉及一種高效篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法。該方法通過FLAG標簽的使用將哺乳動物細胞中過表達的血管緊張素轉化酶一步純化并固定至磁珠上，應用于天然藥物活性成分的篩選，并結合高效液相色譜?質譜法跟蹤評價酶抑制活性，使得篩選方法更為靈敏。該方法解決了純酶的快速制備問題；且通過真核細胞過表達目標酶，最大程度地保證了酶的功能，操作上較從動物組織提取酶更為簡便，減少因為操作繁瑣導致酶失活的情況發生，并大大降低酶制備純化的成本。
【專利說明】
一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]高血壓是威脅人類健康的重要疾病，血管緊張素轉化酶(ang1tensinconverting enzyme，ACE)廣泛存在于人體組織及血楽中，一方面催化血管緊張素I生成具有極強收縮血管的物質血管緊張素II，另一方面使具有血管舒張作用的激肽失活，轉化為無活性的緩激肽，導致血壓升高。ACE抑制劑(ACE inhibitor，ACEI)已作為治療高血壓的一線藥物應用于臨床，現有降壓藥物卡托普利、依那普利、賴諾普利、喹那普利等能顯著抑制ACE活性起到降壓作用，但人工合成的ACEI具有干咳、味覺功能紊亂及皮疹等不良反應(段練，世界中西醫結合雜志，2014，(11): 1247-251)。因此，目前開發新型、低毒副作用、安全天然ACEI的研究倍受關注，天然ACEI主要來源于食物、動物、植物及中藥等，臨床實踐與實驗研究表明，鉤藤、黃芪、葛根、羅布麻、杜仲等多種天然藥物具有降血壓作用(陳捷，海峽藥學，2012，24(6): 225-227)，且天然藥物具有安全性高、副作用小等特點，從天然藥物中篩選出新的ACEI將可能為高血壓的治療提供新的藥物。
[0003]根據ACE酶所處狀態不同，目前，篩選ACE抑制劑的方法主要有兩種，一種是均相溶液酶法，另一種是固相酶法。均相溶液酶法是以溶液酶作為酶源，通過檢測抑制劑加入組與空白對照組產物生成量的變化來評價其抑制活性，最常用的反應系統是緩沖液中ACE酶催化底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)生成產物馬尿酸(HA)系統，采用紫外分光光度法、高效液相色譜法、熒光法和毛細管電泳法等方法檢測產物馬尿酸的含量;固相酶法是將ACE酶進行固定化處理，利用其催化活性篩選或抑制劑與固定化酶的親和作用進行親和篩選。固相酶法與均相溶液酶法相比，具有反應過程可嚴格控制、可實現反應液與酶的快速分離、穩定性高、可重復使用降低成本等優勢。然而，目前將ACE固定化且用于天然藥物篩選的研究相對較少，洪韞嘉等(洪韞嘉，高等學校化學學報，2009，30(2):328-331)采用硫酸銨分級沉淀、透析平衡、親和分離等多種步驟純化豬肺ACE，得到高純度ACE，研究了殼聚糖固定化ACE的性質；周敬豪等(周敬豪，廣西大學，2013)采用共價交聯法將豬肺ACE酶固定至磁性殼聚糖微球，結果顯示固定化酶的pH值穩定性和熱穩定性均得到提高;Cristina M等(CristinaM, Journal of Agricultural&Food Chemistry，2006，54(19):7120-7124)使用瓊脂糖凝膠固定化ACE，并將其填裝成酶柱，從葵花籽、油菜桿蛋白水解液中親和篩選ACEI; Tang等人(Zhong,Analytical Chemistry，2006，78(8):2514-2520)通過吸附作用將ACE固定于毛細管柱上，通過測定抑制劑加入前后產物生成量的改變測定了多種中藥的抑制活性。上述兩種方法都需要用到大量純酶，ACE的主要來源一是購買商品化ACE，二是從動物組織中提取，商品化純酶價格昂貴，而從組織中提取純化ACE步驟繁瑣且易導致酶活力下降甚至失活。因此，采用適宜的方法在保持酶活的同時，獲取純化酶并采用合適的載體進行固定化處理是建立ACE抑制劑篩選方法的關鍵。
