基于微球的杯式時間分辨熒光bnp分析方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法及試劑盒；包括在檢測反應杯內表面包被BNP單抗或多抗；將時間分辨熒光微球與BNP單抗或多抗共價鍵交聯制備得到熒光標記抗體；將待測BNP樣品加入包被后的檢測反應杯內，再加入所述熒光標記抗體，25℃～40℃溫育；清洗去除未結合的抗原及熒光標記抗體，在340～380nm激發光激發下，測試檢測反應杯中熒光信號；將所述熒光信號與標準曲線比對，獲得所述待測BNP樣品的BNP濃度。本發明可以在較短的檢測時間內完成檢測，縮短了檢測時間，并有效的提高了檢測靈敏度。
【專利說明】
基于微球的杯式時間分辨焚光BNP分析方法及試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明涉及BNP檢測技術領域，具體涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分 析方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 心力衰竭(Heart Failure)是一種由于心臟功能障礙而產生的體征和癥狀的臨床 綜合征。雖然現在的一些藥物如血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑、受體阻斷劑等可以明顯 改善患者的生存質量，延緩病情的惡化，但除非進行心臟移植，否則心力衰竭是無法治愈 的。心力衰竭早期的診斷和避免病情的惡化是當今醫療保健面臨的關鍵問題，越早開始治 療，對病人就越有益。
[0003] 然而，心力衰竭(尤其是在心衰早期）是很難確診的。心衰的典型癥狀，如呼吸急 促、踝關節腫脹、疲勞等都不具特異性，有些病情輕微的患者也沒有表現出典型癥狀，尤其 是老年患者和肥胖患者，即使有這些癥狀也很難解釋。因此，初級醫療機構僅依賴臨床標準 作為診斷依據，診斷心力衰竭的假陽性率可高達50%。目前診斷心衰最常用有效的方法主 要有超聲心動圖、放射核素顯像和心核磁共振檢查;但是日常實際診斷左心室功能衰竭時， 上述檢查手段沒有一項是可以完全信賴，并具有良好的重現性的。
[0004] 有研究顯示，心衰患者BNP(B型腦鈉肽）的升高水平與死亡率的上升及重入院的風 險性密切相關。BNP的含量與心室的壓力、呼吸困難的程度以及急速調節系統的狀況相關。 心室的體積和壓力增高可導致血漿內BNP的升高，升高的程度與心室擴張和壓力超負荷成 正比，可敏感和特異性的反映左心室功能的變化。用BNP輔助診斷心力衰竭，判斷病情的嚴 重程度和預后。
[0005] 呼吸困難多由心肺疾病引起，鑒別心源性哮喘與肺源性哮喘經常令醫生感到困 難。研究發現對急性呼吸困難患者進行BNP檢測，心力衰竭的患者BNP水平平均值明顯高于 肺部疾病患者，從而證實BNP能快速鑒別呼吸困難的病因。
[0006] 有大量一手資料表明，BNP可用于指導心衰的治療。大劑量的藥物治療心衰后，血 清或血漿的BNP水平會下降，以BNP水平來指導藥物治療，不僅減少了心血管事件的總發生 數，而且與臨床指導治療方案相比，延遲了首次發生心血管事件的時間。因此，依據BNP水平 指導臨床治療，是一項有效的心衰治療措施。
[0007] 有些表現心衰癥狀的患者可能認為自己沒有得到足夠的治療。但是，如果這些患 者的BNP水平正常，可能就意味著這些患者已經受到適當的治療而無須強化治療(避免"治 療過度"），因為他們的癥狀可能與心衰無關。
[0008] 傳統上多用化學發光法及膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析法等測定BNP。化 學發光法對技術要求高，操作步驟相對比較繁瑣，需要多步試劑添加過程。膠體金免疫層析 法雖然具有標本用量少，簡便快速，便宜的優勢，然而當遇到某些樣品中抗原或抗體含量極 低時，膠體金的顏色將很淺甚至無顯色，很難用肉眼來判斷結果，容易出現誤判，靈敏度較 低。熒光免疫層析法雖然靈敏度比膠體金免疫層析法要高，但是其檢測精密度并不理想，靈 敏度與大型化學發光或者電化學發光儀器仍有差距。
[0009] 時間分辨焚光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一種非同位素焚光標記物， 與普通熒光相比，具有Stock位移大，熒光壽命長等特點，可以有效的避免樣品中的本底熒 光，以及激發光等雜散光的影響，因此相比普通熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。
[0010] 目前市面上采用時間分辨熒光檢測的試劑均采用解離增強鑭系元素熒光免疫分 析(DELFIA)，它采用具有雙功能基團結構的螯合物，使其一段與銪(Eu)連接，另一端與抗 體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應后形成免疫復合 物，由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，需要加入一種解離增強劑，使得銪離子從復 合物上解離下來，并與增強劑中的另一種螯合劑形成膠態分子團，這種分子團在紫外光的 激發下能發出很強的熒光。

