本發明屬(shu)于生物(wu)醫藥(yao)技術領域，具體涉及了一(yi)種(zhong)裂殖壺菌藻(zao)粕蛋白酶解(jie)肽的制備方法。

背景技術：

裂殖壺菌（Schizochytriumsp.）主要(yao)(yao)用(yong)(yong)途：是提(ti)(ti)取(qu)DHA（二(er)十二(er)碳(tan)六烯酸），其(qi)(qi)下腳(jiao)料藻(zao)粕中(zhong)不(bu)但(dan)含有微量殘余DHA，磷(lin)脂，而且含有豐富的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質，多(duo)肽，寡肽，氨(an)基(ji)酸以及多(duo)糖類等，是一(yi)(yi)(yi)種食品源的(de)(de)(de)(de)醫(yi)藥(yao)(yao)提(ti)(ti)取(qu)原材料，已經被證實(shi)其(qi)(qi)五毒無害無副(fu)作用(yong)(yong)。 其(qi)(qi)中(zhong)DHA是二(er)十二(er)碳(tan)六烯酸，俗稱腦黃金，是一(yi)(yi)(yi)種對人體非(fei)常重要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)多(duo)不(bu)飽和脂肪(fang)酸，屬于Omega-3 不(bu)飽和脂肪(fang)酸家族中(zhong)的(de)(de)(de)(de)重要(yao)(yao)成(cheng)員。從榨油下腳(jiao)料藻(zao)粕中(zhong)通過(guo)蛋白(bai)酶酶解(jie)的(de)(de)(de)(de)方法獲取(qu)醫(yi)藥(yao)(yao)用(yong)(yong)物(wu)質，是把廢(fei)物(wu)變成(cheng)寶貝，是一(yi)(yi)(yi)項(xiang)卓(zhuo)越的(de)(de)(de)(de)資源再利用(yong)(yong)，不(bu)但(dan)有重要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)醫(yi)藥(yao)(yao)用(yong)(yong)途，而且還(huan)對環境起到一(yi)(yi)(yi)定的(de)(de)(de)(de)保護作用(yong)(yong)。藻(zao)粕經過(guo)粉碎(sui)，酶解(jie)分(fen)離，干燥后得到的(de)(de)(de)(de)活性肽，具有顯著地抑菌、抗(kang)病毒、抗(kang)腫瘤、調節機體免疫(yi)力(li)的(de)(de)(de)(de)功效，是一(yi)(yi)(yi)種重要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)原材料或食品添加劑，具有顯著的(de)(de)(de)(de)社會和經濟(ji)效益。

技術實現要素：

本(ben)發明提供一種裂殖壺菌(jun)藻(zao)粕蛋白酶(mei)解肽(tai)的(de)制(zhi)(zhi)備(bei)方(fang)(fang)法(fa)。運(yun)用(yong)裂殖壺菌(jun)藻(zao)粕為原料，在(zai)實驗室研究基(ji)礎上，運(yun)用(yong)到(dao)車間中(zhong)，進行中(zhong)試生產所設計(ji)的(de)制(zhi)(zhi)備(bei)方(fang)(fang)法(fa)，為今(jin)后再進行大(da)規模生產奠定(ding)基(ji)礎。本(ben)發明，采用(yong)較廉價的(de)原材料，運(yun)用(yong)高效的(de)方(fang)(fang)法(fa)--生物酶(mei)解的(de)方(fang)(fang)法(fa)，制(zhi)(zhi)備(bei)具有顯著地抑菌(jun)、抗(kang)病毒、抗(kang)腫(zhong)瘤、調節機體免疫力的(de)生物活性(xing)肽(tai)，設計(ji)出相對(dui)應的(de)中(zhong)試生產工藝方(fang)(fang)法(fa)。為后期(qi)活性(xing)肽(tai)在(zai)食品添加(jia)劑，藥物輔料中(zhong)的(de)推廣及大(da)規模的(de)生產做好準備(bei)。