[0004]磁珠(ma gn e t i c b e a d s，MB)是一種新型的固定化載體，呈均勾球形，具有超順磁性，可在外加磁場作用下定向移動達到快速分離目標物的目的。磁珠兼具液體的流動性和固體磁性材料快速吸附等特點，且表面可引入多種功能基團，能與多種生物活性物質如蛋白質、核酸、酶和抗體等進行偶聯，廣泛應用于生物大分子純化、細胞分選、細菌等病原微生物檢測等方面。根據磁珠表面的功能基團不同，常見的商品化磁珠包括氨基磁珠、羧基磁珠、羥基磁珠、環氧基磁珠、氨基磁珠、鏈霉親和素磁珠、含標簽磁珠和偶聯抗體磁珠等。與傳統用于藥物篩選的固相載體相比，磁珠的比表面積更大、功能基團密度更高、可結合更多生物大分子;操作上只需要簡單的磁性分離，省去離心、色譜分離等步驟，具有快速、簡便、高通量、可重復使用、節約成本等優勢。
[0005]隨著基因分子生物學及蛋白質組學技術的發展，親和標簽為蛋白純化提供了簡單方便的純化工具，將標簽融合在目的蛋白的N端或C端表達融合蛋白，由于標簽可特異性地與相應配基親和，可達到快速純化目的蛋白的目的。常見的親和標簽有多聚精氨酸標簽(His-tag)、FLAG標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶標簽(GST-tag)、生物素-鏈霉親和素系統標簽(Strep-tag)等。FLAG標簽是由八個氨基酸(DYKDDDDK)組成的親水性多肽，與其特異性抗體結合達到純化目的，與其它標簽相比，FLAG標簽親水性強，易定位于融合蛋白表面，與其抗體親和力較強、特異性高且分子量較小，對目的蛋白結構及功能影響較小，因此，適合從更復雜的真核表達系統中純化蛋白。
[0006]本發明通過FLAG標簽的使用將哺乳動物細胞中過表達的ACE—步純化并固定至磁珠上，應用于ACE抑制劑的篩選。與之前方法相比較，通過免疫磁珠富集，解決了純酶來源問題;通過真核細胞過表達目標酶，操作上與從動物組織提取酶相比較更為簡便，很大程度上減少因為操作繁瑣導致酶失活的現象;利用真核細胞過表達，最大程度的保證了酶的功能；另外，利用高效液相聯合質譜法跟蹤監測，使得檢測結果更為靈敏。

【發明內容】

[0007]本發明提供一種哺乳動物過表達磁珠固定化ACE偶聯LC-MS—體化篩選技術，該方法精確、靈敏，為降壓藥物的研發提供技術支持。
[0008]—種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，該方法包括以下步驟:
[0009]步驟1:融合FLAG標簽的血管緊張素轉化酶質粒在大腸桿菌內的轉化、擴增和抽提；
[0010]步驟2: 293T/17細胞接種后瞬時轉染步驟I中抽提質粒；
[0011]步驟3:提取步驟2中細胞胞漿總蛋白；
[0012]步驟4:免疫磁珠富集并固定化步驟3中過表達的血管緊張素轉化酶；
[0013]步驟5:建立LC-MS檢測磁珠固定化ACE活性檢測方法；
[0014]步驟6:陽性藥驗證步驟4中所富集并固定化酶的活性；
[0015]步驟7:通過利用步驟4中富集并固定化的的靶標酶，篩選血管緊張素轉化酶抑制劑。
[0016]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟I中，融合FLAG標簽的血管緊張素轉化酶質粒在大腸桿菌內的轉化的時間為90s，質粒擴增時間為2_4h，質粒抽提最終洗脫液為100-300yL。
[0017]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟2中，293T/17細胞的接種密度為0.8 X 15個/CHi2-1.5 X 15個/cm2，接種后10_24h進行瞬時轉染，瞬時轉染采用轉染試劑轉染，轉染試劑為Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000和Exfect?中的一種。
[0018]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟3中，提取細胞胞漿總蛋白的時間為瞬時轉染后24_48h，提取細胞胞漿總蛋白的方法為超聲裂解法和裂解液裂解法中的一種，裂解液采用RIPA-NP40、RIPA-Triton-X100和M-PER中的一種，裂解時間為15min-60min，裂解溫度為 4°C。
[0019]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟4中，含FLAG標簽的融合蛋白與ANT1-DDK免疫磁珠通過特異性親和作用達到分離純化目的。通過構建不同目的蛋白或酶的FLAG融合表達載體質粒，可將其他目的蛋白純化并固定至磁珠上。磁珠分選架磁性分離免疫磁珠蛋白復合物的靜置時間為10s-120s，免疫磁珠富集靶標酶的用量比例為1:20-1:100(磁珠用量:胞漿總蛋白量，yL: yg)，免疫磁珠固定化靶標酶的溫度為4°C-37°C，固定化時間為2h-24h。