【發明內容】

[0011] 本發明的目的在于克服上述現有熒光免疫層析法測定BNP檢測精密度不理想以及 時間分辨熒光檢測法需要解離增強過程，檢測步驟繁雜、時間長、精度差等不足，提供一種 基于微球的杯式時間分辨焚光BNP分析方法及試劑盒。該方法基于時間分辨焚光微球可高 靈敏度定量檢測BNP。
[0012] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0013] 第一方面，本發明涉及一種基于微球的杯式時間分辨焚光BNP分析方法，所述方法 包括如下步驟：
[0014] S1、在檢測反應杯內表面包被針對BNP特定抗原識別位點的一個或多個抗體(所述 抗體為單克隆抗體或者多克隆抗體，或者多個抗體的組合形式；即，包被BNP單抗或者多 抗)；
[0015] S2、將時間分辨熒光微球與BNP單抗或者多抗通過共價鍵交聯制備得到熒光標記 抗體；
[0016] S3、將待測BNP樣品加入步驟S1包被后的檢測反應杯內，再加入所述熒光標記抗 體，25°C~40°C溫育；
[0017] S4、清洗去除未結合的抗原及焚光標記抗體，在340~380nm激發光激發下，測試檢 測反應杯中熒光信號；
[0018] S5、將所述熒光信號與標準曲線比對，獲得所述待測BNP樣品的BNP濃度。
[0019]優選的，所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物。
[0020] 優選的，所述鑭系元素螯合物為Eu (TTA) 3/T0P0或Eu(TTA) 3/Phen (其中TTA為噻吩 甲酰三氟丙酮(Thenoyltrif luoroacetone)，T0P0為三辛基氧化膦，Phen為鄰菲略啉）。
[0021 ]優選的，所述時間分辨熒光微球的粒徑范圍為100~lOOOnrn。
[0022]優選的，所述時間分辨熒光微球為前處理后的羧基時間分辨熒光微球;所述前處 理包括:加入MES和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15~60min，加入MES、NHS 和EDC進行再次活化處理;每lmg羧基時間分辨熒光微球對應10~100ul 50mM氨基己酸。 [0023] 更優選的，所述初次活化處理包括：每lmg羧基時間分辨熒光微球，加60ul500mM MES( 2-(N-嗎啡啉）乙磺酸）緩沖液pH5.0~7.0，加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400yL，室溫混勻15~60min;所述再次活化處 理包括:加入所述氨基己酸室溫混勾后，加lmLIOOmM MES pH6.0,離心清洗15000rpm 10~ 25min，棄去上清；加400ul 100mM MES pH6.0,超聲分離，加0.02~0.2mg N-羥基琥I自酰亞 胺(NHS)，加0.01~O.lmgEDC，室溫混勻10~20min;加lmL lOOmM MES pH6.0緩沖液，離心清 洗15000rpm 10~25min，棄去上清；100mM MES pH6.0緩沖液恢復到lml。
[0024]優選的，步驟S2中，還包括將共價鍵交聯制備得到的熒光標記抗體進行封閉、清洗 后用反應緩沖液稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測用熒光標記抗體的步驟;所述每1L反應 緩沖液中含有50~300mM tris，l~5%BSA，0.9~3%NaCl，l~3%葡聚糖，0.02~2.0% tween 20，pH6? 0~9? 0。更優選含有50mM tris，1 %BSA，0 ? 9%NaCl，2%葡聚糖，0 ? 5%tween 20，pH7.2。
[0025] 優選的，所述清洗采用的清洗液每每1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~ 1.0%Tween 20，pH6~9。更優選含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8〇
[0026] 優選的，所述標準曲線為系列濃度的BNP校準品的BNP濃度與對應的熒光信號的關 系曲線;該熒光信號為采用所述基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法測得的熒光信 號。
[0027] 第二方面，本發明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析試劑盒，所述試 劑盒包括檢測反應杯、熒光標記抗體和清洗液；
