專利名稱：蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的快速測定技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用毛細管電泳技術快速測定蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的方法，屬于應用生物技術領域。
背景技術：
高血壓是威脅成年人健康的一個主要因素，其發病率呈上升趨勢，全世界大約有20％的成年人受到高血壓疾病的威脅。高血壓會引起患者心腦腎等器官損壞，并與糖脂代謝紊亂和糖尿病有密切關系，嚴重時會危及生命。因此抗高血壓治療藥物的研究越來越引起國內外學者的重視，特別是抑制血管緊張素轉化酶的肽，由于是天然的活性肽，沒有毒副作用，具有合成降壓藥物無法比擬的優越性，而且它多存在于各種食物蛋白的加工酶解產品中，有著較大的應用價值和經濟潛力。
在人的生理過程中，腎素-血管緊張素-升壓酶體系相互作用調節血管收縮。腎素進入血液將血漿中的血管緊張素原Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Tyr-Ser-R水解為血管緊張素I(AT1)Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu，血管緊張素I是沒有活力的，而血管緊張素I在血管緊張素轉化酶(ACE)的作用下，會轉化成有活力的血管緊張素II(ATII)Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe，血管緊張素II可加強心肌的收縮力，并同時使血管平滑肌收縮造成血壓上升。另一方面，還有激肽-激肽釋放酶系統也受到ACE的調控，它可使具有血管舒張作用的緩激肽轉變為沒有活力的緩釋肽，正是由于兩個系統在ACE的作用下，協同作用才造成了人體內血壓的升高。如果能夠抑制血管緊張素轉化酶的作用，就可以實現降壓作用。ACE抑制肽就是一種ACE抑制劑，由于ACE是一個特異性的C末端的二肽外切酶，ACE抑制肽一般是ACE的底物類似物，這樣在ACE作用血管緊張素I時，ACE抑制肽就會對其形成競爭性抑制，與ACE特異性結合，從而減少ACE對血管緊張素I的作用，這樣產生的具有血管收縮作用的血管緊張素II的量就大大減少了，從而達到抑制血壓升高的目的。
自1970年以來，不斷的有新的抗高血壓活性肽被研究和發現，其中包括化學合成的，從天然物質中分離提取的，更多的是食物蛋白經過蛋白酶作用后，產生的酶解肽類片段。目前已經研究開發的蛋白質以食物蛋白為主，如大豆蛋白，乳蛋白，牲畜骨骼肌肉蛋白，卵黃蛋白、卵清蛋白等。蛋白質的種類非常多，并且，每一種蛋白質的氨基酸組成以及氨基酸一級序列也不同。可用于酶解的蛋白酶的種類有多種，不同的蛋白酶的酶切位點不盡相同。因此，同一種蛋白，應用不同的蛋白酶酶解，酶解物的ACE抑制活性不同；同一種酶，酶解不同的蛋白質，其酶解物的ACE酶抑制活性也不相同。基于此，酶解物的種類非常多，因此，從多種酶解物中高通量快速篩選具有高ACE酶抑制活性的酶解物，對于進一步分離、純化、鑒定新的ACE抑制肽，顯得尤為重要。以往鑒定血管緊張素抑制肽的抑制活力往往采用分光光度法或高壓液相色譜法(HPLC)，既費時又費錢，而毛細管電泳具有快速，靈敏度高，樣品用量少等優點，因此用毛細管電泳的方法可以快速篩選具有血管緊張素抑制肽的活性，即具有降血壓活性的蛋白酶解物，將為進一步分離純化鑒定新的降血壓肽奠定基礎。

發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的快速測定技術，可快速準確地從大量的蛋白酶解產物中篩選富含抑制血管緊張素轉化酶(ACE)活性肽的酶解物，用于篩選富含降血壓肽的蛋白酶解物。
本發明的方法包括用毛細管電泳的方法測定各種蛋白酶解產物的抑制ACE活性的IC50值，根據IC50值的大小，判斷各種海洋蛋白酶解物的抑制ACE的活性，IC50越低，表明該蛋白酶解物抑制ACE酶的活性越強，抑制ACE的降血壓活性肽的含量越高。具體包括如下步驟(1)酶反應系列樣品反應液包括10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管緊張素轉化酶(ACE)分別和不同濃度的(0.03～40mg/ml)10μl蛋白酶解產物。上述樣品反應液都用100mM的硼酸緩沖液(包含0.3M NaCl，pH8.3)配制。反應液均在37℃反應30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反應。底物經ACE作用后產生單獨的馬尿酸和His-Leu二肽。
(2)檢測血管緊張素轉化酶抑制反應產物直接在毛細管電泳儀上進行檢測。毛細管電泳儀為Beckman Coulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)裝置，配備有PDA(photodiode array)檢測器，數據采集、分析、系統控制用P/ACE MDQ軟件，該軟件來自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。中止反應后的混合物樣品直接用毛細管電泳進行檢測，上樣壓力為1psi，時間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228nm，電泳時間5分鐘，電泳緩沖液為20mM的硼酸緩沖液(pH9.18)。每測一個樣品之后用緩沖液沖洗毛細管1分鐘。底物和產物馬尿酸分別在2.5分鐘和3.5分鐘出峰，根據軟件計算馬尿酸的峰面積。
