腎素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種腎素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法，腎素化學發光免疫檢測試劑盒包括：腎素單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。這種腎素化學發光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發光免疫分析儀為檢測工具，完成腎素的檢測這種腎素化學發光免疫檢測試劑盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到1pg/mL，相對于傳統的腎素的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種腎素化學發光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。
【專利說明】
腎素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及體外檢測領域，尤其設及一種腎素化學發光免疫檢測試劑盒及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 腎素主要由腎小球旁細胞分泌，釋放入肺循環中的血管緊張素轉換酶的作用轉化 為血管緊張素 n。血管緊張素 n可直接使小動脈平滑肌收縮，外周阻力增加，從而使腎小管 遠端集合管鋼再增強，導致體內水與鋼滯留。血管緊張素 n和轉換酶等經常存在于血漿中， 因此腎素的釋放是決定血漿中血管緊張素濃度的關鍵性條件。
[0003] 高血壓是最常見的屯、血管疾病，其發病率逐年上升，并可引起嚴重的屯、、腦、腎并 發癥，是腦卒中和冠屯、病的主要危險因素。血漿腎素含量的檢測，可用于診斷高血壓，診斷 原發性醒固酬增多癥，W及為原發性高血壓病人屯、血管系統的并發癥的發生提供有效的信 息等。另外還可用于高血壓患者的預后評估。
[0004] 目前臨床檢測腎素的常見方法有酶聯免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學發 光法，但運些方法都存在著一些不足之處。
[0005] -、酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法巧LISA)被廣泛應用，但該方法也存在著下述的不足之處： (1) 使用12X8型、6X8型、8X12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反 應容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單 人份的檢測； (2) 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使 用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注 試劑的操作也極為繁瑣； (3) 缺少對檢測信息的相應標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知 悉檢測試劑的生產批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大 的隨意性； (4) 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影 響檢測結果的準確性； (5) 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復 雜，容易發生操作差錯，檢測結果的準確度和精密度較差； (6) 在檢測項目成套試劑的數量配置及使用上均為項目數X 48/96人份，如果需要檢 測10個項目，則試劑的配置及使用數須為10X48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10 個不同的項目，也需要配置10 X 48/96人份的試劑，存在著不夠經濟合理的缺點。
[0006] 二、放射免疫分析法 放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復雜、操作時間長、測定結果不 穩定、試劑保存時間短、試劑盒操作自動化程度低、配套儀器價格昂貴等不足之處。
[0007] 二、化學發光法 化學發光法按發光原理可分為直接化學發光和酶促化學發光。
[0008] 酶促化學發光主要有辣根過氧化物酶(皿P)和堿性憐酸酶兩種，但都有一定的局 限性，辣根過氧化物酶主要缺點為:魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會被H202 氧化自身發光，本底相對較高，影響信噪比，反應動力學復雜，影響因素多，結果不夠穩定， 要得到靈敏度高且平臺期長的底物不容易。堿性憐酸酶主要缺點為:底物達到平臺期的時 間長，底物成本高，導致檢測成本高，患者負擔重。
[0009] 叮晚醋作為標記物的直接化學發光相比酶促化學發光具有明細優勢，主要表現 在:反應不需要催化劑，只要堿性環境即可進行，反應迅速，背景發光低，信噪比高，干擾因 素少，試劑穩定性好，可W兩點定標，體系簡單，激發液成本低，叮晚醋易與蛋白質聯結，且 聯結后光子產率不減少。

【發明內容】

[0010] 基于此，有必要提供一種檢測靈敏度較高的腎素化學發光免疫檢測試劑盒及其制 備方法。
[0011] -種腎素化學發光免疫檢測試劑盒，包括:腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微 粒和抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。
[0012] 在一個實施例中，所述腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒中，所述腎素單克 隆抗體與所述簇基化的磁微粒的比例為1:25~35。
[0013] 在一個實施例中，所述抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物中，所述腎素單 克隆抗體與所述化學發光標記物的比例為50:1~10。
