本發明涉及微生物工程領域，特別是一種地衣芽胞桿菌高產桿菌肽的發酵培養基配方及其應用。
背景技術：
：桿菌肽是由10種氨基酸、12個氨基酸殘基構成的多肽類抗生素，淡黃色或類白色粉末，無嗅，味苦。桿菌肽含有A、B1、B2、B3、D1、D2、D3和E等多種組分，其中，組分A的活性最高，含量也最為豐富。桿菌肽可有效抑制革蘭氏陽性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。與此同時，桿菌肽具有在腸道內幾乎不吸收，排泄迅速，體內不殘留等優點，因此被廣泛添加于飼料中。目前，桿菌肽通過微生物發酵法生產，其主要生產菌株為地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。培養基的成分在微生物發酵生產過程中具有重要影響，尤其是對于次級代謝產物的生產。氮源是構成菌體物質和一些代謝產物的必需營養元素，氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，易導致pH值偏高，溶氧不足，不利于代謝產物的積累；氮源不足，則影響菌體生長繁殖，易引起菌體衰老、自溶等，從而影響發酵產量。地衣芽胞桿菌發酵主要是以餅粕為氮源，餅粕中含有氨基酸、維生素、無機鹽等營養成分，被作為工業發酵過程中常用的有機氮源。桿菌肽的原始培養基是以10%的豆粕為有機氮源，然而在培養基成分中，氮源除影響菌體生長和產物合成外，還決定了工業生產中的發酵成本。有機氮源能夠為菌體生長提供氮元素及必需的生長因子，選擇合適的有機氮源對提高桿菌肽產量以及降低原料成本具有重大意義。此外，菌種選育也是一種提高桿菌肽產量的有效策略。除了傳統的誘變育種外，基因工程手段也被越來越多的應用于菌種選育。有專利報道利用基因工程手段構建了一株攜帶絲氨酸乙酰轉移酶基因的地衣芽孢桿菌工程菌株，提高了細胞內半胱氨酸的含量，進而提高了桿菌肽產量，這說明細胞中半胱氨酸比例的提高可以提高桿菌肽的產量。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種地衣芽胞桿菌高產桿菌肽的發酵培養基配方及其應用，采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發酵原料，優化了地衣芽胞桿菌的發酵培養基配方，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養基提高了12.4%，同時降低了發酵成本，提高了地衣芽胞桿菌發酵桿菌肽的效益。為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明公開了一種地衣芽胞桿菌高產桿菌肽的培養基配方，培養基包括了種子培養基和生產發酵培養基，種子培養基為100g/L豆粕；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5g/LCaCO3；0.1～1.0g/L(NH4)2SO4，生產發酵培養基為100g/L豆粕、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/LCaCO3和0.5～2g/L(NH4)2SO4。優選的，種子培養基中100g/L豆粕替換為70g/L豆粕和20g/L菜籽餅，生產發酵培養基中100g/L豆粕替換為70g/L豆粕和20g/L菜籽餅。本發明還公開了一種地衣芽胞桿菌高產桿菌肽的培養基配方的應用，采用上述的培養基配方，應用步驟如下：種子培養：先將地衣芽胞桿菌活化，即從甘油管以體積百分比1%接種于裝有5mLLB培養基的PA瓶中，180～300rpm，溫度37℃，培養10～14小時，然后將菌種活化后的菌液以體積百分比按1%接種量接種與種子培養基后于180～300r/min，37℃中培養10～12小時；桿菌肽發酵：500mL三角瓶裝生產發酵培養基的液量為25～150mL，然后將種子培養的菌液以體積百分比2%接種量，180～300r/min，溫度37℃，發酵培養48小時。本發明具有以下有益效果：本發明通過發酵培養基優化，通過采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發酵原料，顯著提高了桿菌肽發酵產量，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養基提高了12.4%，同時對豆粕和菜籽粕的市場價格進行調研，豆粕的價格在3200元/噸左右小范圍波動，菜籽粕的平均價格在2800元/噸左右小范圍波動，發酵原料的替換顯著的降低了發酵成本，提高了地衣芽胞桿菌發酵桿菌肽的效益。附圖說明圖1為本發明實施例3單一氮源分析結果示意圖。圖2為本發明實施例4一種原料復配結果示意圖。圖3為本發明實施例4多種原料復配結果示意圖。圖4為本發明實施例5中50L發酵罐驗證復合氮源結果示意圖。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。實施例1本發明公開了一種地衣芽胞桿菌高產桿菌肽的培養基配方及應用，培養基包括了種子培養基和生產發酵培養基：種子培養基為100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽餅；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5g/LCaCO3；0.1～1.0g/L(NH4)2SO4。生產發酵培養基為100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽餅、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/LCaCO3和0.5～2g/L(NH4)2SO4。