一種聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑hs-1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，尤其是涉及一種具有整合素親和性和結合能力、具有 腫瘤靶向性的聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1及其應用。
【背景技術】
[0002] 研究表明，新生血管的生成對腫瘤的生長有著重要的影響，新生血管可以為實體 瘤提供其生長所需的氧氣、營養以及幫助其排泄代謝產物，同時還為其能夠遠處轉移提供 途徑。所以，阻斷新生血管生成可以有效的阻止腫瘤的生長及轉移。所以研制出能夠抗血管 生成分子的藥物得到了廣泛的共識。
[0003] 與傳統抗腫瘤藥物相比，腫瘤血管生成抑制劑有著諸多優點，比如其可以靶向選 擇性的作用于血管內皮細胞，對于機體的毒副作用小。再者靶點細胞為血管的內皮細胞，藥 物能夠輕易的與血液中與之接觸發生作用。腫瘤的血管內皮細胞很少發生突變，所以對藥 物不易產生耐藥，可以長期用藥。同時該方法可以與化療方法聯合應用并減輕其帶來的副 反應程度。
[0004] 目前，國際上開發出的整合素阻斷劑已經入II期臨床，而我國還尚未有相似或同 類產品進入市場，所以對于開發我國自主知識產權的此類藥物非常有必要。整合素受體 (Integr in)為細胞黏附分子家族的重要成員之一，主要介導細胞與細胞、細胞與細胞外基 質(ECM)之間的相互作用，并介導細胞與ECM之間的雙向信號傳導。整合素受體是由α和β亞 基以非共價鍵結合而形成的跨膜異二聚體糖蛋白，屬于I型膜蛋白，迄今已發現由18種不同 的α亞基和8種β亞基組成的24種整合素。內皮抑素是能夠抑制內皮細胞增殖的一類血管生 成抑制劑。內皮抑素是膠原XVIII的C-端片段，分子量為20kDa，能夠特異性抑制內皮細胞的 增殖和迀移，減少膠質細胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各種原發腫瘤。內皮抑素能夠與整 合素 α5β1相互作用，預示著α5β1可能是endostatin的功能革巴點。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1及其應用，聚乙二 醇修飾后的HS-1可在不影響其體內外活性的同時，有效延長HS-1的半衰期，是一種新型分 子，與修飾前的分子相比，活性產生不同的效果。經過修飾后，藥物的給藥頻率降低，藥物對 腫瘤生長抑制的作用時間延長，拓展了社會價值和經濟價值。
[0006] 本發明的技術方案是：
[0007] -種聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1。
[0008] 優選的，所述聚乙二醇的分子量為20000,氨基酸序列如SEQ ID:N0.1所示，為 mPEG-SC20k-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp〇
[0009] 本發明的另一方面，一種聚乙二醇修飾的HS-1的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 1)、合成HS-1 :a、稱取Fmoc-Ser-Wang resin倒入玻璃砂芯反應柱中，加入二氯甲 烷使樹脂膨脹;b、加入六氫吡啶/DMF脫帽；c、洗滌:將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂，抽干，取 樹脂放置到小試管內，加入驗色劑，加熱；d、縮合:稱取保護氨基酸和HOBt，溶于DMF和DIC， 倒入反應釜中反應;e、洗滌:將反應液抽干，用DMF洗滌樹脂，抽干，取樹脂置于小試管內，加 入驗色劑，加熱;f、切肽:把抽干的樹脂裝入圓底燒瓶中，加入切割液，密封反應，將樹脂與 多肽分離;g、后處理:先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，離心，把清液倒掉，然后再用無 水乙醚洗滌多肽，抽干得多肽粗品；
[0011] 2)、純化HS-l:a、溶解:稱取ID-18粗品，加入純化水配置成溶液，超聲攪拌至無顆 粒狀澄清溶液;b、過濾:將ID-18的溶液用沙芯過濾器過濾;c、制備:一次純化;d、平衡:沖洗 制備柱;上樣:用輸液栗上樣，并采集基線，檢測是否有樣品沖出；