(3)ACE抑制活性的計算(IC50值的計算)馬尿酸配制成不同濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通過毛細管電泳測定其峰面積與馬尿酸濃度的線性關系。
峰面積＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t上述公式中V反應體積，t反應時間，K根據峰面積和馬尿酸濃度求出的曲線常數，Chip馬尿酸濃度，N馬尿酸濃度曲線與Y軸的交點。
通過血管緊張素轉化酶作用，反應混合物中不含任何抑制劑，從底物Hip-His-Leu釋放出來的馬尿酸HA的量被定義為100％ACE活力。將所要測定ACE抑制活力的抑制劑系列稀釋成不同濃度，分別與底物和酶共同反應，然后根據所產生的馬尿酸的峰面積，來計算抑制劑的IC50值。抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解產物的量被定義為該酶解產物的抑制活力。
IC50值的計算采用線性對數法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點對應的值為M，10M為酶解產物抑制ACE活力的IC50值。
具有酶解ACE抑制肽的IC50值為0.2μM-500μM，IC50值越小，說明對ACE的抑制作用越強，降血肽效果越好。
上述步驟(1)不同的蛋白首先經過勻漿，然后用蛋白酶進行酶解，經過5小時的酶解后，離心取上清，將上清凍干，取適量凍干粉末配制成一定濃度的抑制劑。
上述步驟(1)反應在0.2ml的小離心管中進行，反應結束后直接放置在毛細管樣品瓶支架上樣。
本發明應用毛細管電泳技術測定酶解物的ACE抑制肽，可以減少傳統方法耗費時間，耗費樣品的缺點，可以實現對多種蛋白資源酶解物的ACE抑制活性進行高通量快速篩選。
本發明的優點在于將毛細管電泳技術應用于從蛋白酶解產物中篩選抗高血壓活性肽。具體體現在1、運用毛細管電泳技術快速測定ACE抑制劑的抑制活力，2、重復性好，靈敏度高，IC50值測定準確，3、與以往的色譜法相比，大大減少了測定IC50值所用的時間，而且不需要價格昂貴的有機溶劑作為流動相。4、利用毛細管電泳技術開發具有將血壓功能的蛋白酶解產品，有廣闊的市場空間。


圖1是實施例1的IC50值的線性對數圖，橫坐標是Log(鯷魚酶解物mg/ml)縱坐標是Log(ACE活力/(1-ACE活力))，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點為-3.39。
圖2是實施例2的IC50值的線性對數圖，橫坐標是Log(玉米蛋白酶解物)mg/ml)縱坐標是Log(ACE活力/(1-ACE活力))，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點為-3.01。
具體實施方式
實施例1.
(1)血管緊張素轉化酶反應條件樣品反應液包括10μl底物Hip-His-Leu(1mM)，0.8mU的血管緊張素轉化酶(ACE)和10μl的不同濃度海洋鯷魚肉的酶解產物。具體如下樣品 底物Hip-His-Leu 血管緊張素轉化酶鯷魚肉的酶解產物1 10μl，1mM 0.8mU 10μl，39mg/ml2 10μl，1mM 0.8mU 10μl，9.3mg/ml3 10μl，1mM 0.8mU 10μl，4.6mg/ml4 10μl，1mM 0.8mU 10μl，1.8mg/ml5 10μl，1mM 0.8mU 10μl，0.63mg/ml6 10μl，1mM 0.8mU 10μl，0.29mg/ml對照 10μl，1mM 0.8mU 水10μl上述反應液都用100mM的硼酸緩沖液(包含0.3M NaCl，pH8.3)配制。同時用不含酶解產物，只有ACE和底物Hip-His-Leu的反應體系作為對照。所有樣品都分別裝載在0.2ml的小離心管中，在37℃反應30min，然后用0.1％三氟乙酸TFA(10μl)中止反應，離心管內樣品體積均為40μl。
鯷魚肉的酶解采用現有公知技術，例如將鯷魚肉先經過勻漿，然后用蛋白酶進行酶解，經過5小時的酶解后，離心取上清，將上清凍干，取適量凍干粉末配制成一定濃度的抑制劑。其他按現有技術。
(2)檢測條件上述反應產物直接在毛細管電泳儀上進行檢測。上樣壓力為1psi，時間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228nm，電泳時間5分鐘，電泳緩沖液為20mM的硼酸緩沖液(pH9.18)。每測一個樣品之后用緩沖液沖洗毛細管1分鐘。毛細管電泳儀為BeckmanCoulter P/ACE MDQ(Fullerton，CA)裝置，配備有PDA(photodiode array)檢測器，數據采集、分析、系統控制用P/ACE MDQ軟件，該軟件來自Beckman Coulter(Fullerton，CA)。
