專利名稱：血管緊張素轉換酶檢測試劑及其應用和檢測方法
技術領域：
本發明屬生化技術及生物化學檢驗技術。
血管緊張素轉換酶是一種膜結合糖蛋白，分子量為150000，含鋅，屬二肽羧基酶，能使血管緊張素I(十肽，由腎素轉化而成)肽鏈C端的組氨酸和亮氨酸殘基水解，形成具有增壓作用的血管緊張素Ⅱ(八肽)，后者進一步使血管收縮、血壓升高。血管緊張素轉換酶也能使具有降壓作用的舒緩激肽(九肽)脫去肽鏈C末端的苯丙氨酸和精氨酸殘基而滅活。血管緊張素轉換酶還能直接作用于腎上腺皮質，促進醛固酮分泌。因此，血管緊張素轉換酶是腎素-血管緊張素-醛固酮系統以及緩激肽系統的重要調節因素，影響人體多種生理機能。
血管緊張素轉換酶活性最早于1968年被測及，它廣泛分布于全身各組織。心血管疾病的共同病理基礎是血管緊張素轉換酶升高，尤其是高血壓病在亞臨床階段就已有ACE升高。體外定量測定血清中血管緊張素轉換酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性，可作為心血管疾病的早期診斷、藥物選擇、療效觀察以及呼吸系統疾病如結節病、肺癌和肝膽疾病等的特異診斷指標。迄今，體外測定血管緊張素轉換酶的方法有生物法、比色法、分光光度法、動力學法、放射性同位素法、熒光測定法及高壓液相色譜法等。但其共同的不足是靈敏度低、檢測時間長、所需檢測樣品量較大、不易在醫療機構普及等。
本發明的目的是提供一種血管緊張素轉換酶檢測試劑和使用該檢測試劑檢測血管緊張素轉換酶活性的方法，使其具有簡便、快速、靈敏、重復性好、所需血樣量和檢測試劑量少、適合于在全自動生化分析儀上應用、易于在醫院推廣等優點。
本發明提供的血管緊張素轉換酶檢測試劑是由呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG)、堅固黃(Fast Y)、弱酸和除垢劑組成的組合物。其中弱酸可使用硼酸；除垢劑可使用膽酸。
本發明檢測試劑及檢測方法的原理是反應底物呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(2-furanacyloy1-L-phenylalanylglycylglycine，FAPGG)在血管緊張素轉換酶作用下水解為呋喃酰基笨丙氨酸(FAP)和甘氨酰甘氨酸，呋喃酰基苯丙氨酸(FAP)進一步與顯色物質合成染料堅固黃(Fast Y)反應生成黃色化合物，該黃色化合物在405nm處吸光度增加率與血管緊張素轉換酶的活性成正比，檢測波長405nm處吸光度的變化，即可得出血管緊張素轉換酶的活性。
在使用硼酸產生弱酸性反應環境，使用膽酸作本發明檢測試劑之染料顯色反應的除垢劑時，本發明檢測試劑用于檢測時的水溶液濃度(每升檢測試劑溶液中各組分的含量)為呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L堅固黃0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L膽酸 5-2．0mmol／L本發明提供的血管緊張素轉換酶活性檢測方法，即將本發明檢測試劑用于檢測血管緊張素轉換酶活性的方法，包括
①將反應底物呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃條件下與待測血清(含血管緊張素轉換酶)反應；②在除垢劑存在條件下使呋喃酰基-L-苓丙氨酰甘氨酰甘氨酸與特測血清(含血管緊張素轉換酶)的反應產物進一步與合成染料堅固黃反應，生成黃色化合物；③在波長405nm處檢測該黃色反應產物吸光度的變化(△A／分)；④再根據公式 得出血管緊張素轉換酶活性。
其中弱酸性條件可由硼酸生成，除垢劑可使用膽酸。
本發明采用酶動力學方法測定樣本中酶活性，具有簡便、快速、靈敏、重復性好的優點。克服了現有技術靈敏度較差的缺點，其靈敏度高于現有技術一個數量級；現有紫外分析方法靈敏度ε為0.5434，而本發明檢測技術靈敏度ε為7000；與現有的紫外分析方法比較，其檢測所需時間夫為減少，由原來的30至60分鐘，減為5至10分鐘，可以滿足臨床上簡便快速的需要，且所需血樣量大為減少，紫外分析方法需血樣為0．1ml，而本發明方法僅需300μl；本發明技術適合于在Falcor全自動生化分析儀上應用，該儀器在醫院裝備較廣，故本發明技術易于推廣，對高血壓病的旱期診斷、鑒別診斷、藥物選擇、療效觀察具有十分重要的實用價值。同現有同類技術的血管緊張素轉換酶試劑及檢測方法相比，本發明也是使用PAPGG為底物，然而本發明血管緊張素轉換酶試劑使用了顯色物質堅固黃，使監測波長由345nm移到405nm，因而可以用普及較廣的生化分析儀(如法國產Falcor全自動生化分析儀)替代傳統方法使用的紫外分析儀進行監測，并使血管緊張素轉換酶試劑的測定底物減少，避免了儀器本身對底物濃度的限制，使FAPGG濃度能滿足使V接近Vmax；能有效避免FAP在345nm處光密度抵消作用。