地衣芽胞桿菌培養桿菌肽步驟如下：種子培養：先將地衣芽胞桿菌活化，即從甘油管以體積百分比1%接種于裝有5mLLB培養基的PA瓶中，180～300rpm，溫度37℃，培養10～14小時，然后將菌種活化后的菌液以體積百分比按1%接種量接種與種子培養基后于180～300r/min，37℃中培養10～12小時；桿菌肽發酵：500mL三角瓶裝生產發酵培養基的液量為25～150mL，然后將種子培養的菌液以體積百分比2%接種量，180～300r/min，溫度37℃，發酵培養48小時。實施例2實驗目的及方法：為了驗證本發明中不同種子培養基和生產發酵培養基搭配使用對桿菌肽發酵產量的影響，本實施例以實施例1中所述的培養基配方及實施方法進行實驗驗證，具體實驗組別如下：表1不同種子培養基和生產發酵培養基搭配使用對桿菌肽效價影響結果實驗結果：通過上述不同種子培養基和生產發酵培養基搭配使用培養可以發現，在相同的培養情況下，采用菜籽餅代替部分豆粕進行培養基改機可以有效提高桿菌肽效價。實施例3實驗目的及方法：為了研究單一氮源對地衣芽胞桿菌發酵培養的影響，本實施例在發酵培養基中除氮源外其他成分不變的基礎上，分別添加100g/L的豆粕、花生餅粉、黃豆餅粉、低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅、棉籽餅、芝麻餅、魚粉作為單一氮源，比較它們對桿菌肽發酵的影響。其中低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅來自中國農業科學院油料作物研究所，豆粕、花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅、芝麻餅和魚粉購自湖北省國營三湖農場飼料廠。考慮到氮源種類不同，發酵周期可能會有差異，因此在發酵39、42、46、48、50小時，分別用高效液相色譜測定桿菌肽產量。實驗結果：如圖1所示，實驗結果表明桿菌肽發酵的最佳唯一氮源為豆粕，且發酵48小時，桿菌肽產量達到最高值。實施例4實驗目的及方法：為了研究復合氮源對地衣芽胞桿菌發酵培養的影響，本實施例以豆粕與一種原料復配、豆粕與多種原料復配進行研究，其中豆粕與一種原料復配的實驗方法如下：10%和9%豆粕分別添加1%其它原料（包括花生餅粉、黃豆餅粉、低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅、棉籽餅、芝麻餅、魚粉）作為復合氮源，10%豆粕單一氮源的設為對照，比較它們對桿菌肽發酵的影響。用高效液相色譜測定桿菌肽產量。豆粕與多種原料復配的實驗方法如下：采用9%豆粕和8%豆粕分別添加1%低蛋白菜籽餅（或高蛋白菜籽餅）和1%魚粉（或芝麻餅），未添加的設為對照，比較他們對桿菌肽發酵的影響。用高效液相色譜測定桿菌肽產量。實驗結果：如圖2所示，發酵結果表明：與10%豆粕相比，豆粕與菜籽餅復配效果最好。9%豆粕分別與1%低蛋白菜籽餅、1%高蛋白菜籽餅、1%魚粉和1%芝麻餅復配后，效價增加了8.4%、5.2%、1.6%和0.6%。其中菜籽餅1指低蛋白菜籽餅，菜籽餅2指高蛋白菜籽餅。如圖3所示，發酵結果表明：與9%的豆粕相比，8%豆粕中同時添加1%低蛋白菜籽餅和1%魚粉效果最好，效價提升22.4%，其次是8%豆粕中同時添加1%高蛋白菜籽粕和1%芝麻餅，效價提升14.2%。前面實驗表明豆粕、低蛋白菜籽餅和魚粉復配后可以提高桿菌肽產量，為了進一步優化三者的比例，設計了豆粕、低蛋白菜籽餅和魚粉的三因素三水平（參見表2）的正交試驗（參見表3），進一步優化氮源配比，并對正交試驗進行方差分析（參見表4），發現豆粕對桿菌肽效價影響極顯著，低蛋白菜籽餅對桿菌肽效價影響顯著，魚粉對桿菌肽效價影響不顯著。并通過考察豆粕與低蛋白菜籽餅的比例分別為8:1、7:2和6:3時桿菌肽的產量，從而確定桿菌肽發酵的最佳復合氮源為：豆粕7%+低蛋白菜籽餅2%。表2主要因素的正交實驗設計表3正交試驗結果表4正交試驗的方差分析因素偏差平方和自由度F比顯著性豆粕12233.92139.6**低蛋白菜籽餅4061.9246.4*魚粉150.121.7空列87.621.0誤差87.62注：F0.05(2,2)＝19.0，F0.01(2,2)＝99.0實施例5實驗目的及方法：本實施例以50L發酵罐驗證復合氮源的效果，實施方法為以復合氮源豆粕7%+低蛋白菜籽餅2%為優化組，以原始氮源豆粕10%為對照組，在50L發酵罐中對優化組的效果進行驗證，對照組和優化組除氮源外，其他條件完全相同。實驗結果：如圖4所示，對照組與優化組效價分別為755.3U/mL和849.3U/mL，與對照組相比，發酵結束時桿菌產量增加了12.4%。實施例6實驗目的及方法：本實施例進行菜籽粕的氨基酸組成分析，實施方法如下：分別稱取豆粕和低蛋白菜籽餅各0.1g于10mL水解管中，每種原料設三個平行，加6mol/L鹽酸5mL，密封好后放入100℃水浴鍋中水解24h,水解結束后定容并調節水解液的PH至中性。衍生化后進行GC-FID檢測。實驗結果：表5豆粕和菜籽餅中氨基酸的組成分析結果發現，菜籽粕中半胱氨酸的比例遠高于豆粕。同時我們對豆粕和菜籽粕的市場價格進行調研，豆粕的價格在3200元/噸左右小范圍波動，菜籽粕的平均價格在2800元/噸左右小范圍波動。以上實施例表明本發明通過發酵培養基優化，通過采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發酵原料，顯著提高了桿菌肽發酵產量，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養基提高了12.4%，同時降低了發酵成本，顯著提高了地衣芽胞桿菌發酵桿菌肽的效益。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3