[0014] 在一個實施例中，所述簇基化的磁微粒的粒徑為0.05皿~1皿。
[0015] 在一個實施例中，所述化學發光標記物為魯米諾、異魯米諾、=聯化晚釘或叮晚 醋。
[0016] 在一個實施例中，還包括化學發光底物液，所述化學發光底物液包括A液和B液。 [0017]在一個實施例中，所述A液為出〇2溶液，所述B液為NaO田容液。
[0018] 在一個實施例中，還包括腎素定標品。
[0019] 在一個實施例中，所述腎素定標品為濃度分別為0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、 500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的腎素的溶液。
[0020] -種上述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟： 取簇基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入抓C水溶液， 活化簇基化的磁微粒的表面簇基，接著加入腎素單克隆抗體，室溫下混懸化~1化，磁分離去 除上清后用Tris緩沖液重懸，得到腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒;W及 取腎素單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發光標記物后混勻，室溫 下避光反應化~化后除雜，得到抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。
[0021] 運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒能夠W全自動化學發光免疫分析儀為檢測工 具，完成腎素的檢測運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到Ipg/ mL，相對于傳統的腎素的檢測方法靈敏度至少提高了 10倍，運種腎素化學發光免疫檢測試 劑盒的檢測精度較高。
[0022]
【附圖說明】
[0023] 圖1為一實施方式的腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法的流程圖； 圖2為實施例3得到的腎素標準曲線圖。
[0024]
【具體實施方式】
[0025] 為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實 施例對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節W便于 充分理解本發明。但是本發明能夠W很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術 人員可W在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施 的限制。
[00%] -實施方式的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，包括：腎素單克隆抗體包被的簇基 化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。
[0027] 優選的，腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒中，腎素單克隆抗體與簇基化的 磁微粒的比例為1:25~35。
[0028] 優選的，抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物中，腎素單克隆抗體與化學發 光標記物的比例為50:1~10。
[0029] 優選的，簇基化的磁微粒的粒徑為0.05皿~1皿。
[0030] 化學發光標記物可W為魯米諾、異魯米諾、=聯化晚釘或叮晚醋。其中，化學發光 標記物優選為叮晚醋。
[0031] 在其他的實施例中，上述腎素化學發光免疫檢測試劑盒還包括化學發光底物液。
[0032] 化學發光底物液包括A液和B液。A液可W為也化溶液，B液可W為NaO田容液。
[0033] 本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的也〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的化OH溶 液。
[0034] 在其他的實施例中，上述腎素化學發光免疫檢測試劑盒還包括腎素定標品。
[0035] 腎素定標品為濃度分別為化旨/1111^、5化旨/1111^、200口旨/1111^、50化旨/1111^、100化旨/1]1巧口 1600pg/mL的腎素的溶液。
[0036] 具體的，腎素定標品可W采用標準品緩沖液將腎素配制成濃度分別為Opg/mL、 50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的腎素的溶液。
[0037] 運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒用于腎素檢測時，利用全自動化學發光免疫分 析儀對腎素定標品進行檢測，繪制標準曲線，內置于電腦軟件;接著測試實際樣本，根據樣 本發光值計算樣本濃度；最后對腎素全自動化學發光免疫分析系統進行性能（靈敏度、線 性、精密度、干擾性)的評價。
[0038] 運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒能夠W全自動化學發光免疫分析儀為檢測工 具，完成腎素的檢測運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒，經過實驗，其檢測靈敏度達到Ipg/ mL，相對于傳統的腎素的檢測方法靈敏度至少提高了 10倍，運種腎素化學發光免疫檢測試 劑盒的檢測精度較高。