為實現此目的，本發(fa)明采用如下技術方(fang)案：

源于裂殖壺(hu)菌(jun)藻粕蛋(dan)白(bai)酶解(jie)肽的制備方法，以(yi)裂殖壺(hu)菌(jun)生產二十二碳(tan)六烯酸（DHA)的裂殖壺(hu)菌(jun)藻粕為原材料，先將(jiang)微(wei)藻粕粉(fen)碎成粉(fen)末，加入磷酸鹽(yan)緩沖液，然后加入食品級蛋(dan)白(bai)酶酶解(jie)，離心過濾(lv)，超濾(lv)，得濾(lv)液，噴霧干燥得到生物(wu)活性肽。

源于裂殖(zhi)壺菌藻粕蛋白(bai)酶解(jie)肽的制(zhi)備方法，其(qi)具體制(zhi)備步驟(zou)如下(xia)：

1)把裂殖壺(hu)菌(jun)藻粕粉碎至粉末無顆粒狀過120目(mu)篩網；

2)添(tian)加磷酸(suan)鹽緩沖(chong)液為PBS，pH值(zhi)為7.2-7.4，其中裂殖壺菌藻粕粉(fen)末(mo)的(de)重量是PBS的(de)體積(ji)的(de)8%-12%；

3)加(jia)入蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)是胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)和胃蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)即酶(mei)(mei)切位點包括賴氨(an)酸(suan)與精氨(an)酸(suan)的(de)酶(mei)(mei)類，此雙酶(mei)(mei)協同(tong)作用，按照1:1的(de)比例加(jia)入到(dao)上述的(de)裂(lie)(lie)殖壺菌(jun)藻粕混合(he)液中，其總加(jia)入質(zhi)量(liang)是裂(lie)(lie)殖壺菌(jun)藻粕粉末質(zhi)量(liang)的(de)3%-5%；

4)酶解(jie)(jie)條件是：36-38℃，轉速為30r/min-80r/min，酶解(jie)(jie)時(shi)間為6-8小(xiao)時(shi)；

5)酶解液離心過(guo)濾(lv)，取上清液， 上清液經過(guo)活性炭處理裝置除去腥(xing)味，過(guo)超濾(lv)設備即得1000Da以下的過(guo)濾(lv)液，再經過(guo)噴霧干(gan)燥(zao)機(ji)干(gan)燥(zao)，獲得生物活性肽粉末。

本發明的顯著優點是：本發明所涉(she)及一(yi)種(zhong)源(yuan)于裂殖壺菌藻粕蛋白酶(mei)解肽的制備方(fang)法，顯著特點歸結(jie)如下：

1）裂殖壺菌藻粕是生產DHA后的廢(fei)料，一種(zhong)變廢(fei)為寶做法(fa)；

2）在(zai)過濾液干(gan)燥(zao)的(de)部分采用噴霧干(gan)燥(zao)代替(ti)了傳統的(de)冷凍(dong)干(gan)燥(zao)的(de)方法(fa)，很大(da)程度上(shang)提高(gao)了干(gan)燥(zao)效率，便于(yu)生物活(huo)性(xing)肽的(de)擴(kuo)大(da)生產；

3）該活性肽(tai)具(ju)有顯著(zhu)地抑菌(jun)、抗炎癥、等功能，是一種綠色的藥物輔(fu)料，食品添加劑，具(ju)有顯著(zhu)的社會和(he)經(jing)濟效益。

附圖說明

圖1是生產工藝流程圖。

圖2是(shi)對比分析裂(lie)殖壺菌(jun)(jun)藻(zao)粕酶解(jie)前(qian)和酶解(jie)后(hou)的(de)質譜(pu)掃描圖，綜合峰(feng)面積(ji)數(shu)據，繪制每(mei)種肽含(han)量(liang)的(de)比例柱狀圖（新的(de)32個分子量(liang)即裂(lie)殖壺菌(jun)(jun)藻(zao)粕蛋(dan)白酶酶解(jie)肽）。