[0028]所述檢測反應杯內表面包被BNP單抗或者多抗；
[0029] 所述熒光標記抗體是由時間分辨熒光微球與BNP單抗或者多抗通過共價鍵交聯制 備而得；
[0030] 所述清洗液每 1L含5~lOOmM PB，0.9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9〇
[0031] 更優選含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0032] 該試劑盒的檢測基礎是雙抗體夾心的免疫反應。
[0033]所述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素化合物;較優的，該鑭系元素螯合物為 銪螯合物;最優的，該銪螯合物可為Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen。
[0034] 優選的，所述時間分辨熒光微球粒徑范圍為100~lOOOnm。
[0035]第三方面，本發明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析試劑盒的制備 方法，包括以下步驟：
[0036] (1)檢測反應杯的制備
[0037]采用BNP單抗或者多抗采用物理吸附的方式結合在反應杯內表面；
[0038] (2)熒光標記抗體的制備
[0039]采用BNP的單抗或者多抗采用共價交聯的方式與熒光微球偶聯；
[0040] (3)清洗液配制
[0041]優選的，所述偶聯具體為：每lml前處理后的羧基時間分辨熒光微球中加入 0.2mgBNP的單抗或者多抗，室溫混勾20~40min進行偶聯(即，共價鍵交聯）。
[0042] 優選的，所述前處理包括:加入MES和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混 勻15~60min，加入MES、NHS和EDC進行再次活化處理;每lmg羧基時間分辨熒光微球對應10 ~100ul 50mM氨基己酸。更優選為，所述初次活化處理為每lmg羧基時間分辨熒光微球，加 60ul 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液pH5.0~7.0,加0.02~0.2mgl-(3-二甲氨基 丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400此，室溫混勻15~60min;所述 再次活化處理包括:加入所述氨基己酸室溫混勻后，加lmL lOOmM MES pH5.0~7.0,離心清 洗 15000rpm 10~25min，棄去上清；加400ul 100mM MES pH5.0~7.0,超聲分離，加0.02~ 0 ? 2mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，加0 ? 01~0 ? lmgEDC，室溫混勻10~20min。
[0043] 優選的，所述前處理包括:每lmg羧基時間分辨熒光微球，加入60ul500mMpH6.0的 MES、0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、0.4mg N-羥基琥珀酰亞胺NHS， 加純化水至終體積300yL，室溫混勻活化10~20min。
[0044] 優選的，步驟(2)中偶聯之后還包括將偶聯得到的熒光標記抗體進行封閉、清洗后 用反應緩沖液稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測用熒光標記抗體的步驟;所述每1L反應緩 沖液中含有50mM 釷18，1%85厶，0.9%恥(：1，2%葡聚糖，0.5%七￥66112〇4117.2〇
[0045] 第四方面，本發明涉及一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析試劑盒的使用 方法，包括將待測BNP樣品加入檢測反應杯中，然后加入熒光標記抗體，37°C溫育，用清洗液 清洗去除未結合的抗原及焚光標記抗體，在340~380nm激發光激發下，測試反應杯中焚光 信號，檢測波長為600~630nm。
[0046] 本發明的方法將待測樣品中的抗原抗體反應信息轉化成了另一種更為直觀的光 信號信息（熒光信號），利用該方法，經過一系列的研究工作，可以獲得光子信號(熒光信號） 與待測抗原之間的對應關系，進而制作標準曲線，再通過對光子信號與標準曲線的比對或 者與陰陽性參考光子信號的比較檢測最終獲得待測抗原的定量或者定性檢測結果。
