專利名稱：精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法
技術領域：
本發明屬 于功能食品的檢測方法領域。
背景技術：
血管緊張素轉化酶是人體血壓調節的關鍵酶，抑制其活性是實現血壓調節的手段之一。以血管緊張素轉化酶體外抑制活性為評價指標，尋找、篩選具有血管緊張素轉化酶抑制活性的產物(如生物活性肽)是開發調節血壓的藥物和功能食品的基礎工作。已有方法中紫外可見分光光度法中的乙酸乙酯的殘留、底物(肽類)的干擾，通常會導致分析結果偏低；二元梯度洗脫高效液相色譜法，未考慮底物對測定結果的影響，也會導致分析結果偏低；高效液相色譜和質譜聯用法設備投資大，維護和分析成本高，不便普及使用。

發明內容
本發明目的在于提出一種準確、方便測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法。本發明的技術方案是在相同的色譜條件下分析，分別測定抑制劑不存在的條件下血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物中馬尿酸的峰面積A、抑制劑存在的條件下血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物中馬尿酸的峰面積B 和抑制劑存在、且不添加血管緊張素轉化酶的條件下在馬尿酸出峰位置相關肽的峰面積C ； 然后按(A- (B-C))/A X 100%公式計算，取得血管緊張素轉化酶體外抑制活性的抑制率。本發明針對紫外可見分光光度法和二元梯度洗脫高效液相色譜法在分析精準度上的不足，提出一種采用等梯度洗脫高效液相色譜法，扣除抑制劑本身的背景后，建立一種分析時間短、成本低、結果精確的血管緊張素轉化酶體外抑制活性測定方法。本發明操作過程簡單、方便，對比紫外可見分光光度法測定結果的準確性提高20 50%，對比二元梯度洗脫高效液相色譜法測定結果的準確性提高2 20%。本發明所述測定馬尿酸的峰面積A時的反應混合物的配置方法是
取10-50 μ L的血管緊張素轉化酶溶液和50-200 μ LHEPES緩沖液混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200-800 μ L HCl終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。本發明所述測定抑制劑馬尿酸的峰面積B時的反應混合物的配置方法是
取10-50 μ L的血管緊張素轉化酶溶液和50-200 μ L抑制物樣品混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200-800 μ L HCl終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。本發明所述測定相關肽的峰面積C的反應混合物的配置方法是
取90-130 μ L的HEPES緩沖液和50-200 μ L抑制物樣品混合置于37°C下水浴35min， 然后在混合體系中加入200-800 μ L HCl，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。


圖1為馬尿酸標準樣色譜圖。圖2為測定馬尿酸的峰面積A時的反應混合物的色譜圖。圖3為測定抑制劑馬尿酸的峰面積B時的反應混合物的色譜圖。圖4為測定相關肽的峰面積C的反應混合物的色譜圖。
具體實施例方式一、試劑配制
l、50mmol/L HEPES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液
稱量HEPES 1. 1915g，溶解于超純水中，用lmol/L氫氧化鈉溶液調節pH至8. 3，定容至 100ml。2,0. lU/ml血管緊張素轉化酶溶液
取0.1 U的血管緊張素轉化酶固體溶解于Iml 50mmol/L HEPES緩沖液中，另外加入氯化鈉 0. 0175g。3、2. 5mmol/L馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液
稱取馬尿酰組胺酰亮氨酸0. 1074g，溶解于50mmol/L HEPES緩沖液中，定容至100ml。4、抑制物樣品溶液
稱取0. 005g的抑制物凍干粉，溶解于50mmol/L HEPES緩沖液中，定容至100ml。5、lmol/L 鹽酸
取濃鹽酸8. 35ml，用超純水定容至100ml。二、色譜條件
Intertsil 0DS-SP柱(4. 6 X 250mm，5 μ m)；流動相50%甲醇(甲醇/超純水體積比， 1:1)，其中包含體積百分含量為0. 1%的三氟乙酸(TFA)，流速lmL/min，檢測波長228nm， 柱溫25°C ；檢測時間20min ；進樣量10μ L ；定量方法外標法。三、精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的操作過程 實施例1 以小黃魚酶解液為抑制劑
將小黃魚去頭、內臟，然后經絞成肉泥、溶解、加酶、恒溫酶解、滅酶(沸水浴，IOmin)、 離心(10000r/min,4°C，30min)處理，取得上清，再經旋轉蒸發濃縮、冷凍干燥，制成抑制劑凍干粉。1、抑制劑不存在的條件下，血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物馬尿酸的峰面積A的測定