圖3、圖4、圖5、圖6是裂殖壺(hu)菌藻粕溶解液通過Q-TOF-MS/MS所得的質譜掃(sao)描(miao)圖（300-850 Da）。

具體實施方式

下(xia)面結(jie)合實施(shi)例，進一步闡述本發明。這些實施(shi)舉例僅用于說明本發明而不用于限制(zhi)本發明的范圍。

實施例1

將(jiang)裂殖壺菌藻DHA（二(er)十二(er)碳(tan)六烯酸(suan)）油下(xia)腳藻粕(po)(po)粉(fen)(fen)碎，過(guo)120目(mu)篩網。稱取(qu)粉(fen)(fen)碎藻粕(po)(po)10.0g，胰蛋(dan)白酶0.30mg，胃(wei)蛋(dan)白酶0.30mg，配置(zhi)磷酸(suan)緩沖溶液(ye)(ye)100mL于錐(zhui)形(xing)瓶中(zhong)，在搖(yao)床里進行(xing)酶解(jie).搖(yao)床溫度設(she)定(ding)為(wei)(wei)37度，攪拌轉(zhuan)速(su)為(wei)(wei)80r/min,酶解(jie)時(shi)間6小時(shi)。酶解(jie)液(ye)(ye)離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)取(qu)濾(lv)(lv)液(ye)(ye)，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)機(ji)的(de)(de)(de)轉(zhuan)速(su)設(she)定(ding)為(wei)(wei)4000 rpm，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)時(shi)間為(wei)(wei)10min。加入3%濾(lv)(lv)液(ye)(ye)體積的(de)(de)(de)活性粉(fen)(fen)末(mo)，攪拌均勻后(hou)靜止2小時(shi)，再(zai)離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)取(qu)濾(lv)(lv)液(ye)(ye)，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)機(ji)的(de)(de)(de)轉(zhuan)速(su)設(she)定(ding)為(wei)(wei)4000 rpm，離(li)(li)心(xin)(xin)(xin)時(shi)間為(wei)(wei)10min。濾(lv)(lv)液(ye)(ye)過(guo)超濾(lv)(lv)設(she)備，超濾(lv)(lv)設(she)備的(de)(de)(de)膜大小選(xuan)擇(ze)1000Da。將(jiang)過(guo)超濾(lv)(lv)設(she)備的(de)(de)(de)濾(lv)(lv)液(ye)(ye)，通過(guo)冷凍干(gan)燥機(ji)干(gan)燥，即刻獲(huo)得海藻肽粉(fen)(fen)末(mo)，該(gai)海藻肽粉(fen)(fen)末(mo)的(de)(de)(de)收率大概在40%左右，其中(zhong)32種新酶解(jie)肽含量比例(li)如(ru)圖2所示。

實施例2

將(jiang)裂殖(zhi)壺菌藻(zao)DHA（二十二碳六烯(xi)酸）油下(xia)腳(jiao)藻(zao)粕(po)粉(fen)碎，過(guo)120目篩網。稱取(qu)粉(fen)碎藻(zao)粕(po)10.0kg，胰蛋白(bai)酶(mei)(mei)0.30kg，胃(wei)蛋白(bai)酶(mei)(mei)0.30kg，配置磷酸緩沖溶液(ye)100L，并將(jiang)它們一起加入(ru)酶(mei)(mei)解(jie)罐中酶(mei)(mei)解(jie).其中酶(mei)(mei)解(jie)溫(wen)(wen)度設定(ding)為37度，攪拌轉速(su)為50r/min,酶(mei)(mei)解(jie)時間6小時。酶(mei)(mei)解(jie)液(ye)過(guo)離心機(ji)得澄清過(guo)濾液(ye)，離心機(ji)的轉速(su)設定(ding)為4000 rpm，將(jiang)過(guo)濾液(ye)通(tong)過(guo)活性炭處理設備(bei)除去腥(xing)味，再通(tong)過(guo)超濾設備(bei)，超濾設備(bei)的膜大小選擇(ze)1000Da。將(jiang)通(tong)過(guo)超濾設備(bei)的濾液(ye)，經過(guo)噴(pen)霧干(gan)燥機(ji)干(gan)燥，即刻獲得海藻(zao)肽(tai)粉(fen)末，該海藻(zao)肽(tai)粉(fen)末的收率大概在35%左右。，其中噴(pen)霧干(gan)燥的噴(pen)頭出口的溫(wen)(wen)度設定(ding)為溫(wen)(wen)度為200度，噴(pen)頭轉速(su)為20000r/min。