[0047] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0048] 1)熒光標記物為時間分辨熒光乳膠微球，每個微球中填充了幾萬到幾十萬個稀土 元素離子螯合物，檢測過程中并不需要解離增強過程，便可發出很強的熒光，簡化了時間分 辨熒光檢測步驟，解離增強時間分辨熒光檢測往往需要1個小時左右時間才能得到檢測結 果，而采用時間分辨熒光微球作為標記物，由于每個微球中填充了大量的鑭系元素螯合物， 熒光信號放大數千倍以上，因此可以在較短的檢測時間內完成檢測，縮短了檢測時間，并有 效的提高了檢測靈敏度。
[0049] 2)熒光微粒活化過程中添加氨基己酸作為手臂，使得抗體與微球之間的距離增 加，有效的降低了空間位阻效應，提高了檢測系統靈敏度。
[0050] 3)熒光免疫層析法，其特點檢測時間短，但其精密度不理想，受環境溫度影響較 大，且要手工操作，本發明采用基于微球的杯式時間分辨熒光分析，由于其超高的靈敏度， 其檢測時間并不比層析長，一方面易于實現自動化操作，另一方面反應溫度均一，不受環境 因素影響，準確性更好，精密度也優于層析試劑。
【附圖說明】
[0051]圖1為本發明的原理不意圖；
[0052] 圖2為BNP檢測標準曲線；
[0053]圖3為與電化學發光臨床樣本比對結果示意圖；
[0054]其中，1為焚光標記抗體，2為BNP抗原，3為包被抗體，4為反應杯固相表面，5為發光 免疫復合物。
【具體實施方式】
[0055] 下面結合實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員 進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。
[0056] 本發明的原理示意圖如圖1所示，包被抗體3結合在反應杯固相表面4上，在反應杯 中添加一定量的樣品使得樣品中的BNP抗原2與反應杯固相表面結合的抗體3結合，再加入 熒光標記抗體1，溫育形成發光免疫復合物5,采用清洗液清洗反應杯后去除未結合的抗原 及熒光標記抗體，檢測反應杯中的熒光信號，與標準曲線進行對比，得到待測樣本中BNP抗 原濃度。
[0057] 實施例1
[0058] 1、檢測反應杯的制備 [0059] (1)檢測反應杯包被
[0060]將 BNP 抗體 50El(Hytest 公司）用0.2M 磷酸緩沖液（pH7.8)稀釋成20μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被4小時，洗板。
[0061 ] (2)檢測反應杯封閉
[0062]用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應杯，37°C封閉4小時，棄去包被反應杯中的封閉 液，拍干。
[0063] (3)檢測反應杯干燥
[0064] 將上述封閉好的反應杯放置于濕度低于30 %的37 °C干燥箱中烘干8小時，密封干 燥保存。
[0065] 2、熒光標記抗體的制備
[0066] (1)熒光微粒前處理
[0067]取111^羧基時間分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400此，室溫混勻15min。加100ul 50mM氨基己酸，室 溫混勾30min。加lmL 100mM MES pH6.0,離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。加400ul 100mM MES pH6.0,超聲分離，加0.2mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)，加O.lmgEDC，室溫混勻 15min。加lmL 100mM MES pH6.0緩沖液，離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清。100mM MES pH6.0緩沖液恢復到lml。
[0068] (2)抗體交聯
[0069]加0.2mg BNP單克隆抗體24C5(Hytest公司），室溫25。(：混勻30min。
[0070] (3)封閉
[0071] 加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0072] (4)清洗
[0073] 加3mL交聯緩沖液（100mM MES pH6.0)，15000rpm離心清洗30min，棄去上清。加 500ul交聯緩沖液(100mM MES pH6.0)，超聲分離，終濃度2mg/ml。
[0074] (5)工作用熒光標記抗體配制
[0075] 配制反應緩沖液:緩沖液中含有50mM tri s，1 % BSA，0 ? 9 % NaCl，2 %葡聚糖，0 ? 5 % tween 20,pH7.2。
[0076]用反應緩沖液將上述清洗好的熒光標記抗體稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測 用熒光標記抗體。
[0077] 3、清洗液的配制
[0078] 配制清洗緩沖液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0079] 4、BNP 檢測