[0039] 此外，運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒還具有W下優點： 1、 選擇叮晚醋作為標記材料，并應用于化學發光免疫分析系統，該發光體系為直接化 學發光，與傳統的酶促化學發光相比，該反應不需要酶的參與，更加節約成本； 2、 選用叮晚醋的化學發光免疫分析系統線性范圍寬，能達到lpg/ni~ lOOOpg/mL，而傳 統的腎素的檢測方法的檢線性范圍為10pg/nO^~ 800pg/mL 3、 叮晚醋化學發光免疫分析系統重復性高，批內及批間差均在5%W內，運是其它化學 發光免疫分析系統難W達到的； 4、 化學發光免疫分析系統已實現樣本的定量，通過內置標準曲線到測試軟件，只需測 試樣本就可直接得到樣本的濃度值； 5、 化學發光免疫分析系統可W實現全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作 更加簡便，減少了人為的誤差。
[0040] 如圖1所示的上述腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟： 取簇基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入抓C水溶液， 活化簇基化的磁微粒的表面簇基，接著加入腎素單克隆抗體，室溫下混懸化~1化，磁分離去 除上清后用Tris緩沖液重懸，得到腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒。
[0041 ] MES(2-(N-嗎啡嘟）乙橫酸)緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。
[0042] Tris緩沖液的濃度為0.1 M并且含有2%BSA，pH為8.0。
[0043] 抓C(l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺）水溶液的濃度為10mg/W^~20mg/ mL，邸C與簇基化的磁微粒的比例為0.05:0.1~1。
[0044] 優選的，腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒中，腎素單克隆抗體與簇基化的 磁微粒的比例為1:25~35。
[0045] 優選的，簇基化的磁微粒的粒徑為0.05]im~1皿。
[0046] 取腎素單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發光標記物后混勻， 室溫下避光反應化~化后除雜，得到抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。
[0047] 碳酸鹽緩沖液濃度為0. lM，pH為9.0~9.5， 除雜的操作為離屯、脫鹽柱脫鹽，具體操作為：先分別用純凈水及TBS緩沖液（40 ml 化is-HCl ,0.5% BSA，1%化Cl, pH 8.0)處理離屯、脫鹽柱，最后加入得到的腎素單克隆抗體 包被的簇基化的磁微粒的溶液，最后收集離屯、管中的液體。
[0048] 優選的，抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物中，腎素單克隆抗體與化學發 光標記物的比例為50:1~10。
[0049] 化學發光標記物可W為魯米諾、異魯米諾、=聯化晚釘或叮晚醋。其中，化學發光 標記物優選為叮晚醋。
[0050] 得到的腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標記的化學 發光標記物組合即可得到上述腎素化學發光免疫檢測試劑盒。
[0051] 運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒在使用時，還需要化學發光底物液和腎素定標 品。
[0052] 化學發光底物液和腎素定標品可W自行配制得到。
[0053] 化學發光底物液包括A液和B液。A液可W為出化溶液，B液可W為NaO田容液。
[0054] 本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的出〇2溶液，B液為濃度為0.25mol/L的化OH溶 液。
[0055] 具體的，腎素定標品可W采用標準品緩沖液將腎素配制成濃度分別為Opg/mL、 50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1 OOOpg/mL 和 1600pg/mL的腎素的溶液。
[0056] 運種腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便，制得的腎素化學發光免 疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高，具有良好的應用前景。
[0化7] W下為具體實施例。
[0058] 實施例1:腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備 (1)腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微粒的制備： 取含有50mg粒徑為0.05皿~1皿的簇基化的磁微粒(MagnaBind21353)懸浮液，磁分離去 上清，用0.02 M，抑為5.5 MES緩沖液重懸，加入ImL新配置的1 Omg/mL的抓C水溶液，活化磁 珠表面簇基，加入4mg腎素單克隆抗體(biorbyt，貨號o;rb48780)，室溫下混懸化，磁分離，去 除上清，用含2%BSA的0.1M，pH為8.0的化is緩沖液重懸到Img/mL，得到腎素單克隆抗體包被 的簇基化的磁微粒，每瓶5mL分裝保存于4°C備用。
[0059] (2)抑制素單克隆抗體標記的叮晚醋的制備： 取50化濃度為25mg/mL的腎素單克隆抗體，加入15化L濃度為0.1M、pH為9.0~9.5的碳酸 鹽緩沖液，混勻，然后加入1.扣L濃度為5mg/血的日丫晚醋溶液混勻，室溫下避光反應，1.化后 取出，用2mL的zeba離屯、脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行 處理，最后加入得到的抑制素單克隆抗體標記的叮晚醋溶液，收集離屯、管中的液體至保存 管得到抑制素單克隆抗體標記的叮晚醋，每瓶5mL分裝保存于4°C備用。
[0060] (3)腎素定標品的制備： 用標準品緩沖液(40 mM Tris-肥1,0.5% BSA，1%化Cl,pH 8.0)將腎素配置成濃度為 0pg/mL、50 Pg /血、200pg /血、500 Pg /mL、1000 Pg /mL和 1600 Pg /mL,每瓶0.5 血分裝 凍干，4 °C保存備用。