[0020]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟5中，可以利用產物HA在228nm處的紫外吸收采用分光光度計、酶標儀、高效液相紫外檢測器進行活性檢測，或毛細管電泳法、高效液相聯合質譜法等方法進行檢測，高效液相聯合質譜法可以在正離子模式以普萘洛爾為內標，跟蹤檢測產物生成量評價靶標酶活性。
[0021]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，步驟7中，所篩選對象可以是小分子單體化合物、小分子混合物、天然藥物提取物、多肽單體、多肽混合物。
[0022]本發明的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，通過構建不同目的蛋白或酶的FLAG融合表達載體質粒，在高轉染效率高表達的真核細胞如CH0、293T、293細胞中進行過表達，細胞裂解后與ANT1-DDK磁珠孵育，可將目的蛋白或酶純化并固定至磁珠上。同樣適用于將其它目標酶的底物與待測化合物與磁珠蛋白復合物孵育，通過檢測加藥組與空白對照組產物含量的變化篩選目標酶的抑制劑。
[0023]本發明將哺乳動物過表達磁珠固定化ACE偶聯LC-MS—體化技術應用于ACE酶抑制劑篩選，和現有方法相比，具有以下優點:
[0024]1、本發明通過在哺乳動物細胞中過表達ACE更能保證酶的功能，FLAG標簽的使用將過表達的ACE—步純化并固定在ANT1-DDK磁珠上，無需購買商品化純酶，操作上與從動物組織提取酶相比較更為簡便，很大程度上減少因為操作繁瑣導致酶失活的現象;通過快速磁性分離即可實現反應緩沖液與固定化酶的分離，無需離心、透析等復雜步驟，可增加產物收率、提高產物質量;且具有固定化酶貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控等優點；
[0025]2、本發明使用液質聯用技術(LC-MS)檢測待測物的ACE抑制活性，并使用內標減少系統誤差，在高效液相分離的同時利用質譜SIM模式檢測反應產物，可減少雜質對活性檢測的影響，具有精確性尚、重復性好、靈敏度尚的特點。
【附圖說明】
[0026]圖1為實施例結果(I)中不同比例磁珠與總蛋白孵育后的westernblot結果圖，
[0027]圖2為實施例結果(I)中總蛋白與磁珠不同孵育時間的western blot結果圖；
[0028]圖3為實施例結果(2)中產物馬尿酸的標準曲線；
[0029 ]圖4為實施例結果(3)中陽性藥卡托普利濃度抑制率曲線；
[0030]圖5為實施例結果(3)中陽性藥卡托普利濃度的對數與抑制率曲線圖；
[0031]圖6為實施例結果(4)中空白對照組S頂模式下的提取離子流圖；
[0032]圖7為實施例結果(4)中給藥組S頂模式下的提取離子流圖；
[0033]圖8為實施例結果(5)中空白對照組S頂模式下的提取離子流圖；
[0034]圖9為實施例結果(5)中給藥組S頂模式下的提取離子流圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳述，但本發明的實施方式不限于此。
[0036]實施例
[0037]I實驗材料與儀器
[0038](I)細胞及質粒:293T/17細胞(ATCC，美國)；感受態DH5a細胞(南京阿恩地，中國)；ACE 質粒(origene，美國)。
[0039](2)試劑:DMEM培養基(Corning，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；青霉素1kU/mL及鏈霉素 I OkU/mL (Invitrogen，美國)；Opt1-MEM 培養基(Invitrogen，美國)；SuperSignalWest Pico化學發光底物(Thermo，美國)；色譜純乙腈(Tedia，美國)；Mill1-Q系統制備(Millipore，美國)；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(sigma，美國)；馬尿酸(sigma，美國)；卡托普利(sigma，美國)；普萘洛爾(sigma，美國);ANTI_DDK磁珠(origene，美國)。