[0080] (1)標準曲線制備
[0081] 采用上述方法制備的試劑組合成BNP時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準品，每個 濃度重復10次。
[0082]每個檢測中加入校準品10此，熒光標記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數儀上進行讀數，標準曲線數據如表1所示，標 準曲線如圖2所示。
[0083] 由圖2的標準曲線我們可以看到，該標準曲線線性良好，可以通過該標準曲線對樣 本中所含的BNP濃度進行定量分析。
[0084] 通過表1結果可知，檢測試劑盒的批內精密度良好，校準品各濃度點熒光信號精密 度均小于10% (除0值以外），且試劑靈敏度良好，在5pg/ml水平與0值校準品有顯著區分。 [0085] 表1BNP定量檢測標準曲線數據
[0087] (2)樣本測試
[0088]采用上述方法制備的試劑組合成BNP時間分辨熒光定量試劑盒，測定臨床樣本，與 Alere微流控芯片系統測試結果進行相關性分析。
[0089]每個檢測中加入樣品10yL，熒光標記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測杯， 在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數儀上進行讀數，將測試結果帶入圖2標準曲線，計 算樣品測試濃度，比對數據如表2所示，與Alere微流控芯片系統測試結果進行相關性分析， 相關性曲線如圖3所示。
[0090] Alere微流控芯片系統和配套的BNP試劑盒是知名的BNP檢測試劑盒，其精度和結 果公認可靠。由圖3顯示可知本發明的試劑盒測定結果與Alere儀器及配套試劑盒測定結果 相關系數R 2為〇. 963，相關性較好，可用于臨床診斷使用。
[0091] 表2臨床樣本比對結果

[0094] 實施例2
[0095] 1、檢測反應杯的制備
[0096] (1)檢測反應杯包被
[0097]將 BNP 抗體 50El(Hytest 公司）用0.2M 磷酸緩沖液（pH7.8)稀釋成20μg/ml，200yL/ 孔，37 °C包被4小時，洗板。
[0098] (2)檢測反應杯封閉
[0099]用封閉緩沖液按300yL/孔加入反應杯，37°C封閉4小時，棄去包被反應杯中的封閉 液，拍干。
[0100] (3)檢測反應杯干燥
[0101] 將上述封閉好的反應杯放置于濕度低于30%的37°C干燥箱中烘干8小時，密封干 燥保存。
[0102] 2、熒光標記抗體的制備
[0103] (1)熒光微粒前處理
[0104] 取111^羧基時間分辨焚光微球（30〇11111，0.11111，1〇11^/111]^，1^叫81313公司），加6〇111 500mM MES(2-(N-嗎啡啉）乙磺酸)緩沖液，pH6.0,加0.2mg 1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(EDC)，加純化水至終體積400此，室溫混勻15min。加lmL 100mM MES pH6.0， 離心清洗15000rpm 20min，棄去上清。
[0105] (2)抗體交聯
[0106]加0.2mg BNP單克隆抗體24C5(Hytest公司），室溫25°C混勻30min。
[0107] (3)封閉
[0108] 加BSA封閉液，至終濃度10mg/mL BSA，室溫25°C混勻過夜。
[0109] (4)清洗
[0110] 加3mL交聯緩沖液（100mM MES pH6.0)，15000rpm離心清洗30min，棄去上清。加 500ul交聯緩沖液(100mM MES pH6.0)，超聲分離，終濃度2mg/ml。 (5)工作用熒光標記抗體配制
[0112] 配制反應緩沖液:緩沖液中含有50mM tris，1 %BSA，0.9%NaCl，2 %葡聚糖，0.5 % tween 20,pH7.2。
[0113] 用反應緩沖液將上述清洗好的熒光標記抗體稀釋到終濃度到50iig/ml，作為檢測 用熒光標記抗體。
[0114] 3、清洗液的配制
[0115] 配制清洗緩沖液，含5mM PB，0.9%NaCl，0.05%Tween 20，pH7.8。
[0116] 4、校準品測試
[0117] 采用上述方法制備的試劑組合成BNP時間分辨熒光定量試劑盒，測定校準品，每個 濃度重復10次。
[0118] 每個檢測中加入校準品10此，熒光標記抗體50yL，37 °C溫育20min，然后清洗檢測 杯，在PerkinElmer公司的Victor X4焚光讀數儀上進行讀數。
[0119]通過表3結果可知，檢測試劑盒的批內精密度良好，校準品各濃度點熒光信號精密 度均小于10% (除0和5pg/ml水平以外），試劑靈敏度相比實施例1來說有所降低，僅在50pg/ ml水平與0值校準品有較為顯著區分。說明熒光微粒前處理過程中通過添加手臂的方式能 有有效的提升檢測的靈敏度。