取0. lU/mL的血管緊張素轉化酶溶液和50 μ L HEPES緩沖液混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200yL HCl (lmol/L)終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的濾膜過濾后進樣。 經色譜測定，取得馬尿酸的峰面積A。 2、抑制劑存在的條件下，血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物中馬尿酸的峰面積B的測定
取0. lU/mL的血管緊張素轉化酶溶液和50 μ L小黃魚酶解樣品(0. 05g/L)混合置于37°C下水浴5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200 μ L HCl (lmol/L)終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的濾膜過濾后進樣。經色譜測定，取得馬尿酸的峰面積B。3、抑制劑存在，且不添加血管緊張素轉化酶的條件下，在馬尿酸出峰位置相關肽的峰面積C的測定
取90 μ LHEPES緩沖液和50 μ L小黃魚酶解樣品(0. 05g/L)混合置于37 °C下水浴 35min,然后在混合體系中加入200 μ L HCl，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。經色譜測定，取得相關肽的峰面積C。4、計算小黃魚酶解液抑制劑的抑制率I : 將以上取得的各值分別帶入本發明公式 抑制率 I (%)= (A- (B-C)) /A X 100% 將以上取得的各值分別帶入原方法公式 抑制率 I ‘ (%) = (A-B) /A X 100%
可分別計算得到不同的抑制率I、I'。選取10個不同的小黃魚酶解液樣品，抑制劑在228nm波長下的光吸收對于測定結果影響程度平均為16. 73%。
權利要求
1.精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法，其特征在于在相同的色譜條件下分析，分別測定抑制劑不存在的條件下血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物中馬尿酸的峰面積A、抑制劑存在的條件下血管緊張素轉化酶與馬尿酰組胺酰亮氨酸反應的混合物中馬尿酸的峰面積B和抑制劑存在、且不添加血管緊張素轉化酶的條件下在馬尿酸出峰位置相關肽的峰面積C;然后按(A- (B-C /A X 100%公式計算，取得血管緊張素轉化酶體外抑制活性的抑制率。
2.根據權利要求1所述精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法，其特征在于所述測定馬尿酸的峰面積A時的反應混合物的配置方法是取10-50 μ L的血管緊張素轉化酶溶液和50-200 μ L HEPES緩沖液混合置于37°C下水浴5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200-800 μ L HCl終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。
3.根據權利要求1所述精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法，其特征在于所述測定抑制劑馬尿酸的峰面積B時的反應混合物的配置方法是取10-50 μ L的血管緊張素轉化酶溶液和50-200 μ L抑制物樣品混合置于37°C下水浴 5min，然后于同一溫度下加入80 μ L的馬尿酰組胺酰亮氨酸溶液水浴反應30min，最后在混合體系中加入200-800 μ L HCl終止反應，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。
4.根據權利要求1所述精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法，其特征在于所述測定相關肽的峰面積C的反應混合物的配置方法是取90-130 μ L的HEPES緩沖液和50-200 μ L抑制物樣品混合置于37°C下水浴!35min， 然后在混合體系中加入200-800 μ L HC1，樣品經孔徑為0. 22 μ m的針式濾器過濾后進樣。
全文摘要
精確測定血管緊張素轉化酶體外抑制活性的方法，屬于功能食品的檢測方法領域。針對紫外可見分光光度法和二元梯度洗脫高效液相色譜法在分析精準度上的不足，提出一種采用等梯度洗脫高效液相色譜法，扣除抑制劑本身的背景后，建立一種分析時間短、成本低、結果精確的血管緊張素轉化酶體外抑制活性測定方法。本發明操作過程簡單、方便，對比紫外可見分光光度法測定結果的準確性提高20～50%，對比二元梯度洗脫高效液相色譜法測定結果的準確性提高2～20%。
文檔編號G01N30/14GK102288711SQ201110121600
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者何佳易, 劉國艷, 徐鑫, 王之穎, 蔡麗麗, 魏曉蕊 申請人:揚州大學