[0040](3)轉染試劑:
[0041 ] ExFect?轉染試劑(Vazyme，中國)；Lipofectamine 2000( Invitrogen，美國)；Lipofectamine 3000( Invitrogen，美國)。
[0042](4)三種裂解液:
[0043]A:RIPA-NP40(2mM Tris-HCl，150mM NaCl，I%NP_40，ImM EDTA，pH 7.0)；
[0044]B:RIPA-TritonX100(2mM Tris-HCl，150mM NaCl, I %Triton-XlOO, ImM EDTA，pH7.0)；
[0045]C: M-PER (Thermo，美國)。
[0046](5)0.1M硼酸緩沖液:稱取硼酸12.37g，加熱溶解后定容至IL備用。量取175mL硼砂緩沖液與325mL硼酸緩沖液混勻，使用NaOH調節PH至8.3，加入17.532g NaCl，加蒸餾水定容至IL，即可得0.1M硼酸緩沖液(PH 8.3，含0】NaCl)。
[0047](6)儀器:Thermo Scientific 1300A2 型超凈臺(Thermo，美國)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)；Synergy 2型酶標儀(B1tek，美國);C02培養箱(Thermo，美國);Frescol7離心機(Thermo，美國)；垂直電泳槽及等點聚膠儀(B1-Rad，美國)；化學發光成像系統(Tanon，中國)；Nano-100微量分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司，中國);KH_500DB型超聲波提取器(100Hz，220V);磁力分選架(英諾，中國);Agilent 1100HPLC(Agilent，美國)配備雙高壓栗、脫氣機、盤式自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器和單四級桿檢測器;Chemstat1n質譜工作站(Agi lent，美國)。
[0048]2實驗方法
[0049](I)融合FLAG標簽的ACE質粒在大腸桿菌內的轉化、擴增和抽提
[0050]取融合FLAG標簽的ACE質粒0.1yg置于1.5mL離心管內，加入20yL DH5a感受態細胞，輕吹打混勻后冰浴靜置30min，然后移入42 °C金屬浴靜置熱擊90s后迅速移入冰浴內冷卻3-5min，向離心管中加入480yL無菌液體LB培養基(不含抗生素)，吹打混勻后，37 °C搖床150rpm孵育4h(EP管內可見明顯渾濁)，取上述轉化后的感受態細胞適量，均勻涂抹于10mm固體LB培養基(含卡那霉素25yg/mL)，倒置培養，37 V孵箱內過夜培養至培養皿內可見明顯菌落，挑取生長狀態良好的菌落適量于液體LB培養基內(含卡那霉素25yg/mL)，37 V搖床220rpm孵育12h至培養瓶可見明顯渾濁，4°(:保存備用，采用質粒提取試劑盒(TIANGEN公司)提取質粒，最終加入120yL TB緩沖液洗脫質粒，Nano-100測定DNA濃度。
[0051](2)293T/17細胞接種后瞬時轉染并提取總蛋白
[0052]293Τ/17細胞接種于6孔板中，于37°C，5 %⑶2孵箱中培養至密度達到80% -90 %時進行轉染，整個轉染過程需在30min之內完成，轉染方法如下:
[0053]a)對于每孔細胞，使用200yL Opt1-MEM培養基稀釋5yg質粒，多孔操作可以批量制備，室溫放置5min。
[0054]b)對于每孔細胞，使用200yL Opt1-MEM培養基稀釋1yL ExFect?轉染試劑，多孔操作可以批量制備，室溫靜置5min。
[0055]c)以1:1的比例將轉染試劑-培養基混合物(第2步)緩慢滴加入質粒-培養基混合物(第I步)中，用移液器輕輕混勻后室溫靜置20min。
[0056]d)直接將上述質粒和轉染試劑形成的復合物緩慢滴加到6孔板中，400yL/孔。
[0057]e)37°C，5%⑶2孵箱中培養36h，一般培養24h時可添加不含抗生素的新鮮培養基ImL/孑Lο
[0058]總蛋白提取:
