專利名稱：一種血管緊張素酶抑制肽體外活性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種體外直接測定血管緊張素酶(ACE)抑制肽活性的高效液相色譜(HPLC) 分析方法，屬生物技術領域。本發明以茄參(Aai/Ji72a船/pao^J'oteW膠原肽作為ACE抑 制肽，通過多次試驗，得出一種直接進樣、等度洗脫便能達到良好分析效果的HPLC測定該 抑制肽體外活性的方法。該方法經驗證，也適用于其他水產膠原ACE抑制肽體外活性的測定， 具有操作簡便、重復性好、靈敏度和準確性高等優點。
背景技術：
原發性高血壓是由多種因素引起的，其中包括遺傳，飲食習慣，精祌狀態等。研究表明血壓正常與否，與腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統密切相關，而血管緊張素酶(ACE) 在上述兩個系統中都起著重要的調節作用，造成血壓的升高，引發高血壓。水產膠原ACE抑 制肽是從水產品膠原蛋白中提取出的具有ACE抑制活性的多肽，它通過抑制血漿和血管內皮 細胞ACE的活性,達到降低血壓的目的。水產膠原ACE抑制活性肽具有安全性高；降壓效果溫和、專一、持久；無副作用的優點。 它在食品和醫藥領域中具有廣闊前景。因此，在分離鑒定ACE抑制肽的過程中，有必要開發 一種簡便、靈敏及可靠的分析方法對ACE抑制肽的體外活性進行檢測。Cushman和Cheung建 立的乙酸乙酯萃取法是體外檢測ACE活性及抑制程度最常用的方法。該方法通過測定ACE酶 解馬尿酰一組氨酰一亮氨酸(Hip-His-Leu，朋L)生成的馬尿酸(Hip)的量來確定ACE的活性。 當ACE與ACE抑制劑作用后，ACE活性受到抑制，其與Hip-His-Leu作用生成的馬尿酸量減 少，測定加入抑制劑前后的馬尿酸的生成量即可反映抑制劑對ACE的抑制程度。這種方法先 是從反應混合物中用乙酸乙酯萃取馬尿酸，然后在高溫或真空條件下蒸干乙酸乙酯，最后把 馬尿酸重新溶于水中，在波長228皿處用分光光度計進行定量測定。其操作繁瑣，而且用乙 酸乙酯萃取馬尿酸的同時也將一部分Hip-His-Leu萃取出來，而Hip-His-Leu在228 nm處也 具有強吸收，致使分析結果偏高。在應用HPLC檢測ACE抑制劑體外活性的初期研究中，其檢 測樣品是乙酸乙酯萃取物；2002年，Wu等提出一種改進的直接用HPLC測定ACE催化反應的 方法，但采用的洗脫方式是梯度洗脫；2005年，吳瓊英等建立了等度洗脫的HPLC測定ACE 抑制劑活性的方法。該方法對化學合成的卡托普利等治療高血壓藥物有良好的分析效果，但 對水產膠原ACE抑制肽的體外活性分析卻不是很理想。本發明建立了一種直接進樣、等度洗脫的HPLC分析方法，該方法適用于水產膠原ACE 抑制肽體外活性的測定，具有操作簡便、重復性好、靈敏度和準確性高等優點。

發明內容
本發明以茄參"c卵^/朋M^w^ioiofeaJ膠原肽作為ACE抑制肽，通過多次試驗，得出 一種直接進樣、等度洗脫便能達到良好分析效果的HPLC測定該抑制肽體外活性的方法，它能 彌補現有技術的上述不足。一種體外直接測定ACE抑制肽活性的高效液相色譜(HPLC)分析方法，其特征是取一定濃 度的ACE抑制肽溶液(茄參膠原肽)30 40ul,加入20 40ul ACE溶液(25mU/ml)，在37。C下 保溫4 5 min后加入30 50ul HHL溶液開始反應，在37。C條件下反應30 60 min后加入150 200ul 1. 0 mol/L HC1終止反應，得到反應液，未加酶抑制劑的反應為空白對照。反應液經過 0.45um濾膜過濾后用Zorbax SB-<:18分析柱(4.6X200 mm，填料粒徑5咖)進行分析，條件 為柱溫25。C，流動相是乙腈一超純水(體積比為50: 50，各含O. 05%三氟乙酸)，流速O. 4ml/min， 檢測波長228 nm，進樣量10ul 20ul。計算公式為<formula>formula see original document page 4</formula>