(3)ACE抑制活性的計算(IC50值的計算)IC50值的計算采用線性對數法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點對應的值為M，10M為酶解產物抑制ACE活力的IC50值。
上述步驟(3)通過對所有樣品中馬尿酸的面積進行積分，然后根據公式對數作圖(圖1)，得出直線與X軸的交點為-3.39，所以IC50為0.4mg/ml。說明該酶解物對ACE的抑制作用較強。該數據與用高壓液相色譜法(HPLC)方法得到的IC50值相近。
實施例2.同實施例1，所不同的是作為ACE抑制劑的是玉米蛋白的酶解液，酶解液配制濃度為0.05mg/ml～2mg/ml，得出直線與X軸的交點為-3.01(見圖2)，所以IC50為0.98mg/ml，說明該酶解物對ACE的抑制作用較強。
實施例3.同實施例1，所不同的是作為ACE抑制劑的是卡托普利(Captopril)。
卡托普利是ACE的競爭性抑制劑，配制濃度為0.03～3mg/ml，測定它的IC50為22nM，與分光光度法或高壓液相色譜法測定的結果相吻合。
實施例4.同實施例1，所不同的是作為ACE抑制劑的是肽段Val-Pro-Ala-Phe配制濃度為0.03～4mg/ml，測定它的IC50為575.4μM，說明，該短肽抑制ACE的活性較弱。
本發明不限于上述實施例。
本發明實施例的毛細管電泳圖重復性好，可以準確的計算出各種蛋白酶解產物的和各種ACE抑制劑的ACE抑制活性，為快速分離鑒定ACE抑制肽提供了良好的檢測手段。
權利要求
1.蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的快速測定技術，其特征在于用毛細管電泳的方法測定各種蛋白酶解產物的血管緊張素轉化酶抑制活性的IC50值，具體包括如下步驟(1)酶反應系列樣品反應液包括10μl底物Hip-His-Leu 1mM，0.8mU的血管緊張素轉化酶分別和濃度為0.03～40mg/ml的10μl蛋白酶解產物，上述樣品反應液都用pH8.3含0.3M NaCl的100mM的硼酸緩沖液配制，反應液均在37℃反應30min，然后用0.1％三氟乙酸10μl中止反應，底物經血管緊張素轉化酶作用后產生單獨的馬尿酸和His-Leu二肽；(2)檢測上述血管緊張素轉化酶抑制反應產物直接在毛細管電泳儀上進行檢測，毛細管電泳儀為Beckman Coulter P/ACE MDQ裝置，配備有PDA檢測器，數據采集、分析、系統控制用P/ACE MDQ軟件，上樣壓力為1psi，時間為5秒，電泳電壓20kV，紫外吸收為228nm，電泳時間5分鐘，電泳緩沖液為20mM的硼酸緩沖液pH9.18，每測一個樣品之后用緩沖液沖洗毛細管1分鐘，底物和產物馬尿酸分別在2.5分鐘和3.5分鐘出峰，根據軟件計算馬尿酸的峰面積；(3)血管緊張素轉化酶抑制活性IC50值的計算馬尿酸配制成不同濃度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，2，4，6mM，通過毛細管電泳測定其峰面積與馬尿酸濃度的線性關系峰面積＝K×Chip+NACE活力(umol/min)＝V×Chip÷t上述公式中V反應體積，t反應時間，K根據峰面積和馬尿酸濃度求出的曲線常數，Chip馬尿酸濃度，N馬尿酸濃度曲線與Y軸的交點；通過血管緊張素轉化酶作用，反應混合物中不含任何抑制劑，從底物Hip-His-Leu釋放出來的馬尿酸HA的量被定義為100％血管緊張素轉化酶活力。將所要測定血管緊張素轉化酶抑制活力的抑制劑系列稀釋成不同濃度，分別與底物和酶共同反應，然后根據所產生的馬尿酸的峰面積，來計算抑制劑的IC50值；抑制50％的ACE活力的海洋蛋白酶解產物的量被定義為該酶解產物的抑制活力；IC50值的計算采用線性對數法，以Log(ACE活力/(1-ACE活力))對Log(水解產物濃度mg/ml)作圖，所得直線與X軸的交點對應的值為M，10M為酶解產物抑制ACE活力的IC50值。
2.如權利要求1所述的蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的快速測定技術，其特征在于，步驟(1)的蛋白首先經過勻漿，然后用蛋白酶進行酶解，經過5小時的酶解后，離心取上清，將上清凍干，取凍干粉末配制成抑制劑。
3.如權利要求1所述的蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的快速測定技術，其特征在于，步驟(1)反應在0.2ml的小離心管中進行，反應結束后直接放置在毛細管樣品瓶支架上樣。
全文摘要
本發明涉及利用毛細管電泳技術快速測定蛋白酶解物的血管緊張素轉化酶抑制活性的方法，屬于應用生物技術領域。本發明的方法包括用毛細管電泳的方法測定各種蛋白酶解產物的抑制ACE活性的IC
文檔編號G01N21/33GK1632528SQ20041007582
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者張玉忠, 何海倫, 陳秀蘭, 吳昊, 周百成 申請人:山東大學