[0120]表3BNP定量檢測標準曲線數據
【主權項】
1. 一種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： 51、 在檢測反應杯內表面包被BNP單抗或者多抗； 52、 將時間分辨熒光微球與BNP單抗或者多抗通過共價鍵交聯制備得到熒光標記抗體； 53、 將待測BNP樣品加入步驟Sl包被后的檢測反應杯內，再加入所述熒光標記抗體，25 。(:~40 °C溫育； 54、 清洗去除未結合的抗原及焚光標記抗體，在340~380nm激發光激發下，測試檢測反 應杯中熒光信號，檢測波長為600~630nm; 55、 將所述熒光信號與標準曲線比對，獲得所述待測BNP樣品的BNP濃度。2. 根據權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所 述時間分辨熒光微球中填充了鑭系元素螯合物。3. 根據權利要求2所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所 述鑭系元素螯合物為Eu (TTA) 3/TOPO或Eu (TTA) 3/Phen。4. 根據權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所 述時間分辨熒光微球的粒徑范圍為100~1000 nm。5. 根據權利要求1~4中任一項所述的基于微球的杯式時間分辨焚光BNP分析方法，其 特征在于，所述時間分辨焚光微球為前處理后的羧基時間分辨焚光微球;所述前處理包括： 加入MES和EDC進行初次活化處理，加入氨基己酸室溫混勻15~60min，加入MES、NHS和EDC進 行再次活化處理;每Img羧基時間分辨熒光微球對應10~IOOul 50mM氨基己酸。6. 根據權利要求5所述的基于微球的杯式時間分辨焚光B N P分析方法，其特征在于，所 述初次活化處理包括:每Img羧基時間分辨熒光微球，加60ul 500mM pH5.0~7.0的MES， 0.02~0.2mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，加純化水至終體積400yL，室 溫混勻15~60min;所述再次活化處理包括：加入所述氨基己酸室溫混勻后，加 ImL IOOmM MES ρΗ6·0,離心清洗 15000rpm 20min，棄去上清；加400ul IOOmM MES ρΗ6·0,超聲分離，加 0.02~0.2mg N-羥基琥珀酰亞胺，加0.01~O.lmgEDC，室溫混勻15min;加 ImL IOOmM MES ρΗ5·0~7.0緩沖液，離心清洗15000rpm 20min，棄去上清；IOOmM MES ρΗ5·0~7.0緩沖液恢 復到lml。7. 根據權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，步 驟S2中，還包括將共價鍵交聯制備得到的熒光標記抗體進行封閉、清洗后用反應緩沖液稀 釋到終濃度50μg/ml，作為檢測用熒光標記抗體的步驟;所述每IL反應緩沖液中含有50~ 300mM tris，l~5%BSA，0.9~3%NaCl，l~3%葡聚糖，0.02~2.0%tween 20，ρΗ6·0~ 9 · 0 〇8. 根據權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所 述清洗采用的清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，ρΗ6~9。9. 根據權利要求1所述的基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法，其特征在于，所 述標準曲線為系列濃度的BNP校準品的BNP濃度與對應的熒光信號的關系曲線;該熒光信號 為采用所述基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析方法測得的熒光信號。10. -種基于微球的杯式時間分辨熒光BNP分析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 檢測反應杯、熒光標記抗體和清洗液； 所述檢測反應杯內表面包被BNP單抗或者多抗； 所述熒光標記抗體是由時間分辨熒光微球與BNP單抗或者多抗通過共價鍵交聯制備而 得； 所述清洗液每IL含5~IOOmM ΡΒ，0·9~3%NaCl，0.02~1.0%Tween 20，pH6~9。
【文檔編號】G01N33/68GK105891507SQ201610210112
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月6日
【發明人】石曉強, 李福剛, 徐建新, 周奕璇, 楊晶
【申請人】上海奧普生物醫藥有限公司