[0059]棄去大部分培養基后，吹打細胞并收集至1.5mL離心管內，100rpm X 5min離心后加入I3BS吹打混勻洗滌(重復3次)，每孔細胞加入250yL RIPA-NP40裂解液、RIPA-Triton裂解液、M-Per裂解液中的一種(含cocktaiI總蛋白酶抑制劑)，冰浴搖床上裂解30min后，13，000\101^11，4°(:離心收集上清，804測定蛋白濃度在5?1(^8/4^。
[0060](3)免疫磁珠富集并固定化過表達的血管緊張素轉化酶
[0061]a)取表面結合ant1-DDK多克隆抗體的免疫磁珠混懸液，加入1.5mL離心管中，將離心管置于磁珠分選架，靜置120s，使磁珠貼于近磁鐵的管壁一側。
[0062]b)吸出管內溶劑(注意不要碰觸聚集的磁珠)。
[0063]c)將離心管從分選架上取下，管內加入ImL空白RIPA裂解液(不加蛋白酶抑制劑)，混勻(輕輕搖動EP管，搖散磁珠，1s)，重新置于磁珠分選架，靜置120s，除去管內的空白裂解液。
[0064]d)重復步驟③，清洗磁珠，除去原磁珠液中的疊氮鈉等，活化磁珠。
[0065]e)將離心管從分選架上取下，加入適量空白RIPA裂解液(不加蛋白酶抑制劑)，混勻(輕輕搖動EP管，搖散磁珠，1s)，分裝至1.5mL離心管。
[0066]f)將離心管重新置于磁珠分選架，靜置120s，除去管內的空白裂解液。
[0067]g)取下離心管，加入轉染目的質粒組的細胞裂解液，搖散磁珠，置于搖床，4°C反應12h0
[0068]h)將含有免疫磁珠與細胞裂解液反應12h后樣品的離心管置于磁珠分選架靜置120s，吸取管內上清液并置于新的1.5mL離心管中，加入6 X SDS-PAGE上樣緩沖液，95°C金屬浴lOmin，冷卻后作為上清樣品。
[0069]i)用空白RIPA裂解液清洗磁珠I次，硼酸鹽緩沖液清洗2次，方法同步驟c)，棄去清洗液。
[0070]i)將離心管內留下的蛋白磁珠復合物重新溶于一定量空白RIPA裂解液中，加入6X SDS-PAGE上樣緩沖液，950C金屬浴1min，使目的蛋白與磁珠分離下來，12，OOOrpm離心5min，取上清液作為沉淀樣品。
[0071]蛋白磁珠結合實驗共對蛋白磁珠比例及孵育時間進行考察:取100yg、200yg、300yg、400yg、500yg總蛋白與5yL磁珠過夜孵育，不同孵育時間取300yg總蛋白與5yL磁珠進行孵育，共設Ih、2h、4h、過夜四個時間點。取出上清后加入ImL空白RIPA裂解液清洗3次，并加入6XSDS-PAGE上樣緩沖液變性，western blot檢測ACE及內參β-actin富集情況。
[0072](4)磁珠固定化ACE酶活性檢測實驗
[0073]取5yL蛋白磁珠復合物與150yL含25μΜ底物HHL的硼酸緩沖液在37°C搖床220rpm孵育90min，磁性分離取出反應緩沖液，加入等體積含0.5μΜ普萘洛爾的乙腈溶液，渦旋后13，OOOrpm離心I Omin，LC-MS進行檢測。
[0074]液相及質譜條件為:
[0075]色譜柱:VenusilXBP C18 4.6 X 200mm，5μηι;流動相:A相0.I % 甲酸水，B相乙臆；梯度洗脫:0-811^11，25%8;8-1211^11，25-70%8;12-1811^11，70-95%8;18-2511^11，95%8;進樣量:1yL ；流速:0.8mL/min ；檢測波長:228nm。質譜條件:干燥載氣流速:IIL/min ；干燥氣體溫度:325°C;霧化壓力:45psig;毛細管電壓:3500V;裂解電壓:120V;采用正離子模式進行檢測，提取離子為產物馬尿酸m/z 180、底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸m/z 430、內標普萘洛爾m/z 260ο
[0076]馬尿酸標準曲線:精密稱取并配置馬尿酸lmg/mL母液，稀釋至0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0yg/mL八個濃度，各取50yL分別加入50yL含0.5μΜ普萘洛爾的乙腈溶液，得到馬尿酸終濃度為0.025、0.05、0.10、0.250、0.50、1.00、2.50、5.0(^8/111匕渦旋后13，000離心10min，LC-MS進行分析；由馬尿酸做標準曲線計算磁珠固定化ACE中馬尿酸的生成量。酶活力定義:在上述條件下每分鐘水解25μΜ馬尿酰-組氨酰-亮氨酸生成ΙμΜ馬尿酸所需要的酶量為一個單位(Unit)。