實施例3

取(qu)10g藻(zao)(zao)粕(po)粉(fen)(fen)、100ml PBS溶(rong)于(yu)250ml的(de)(de)(de)錐形(xing)瓶中(zhong)，不加(jia)(jia)酶，進行搖床10min，搖床溫度設(she)定(ding)為(wei)37度，攪拌轉(zhuan)速為(wei)80r/min,離(li)心(xin)(xin)(xin)取(qu)濾(lv)液(ye)，離(li)心(xin)(xin)(xin)機(ji)的(de)(de)(de)轉(zhuan)速設(she)定(ding)為(wei)4000 rpm，離(li)心(xin)(xin)(xin)時間為(wei)10min。加(jia)(jia)入3%濾(lv)液(ye)體積的(de)(de)(de)活(huo)性粉(fen)(fen)末(mo)，攪拌均勻(yun)后(hou)靜(jing)止(zhi)2小(xiao)時，再(zai)離(li)心(xin)(xin)(xin)取(qu)濾(lv)液(ye)，離(li)心(xin)(xin)(xin)機(ji)的(de)(de)(de)轉(zhuan)速設(she)定(ding)為(wei)4000 rpm，離(li)心(xin)(xin)(xin)時間為(wei)10min。濾(lv)液(ye)過超(chao)濾(lv)設(she)備(bei)(bei)，超(chao)濾(lv)設(she)備(bei)(bei)的(de)(de)(de)膜大小(xiao)選擇(ze)1000Da。將(jiang)過超(chao)濾(lv)設(she)備(bei)(bei)的(de)(de)(de)濾(lv)液(ye)，通(tong)過冷(leng)凍干燥(zao)機(ji)干燥(zao)，即(ji)(ji)刻(ke)獲得溶(rong)解(jie)(jie)(jie)的(de)(de)(de)藻(zao)(zao)粕(po)粉(fen)(fen)末(mo)。將(jiang)實(shi)施例1海藻(zao)(zao)肽粉(fen)(fen)末(mo)和藻(zao)(zao)粕(po)粉(fen)(fen)末(mo)，通(tong)過Q-TOF-MS/MS，即(ji)(ji)藻(zao)(zao)粕(po)酶解(jie)(jie)(jie)前與酶解(jie)(jie)(jie)產物進行成(cheng)分(fen)(fen)對比，質譜掃描結果(guo)如（圖(tu)3、圖(tu)4、圖(tu)5、圖(tu)6）所示。經過數據(ju)結果(guo)的(de)(de)(de)對比，共在酶解(jie)(jie)(jie)產物中(zhong)找到32個(ge)新的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子量，已在分(fen)(fen)子量下方用紅色短豎線標出(chu)。綜(zong)合峰面(mian)積數據(ju)，繪(hui)制每種肽含量的(de)(de)(de)比例柱(zhu)狀圖(tu)（如圖(tu)2所示），以便于(yu)確(que)定(ding)有效成(cheng)分(fen)(fen)。樣品成(cheng)分(fen)(fen)主要集(ji)中(zhong)300-850 Da之(zhi)間（圖(tu)3、圖(tu)4、圖(tu)5、圖(tu)6）中(zhong)分(fen)(fen)兩個(ge)區間予以顯(xian)示。藻(zao)(zao)粕(po)粉(fen)(fen)末(mo)經酶解(jie)(jie)(jie)后(hou)產物中(zhong)多出(chu)的(de)(de)(de)32個(ge)不同分(fen)(fen)子量的(de)(de)(de)成(cheng)分(fen)(fen)均集(ji)中(zhong)在該區域(yu)，各種生物活(huo)性便來(lai)源(yuan)于(yu)這32個(ge)分(fen)(fen)子量對應的(de)(de)(de)小(xiao)肽，即(ji)(ji)裂殖(zhi)壺菌(jun)藻(zao)(zao)粕(po)蛋白酶酶解(jie)(jie)(jie)肽。