實施例1．制備檢測試劑本發明檢測試劑由反應底物--呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸顯色物質--堅固黃產生弱酸性反應環境的物質--硼酸除垢劑--膽酸組成。
用蒸餾水或去離子水按以下濃度(以每升檢測試劑溶液中各組分的含量表示)配制用于檢測的本發明試劑溶液呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol／L堅固黃1mmol／L硼酸 80mmol／L膽酸 8mmol／L本發明檢測試劑復溶后2-8℃可穩定-周，室溫下穩定24小時。
2．檢測操作取待測血清30μl，加入上述檢測試劑溶液300μl，在37℃條件下作用1分鐘，在法國產Falcor全自動生化分析儀上405nm處連續記錄吸光度的變化(ΔA／分)，(反應時間3分鐘)。
3．計算及正常值根據公式即可得出所測結采[ACE(U/L)] 式中TV=反應總體積SV=樣本體積
ε=FAPGG微摩爾吸光系數d=光徑(cm)線性范圍0-300U/L正常值8-52U／L；超出上限為異常。
精密度批內CV＜1．2％；批間CV＜3．4％根據本實驗室條件，可選用手工測定或全自動生化分析儀，修改實驗參數使試劑∶樣本=9∶1；溶血、黃疸對實驗結果有影響。
權利要求
1．一種血管緊張素轉換酶檢測試劑，是由呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、堅固黃、弱酸和除垢劑組成的組合物。
2．根據權利要求1所述的血管緊張素轉換酶檢測試劑，其特征在于所說的弱酸為硼酸。
3．根據權利要求1、2所述的血管緊張素轉換酶檢測試劑，其特征在于所說的除垢劑為膽酸。
4．一種血管緊張素轉換酶檢測試劑，它是含有權利要求1至3中任一項所述物質的溶液。
5．根據權利要求4所述的血管緊張素轉換酶檢測試劑，在權利要求2和3限定下該檢測試劑溶液中各組分的濃度(每升檢測試劑溶液中各組分含量)為呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L堅固黃0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L膽酸 5-20mmol／L
6．根據權利要求5所述的血管緊張素轉換酶檢測試劑，其特征在于各組分的濃度(每升檢測試劑溶液中各組分含量)為呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol堅固黃 1mmol硼酸80mmol膽酸8mmol
7．權利要求1至6中任一項所限定的血管緊張素轉換酶檢測試劑用于檢測血管緊張素轉換酶活性。
8．一種血管緊張素轉換酶活性檢測方法，包括將反應底物呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃條件下與待測血清(含血管緊張素轉換酶)反應，其特征在于在除垢劑存在條件下使呋喃酰基-L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸與待測血清(含血管緊張素轉換酶)的反應產物進一步與合成染料堅固黃反應，生成黃色化合物，在波長405nm處檢測該黃色反應產物吸光度的變化(ΔA／分)；再根據公式ACE 計算血管緊張素轉換酶活性。
9．根據權利要求8所述的血管緊張素轉換酶活性檢測方法，其特征在于所說的除垢劑為膽酸。
10．根據權利要求8所述的血管緊張素轉換酶活性檢測方法，其特征在于所說的弱酸性條件由硼酸生成。
全文摘要
本發明提供的血管緊張素轉換酶檢測試劑,是由堅固黃、呋喃酰基－L－苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、弱酸和除垢劑組成的組合物,弱酸和除垢劑可分別由硼酸、膽酸構成;本發明采用酶動力學方法測定樣本中酶活性,具有簡便、快速、靈敏、重復性好、所需血樣量少等優點,其靈敏度高于現有技術一個數量級,檢測時間5至10分鐘,可以滿足臨床上簡便快速的需要,且適合于在Falcor全自動生化分析儀上應用。
文檔編號G01N33/50GK1282793SQ99116569
公開日2001年2月7日 申請日期1999年7月28日 優先權日1999年7月28日
發明者艾學蛟, 鄒光楣 申請人:武漢埃克瑪生物技術有限公司