[0061] 實施例2:腎素化學發光免疫檢測方法 W全自動化學發光免疫分析儀(Y化0,貨號iFlash3000)為檢測工具，方法學模式為雙 抗體夾屯、法，即儀器依次加入50化的樣品、50化的腎素單克隆抗體包被的簇基化的磁微 粒W及50 JiL的腎素處理液，反應20 min后，再加50 JiL的腎素包被的叮晚醋，反應20 min 后，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發光底物A液(也化)及B液(化OH)進 行發光反應，最后記錄發光值。
[0062] 實施例3:腎素化學發光免疫檢測試劑盒性能評價 采用實施例2中的方法對腎素定標品進行檢測，得到繪制標準曲線如圖2所示。
[0063] 接著對接著測試實際樣本，根據樣本發光值計算樣本濃度。
[0064] 靈敏度的檢測： 參照化SI EP17-A文件推薦實驗方案，計算腎素化學發光免疫檢測試劑盒的靈敏度， 求得的靈敏度為Ipg/ mL。
[00化]線性的檢測： 對濃度為I pg /mL、50 pg /mL、200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL標準品做線性分 析，計算線性相關系數，r=0.9996,另外，該試劑盒對腎素樣品檢測的線性范圍為Ipg/ml~ lOOOpg/mLo
[0066] 精密度測定： 取濃度為10化g/mL及lOOOpg/mL兩個腎素樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用S 批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內及批間差，結果表明該試劑盒批內及批間差均小于5%。
[0067] 干擾性實驗： 取混合血清分別添加干擾物包括:結合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油 醋，添加比例按照1:20進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值， 計算二者之間的偏差，W ±10%為可接受范圍。結果表明，干擾性均達到NCCLS的文件標 準，可用于臨床實驗室腎素狀況的準確評估。
[006引 實施例4、腎素化學發光免疫檢測試劑盒的對比實驗 分別用化學發光檢測方法和傳統的酶聯免疫吸附法對濃度為1 Pg /mL、50 Pg /mU 200pg /mL、500 pg /mL、1000 pg /mL、1600 pg /mL的腎素樣品做檢測，兩種方法檢測靈敏 度相比，數據如下表所示：
由上表可W看出，化學發光檢測方法的靈敏度較酶聯免疫吸附法提高了約10倍。
[0069] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保護范 圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，包括:腎素單克隆抗體包被的羧基 化的磁微粒和抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。2. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述腎素單克隆 抗體包被的羧基化的磁微粒中，所述腎素單克隆抗體與所述羧基化的磁微粒的比例為1:25 ~35〇3. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述抑制素單克 隆抗體標記的化學發光標記物中，所述腎素單克隆抗體與所述化學發光標記物的比例為 50:1~10〇4. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述羧基化的磁 微粒的粒徑為〇. 〇 5μηι~1 μL?。5. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述化學發光標 記物為魯米諾、異魯米諾、三聯啦啶舒或吖啶酯。6. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，還包括化學發光 底物液，所述化學發光底物液包括A液和B液。7. 根據權利要求6所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述A液為H2O2溶 液，所述B液為NaOH溶液。8. 根據權利要求1所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，還包括腎素定標 品。9. 根據權利要求8所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述腎素定標品 為濃度分別為 0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL 和1600pg/mL的腎素的溶 液。10. -種根據權利要求1~9中任一項所述的腎素化學發光免疫檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于，包括如下步驟： 取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液， 活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入腎素單克隆抗體，室溫下混懸2h~10h，磁分離去 除上清后用Tris緩沖液重懸，得到腎素單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒；以及取腎素單 克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發光標記物后混勻，室溫下避光反應Ih ~2h后除雜，得到抑制素單克隆抗體標記的化學發光標記物。
【文檔編號】G01N33/543GK105954509SQ201610506923
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】馮麗珠, 夏福臻, 錢純亙, 王剛, 祝亮
【申請人】深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司