R為ACE抑制肽樣品對ACE的抑制率(％);A為空白對照組(用硼酸緩沖液替代ACE抑制肽)中馬尿酸的峰面積(mAU*s); B為添加ACE抑制肽組中馬尿酸的峰面積(mAU s)。


-圖l是空白對照組中馬尿酸(Hip)的色譜圖，馬尿酸的出峰時間為7.085 min，峰面積為 2216.5 (mAU.s)。圖2是添加茄參膠原肽(ACE抑制肽)組中馬尿酸的色譜圖，馬尿酸的出 峰時間為7.093 min，峰面積為238. 3 (mAU s)。圖1和圖2顯示馬尿酸能夠從混合液中被很 好的分離出來。根據公式計算，茄參膠原肽對ACE的抑制率為89. 3%。 ACE抑制肽組中馬尿酸的 峰面積重復測定3次，其相對標準偏差(RSD)為0.2%，方法的精密度高、重復性好。
具體實施例方式取2.0 mg/ml的茄參膠原肽溶液40ul,加入40ul ACE溶液(25mU/ml)，在37。C下保溫 5 min后加入50ul HHL溶液開始反應，在37。C條件下反應60 min后加入200ul 1. 0 mol/L HC1 中止反應，得到反應液。同時用40ulpH8.3的硼酸緩沖液替代膠原肽溶液來制備反應液，作 為空白對照組。反應液經過0.45um濾膜過濾后用ZorbaxSB-ds分析柱(4. 6X200咖，填料 粒徑5 um)進行分析，條件為柱溫25°C，流動相是乙腈一超純水(體積比為50: 50，各含 0.05%三氟乙酸)，流速0. 4 ml/min，檢測波長228 nm，進樣量20ul。根據公式計算，茄參膠原肽對ACE的抑制率為89. 3%， ACE抑制肽組中馬尿酸的峰面積重復測定3次，其相對標準 偏差(RSD)為0.2%。經驗證，該方法也適用于其他水產膠原ACE抑制肽體外活性的測定， 具有操作簡便、重復性好、靈敏度和準確性高等優點。
權利要求
1.一種體外直接測定血管緊張素酶抑制肽活性的高效液相色譜(HPLC)分析方法，其色譜條件為Zorbax SB-C18分析柱(4.6×200mm，填料粒徑5um)，柱溫25℃，流動相為乙腈一超純水(體積比為50∶50，各含0.05％三氟乙酸)，流速0.4ml/min，檢測波長228nm，進樣量10ul～20ul。
2. 反應液的制備取一定濃度的ACE抑制肽溶液30 40ul，加入20 40ul ACE溶液(25mU/ml)， 在37。C下保溫4 5 min后加入30 50ul HHL溶液開始反應，在37。C條件下反應30 60 min 后加入150 200ul 1.0 mol/L HC1中止反應，得到反應液。同時用30 40ul pH8. 3的硼酸 緩沖液替代ACE抑制肽溶液來制備反應液，作為空白對照組。反應液經過0.45um濾膜過濾 后用HPLC進行分析。
全文摘要
本發明涉及一種體外直接測定血管緊張素酶(ACE)抑制肽活性的高效液相色譜(HPLC)分析方法，屬生物技術領域。本方法以茄參(Acaudina Molpadioidea)膠原肽作為ACE抑制肽，通過多次試驗，得出一種直接進樣、等度洗脫便能達到良好分析效果的HPLC測定該抑制肽體外活性的方法。該方法經驗證，也適用于其他水產膠原ACE抑制肽體外活性的檢測，具有操作簡便、重復性好、靈敏度和準確性高等特點。
文檔編號G01N30/00GK101246148SQ20071011491
公開日2008年8月20日 申請日期2007年11月19日 優先權日2007年11月19日
發明者曾名湧, 李八方, 雪 趙, 趙元暉 申請人:中國海洋大學