[0077](5)陽性藥驗證固定化ACE活性
[0078]取ImM卡托普利母液(硼酸緩沖液溶解)母液，加入適量硼酸緩沖液稀釋至960nM、480nM、240nM、120nM、60nM、30nM、15nM、7.5nM、3.75nM9 個濃度，實驗組為不同濃度的卡托普利，空白對照組為相同體積的硼酸鹽緩沖液，取30yL不同濃度藥物加至150yL底物中，37°C孵育5min，取150yL含不同濃度的卡托普利的底物溶液與5yL蛋白磁珠復合物37 V搖床孵育90min，取出反應緩沖液，加入等體積含0.5μΜ內標普萘洛爾的乙腈溶液，渦旋后13，OOOrpm離心1min，LC-MS進行檢測，計算卡托普利ICso值。
[0079]磁珠固定化ACE酶抑制率計算
[0080]通過上述方法得到反應組和空白對照組反應產物HA和內標的峰面積，待測物的ACE抑制率IP為(AC/ISc-AS/ISa) X 100/AC/ISc，其中:IP為樣品對ACE的抑制率;AC為空白對照組中HA的峰面積;AS為反應組中HA的峰面積，IS為內標峰面積。
[0081 ] (6)三七提取物磁珠固定化ACE抑制活性實驗
[0082]稱取三七藥材粉末1g，放入錐形瓶中，加入100mL70%甲醇，超聲處理兩次，每次lh，過濾，合并濾液;減壓濃縮，再經冷凍干燥，制備所得凍干粉保存于密閉的干燥器中。精密稱取一定量三七凍干粉，DMSO進行溶解，硼酸緩沖鹽稀釋至終濃度60mg/mL，取30yL三七提取物與150yL含25μΜ底物HHL的硼酸緩沖液37 °C孵育5min，空白對照組為取30yL硼酸緩沖鹽，分別取150yL加至2yL蛋白磁珠復合物中，37°C220rpm搖床孵育90min，磁性分離取出上清，加入等體積含0.5μΜ內標普萘洛爾的乙腈溶液，渦旋后13，OOOrpm離心1min，LC-MS進行檢測，計算抑制率。
[0083](7)丹參提取物ACE抑制活性實驗
[0084]稱取丹參藥材粉末10g，放入錐形瓶中，加10mL90%乙醇，超聲Ih，過濾。濾液55°(:減壓濃縮，再經冷凍干燥，制備所得凍干粉保存于密閉的干燥器中。精密稱取-定量丹參凍干粉，DMSO進行溶解，硼酸緩沖液稀釋至終濃度60mg/mL，取30yL丹參總提物與150yL含25μΜ底物HHL的硼酸緩沖液37 °C孵育5min，空白對照組為取30yL硼酸緩沖鹽，分別取150yL加至2yL蛋白磁珠復合物中，37 °C 220rpm搖床反應90min，磁性分離取出上清，加入等體積含
0.5μΜ內標普萘洛爾的乙腈溶液，渦旋后13，OOOrpm離心1min，LC-MS檢測，計算抑制率。
[0085]3實驗結果
[0086](I)免疫磁珠富集并固定化過表達的血管緊張素轉化酶
[0087]蛋白磁珠不同比例及孵育時間實驗結果見圖1和圖2，總蛋白組含有過表達ACE和內參β-actin，沉淀組只含ACE，說明磁珠能選擇性固定化ACE，而不會沉淀其他蛋白。從結果中可以看出當蛋白比例增加時，沉淀組中ACE增加，當總蛋白為300yg時，繼續增加蛋白的量，固定化ACE不再增加，因此，蛋白磁珠比例為60yg總蛋白AxL磁珠。同理，孵育時間為過夜孵育。
[0088](2)磁珠固定化ACE酶活性檢測實驗結果
[0089]將各濃度HA峰面積/內標峰面積與濃度作圖，結果見圖3，結果顯示，HA濃度范圍在25ng/mL-5yg/mL時，線性范圍良好，5yL磁珠與300yg總蛋白過夜孵育，得到5yL蛋白磁珠復合物，與15(^(25口10底物冊1^，37°(:孵育901^11后，產物與內標的比值為1.441975886，代入標準曲線得到HA的含量為3.158643yg，即為0.017646μΜ。將在此條件下每分鐘生成ΙμΜ產物時所需酶量定義為IU，此時，固定化ACE酶量為0.196067mU。
[0090](3)陽性藥卡托普利抑ffjljACE IC5q的測定結果
[0091]卡托普利濃度抑制率曲線及濃度的對數值與抑制率關系如圖4和圖5所示:濃度的對數值與抑制率關系呈S型曲線，經計算IC5q為3.302nM。本實驗測得的IC5q與文獻報道相當，說明此方法可行。
[0092](4)三七提取物ACE抑制活性實驗結果
[0093]LC-MS檢測空白對照組和給藥組結果如圖6和圖7，空白對照組HA的出峰時間為6.888min峰面積為169533.4、冊1的出峰時間為8.799111丨11峰面積為2591313.5、15的出峰時間為14.787min峰面積為538086.5，給藥組HA的出峰時間為6.817min峰面積為45652.7、HHL的出峰時間為8.702min峰面積為5399599.5、15的出峰時間為14.81511^11峰面積為522406.4。利用軟件計算空白對照組和實驗組SM模式下HA和IS峰面積，按照ACE酶抑制率公式進行計算，10mg/mL三七提取物ACE抑制率為72.3 %。重復測定三次，計算抑制率，其RSD為4.76 %。該方法精密度高、重復性好。
[0094](5)丹參提取物ACE抑制活性實驗結果
[0095]LC-MS檢測S頂模式下空白對照組和給藥組結果如圖8和圖9，空白對照組HA的出峰時間為6.923min峰面積為193242.5、HHL的出峰時間為8.604min峰面積為2866574.5、IS的出峰時間為14.857min峰面積為475848.9，給藥組似的出峰時間為6.926111丨11峰面積為106959.1、冊1^的出峰時間為8.201111丨11峰面積為3794112.3、15的出峰時間為14.871111丨11峰面積為549610.8，利用軟件計算空白對照組和實驗組SM模式下HA和IS峰面積。按照ACE酶抑制率公式進行計算，10mg/mL丹參總提物ACE的抑制率為52.1 %。重復測定三次，計算抑制率，其RSD為3.37%o該方法精密度高、重復性好。
【主權項】
1.一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:融合FLAG標簽的血管緊張素轉化酶質粒在大腸桿菌內的轉化、擴增和抽提； 步驟2: 293T/17細胞接種后瞬時轉染步驟I中抽提質粒； 步驟3:提取步驟2中細胞的胞漿總蛋白； 步驟4:免疫磁珠富集并固定化步驟3中過表達的血管緊張素轉化酶； 步驟5:建立檢測磁珠固定化ACE活性的LC-MS方法； 步驟6:陽性藥驗證步驟4中所富集并固定化酶的活性； 步驟7:利用步驟4中富集并固定化的靶標酶，篩選血管緊張素轉化酶抑制劑。2.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟I中，融合FLAG標簽的血管緊張素轉化酶質粒在大腸桿菌內的轉化的時間為90s，質粒擴增時間為2-4h，質粒抽提最終洗脫液為100_200yL。3.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟2中，293T細胞的接種密度為0.8 X 15個/cm2-l.5 X 15個/cm2，接種后10_24h進行瞬時轉染，瞬時轉染采用轉染試劑轉染，轉染試劑為Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000和Exfec?中的一種。4.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟3中，提取細胞胞漿總蛋白的時間為瞬時轉染后24-48h，提取細胞胞漿總蛋白的方法為超聲裂解法和裂解液裂解法中的一種，裂解液采用RIPA-NP40、RIPA-Triton-X100和M-PER中的一種，裂解時間為15min-60min，裂解溫度為4°C。5.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟4中，免疫磁珠富集靶標酶的用量為1:20-1:100 (磁珠用量:胞漿總蛋白量，yL: yg)，免疫磁珠固定化靶標酶的溫度為4°C_37°C，固定化時間為2h-24h。6.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟5中，采用高效液相聯合質譜法進行檢測，以普萘洛爾為內標，跟蹤檢測產物產生量評價靶標酶活性。7.如權利要求1所述的一種篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的新方法，其特征在于，步驟7中，所篩選對象為小分子單體化合物、小分子混合物、天然藥物提取物、多肽單體、多肽混合物。
【文檔編號】G01N30/08GK105866260SQ201610167749
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月21日
【發明人】陳君, 賈冰潔, 湯維維, 李萍
【申請人】中國藥科大學