[0012] 3)、聚乙二醇修飾多肽：按照摩爾比為1.5:1，分別稱取TOG和HS-1，置于配好的 PH5-8.5的PBS緩沖溶液中，過夜反應；
[0013] 4)、分離純化:a、分離:對反應后的樣品應用半制備型高效液相進行純化在目的峰 出峰過程中，用離心管收集產物;b、純化:將經過HPLC收集的產物首先于-70°C低溫冰箱預 凍過夜，之后于提前遇冷的冷凍干燥機凍干，直到目測全為白色粉末為止，收獲凍干產物。
[0014] 本發明的另一方面，聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1在實體腫瘤治療中的應 用。
[0015] 優選的，聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1可用于乳腺癌和宮頸癌的治療。
[0016] 本發明具有的優點和積極效果是：
[0017] 1、本發明的聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1具有抑制腫瘤新生血管形成，抑 制腫瘤生長和轉移的效果。
[0018] 2、本發明的聚乙二醇修飾的血管生成抑制劑HS-1毒副作用少、用量少、成本低。說 明本發明設計的聚乙二醇修飾的整合素阻斷劑多肽科學、合理、可行有效，能作為制備治療 人類實體腫瘤的治療藥物，為將來藥物開發提供了新的思路，具有顯著的社會價值和市場 價值。
[0019] 3、聚乙二醇修飾后的血管生成抑制劑HS-1的靶點不變，延長多臺分子的體內半衰 期、降低清除率、降低了免疫原性和抗原性，并且抗腫瘤活性保持不變，但是降低了給藥頻 率，修飾后原來每天給藥一次，變為每2-3天給藥一次。
【附圖說明】
[0020] 圖1是血管抑制劑多肽對人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用。 [0021]圖2是血管抑制劑多肽對人宮頸癌HeLa裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用。
【具體實施方式】
[0022] 一、整合素阻斷劑HS-1的制備
[0023] Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Asp的固相合成方法，其以Fmoc-Ser-wangresin或Fmoc-Ser-CTCresin為起始原料，然 后用保護氨基酸依次接二肽至十九肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得 HS-1粗品。將粗品進行純化，首先溶解，然后用制備型高效液相經過兩次純化，最后濃縮凍 干得到純品。具體步驟如下：
[0024] 1、合成：
[0025] 稱取Fmoc-Ser-Wang resin 14.7g，倒入1L的玻璃砂芯反應柱中，加入CH2Cl2l47ml 使樹脂充分膨脹。
[0026] 脫帽：加入六氫吡啶/DMF的脫帽液25ml，密封后放入振蕩器中反應5分鐘，溫度控 制在室溫，5分鐘后將脫帽液抽干，中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次20 %的脫帽液25ml 反應15分鐘。
[0027]洗滌:將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂6次，抽干，取20顆樹脂在小試管內，加入驗色 劑，在115°C加熱3分鐘。
[0028] 縮合：稱取保護氨基酸和HOBt 2.025g，溶于15ml DMF和2.33ml DIC，然后倒入反 應釜中反應1.5左右小時，溫度控制在34°C左右。
[0029] 洗滌:將反應液抽干，用DMF洗滌樹脂3次，抽干，取10-20顆樹脂在小試管內，加入 驗色劑，在115 °C加熱3-5分鐘。
[0030] 切肽:把抽干的樹脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入300mL 90%的切割液(按體積 比比計三氟乙酸：苯酸:苯甲硫醚:EDT = 90: 3:3: 2: 2)，密封反應2小時，用砂芯漏斗將樹脂 與多肽分尚。
[0031] 后處理:先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒掉，然后再用 無水乙醚洗滌多肽6次，抽干得多肽粗品9.5g。
[0032] 2、純化：
[0033] 溶解:精密稱取ID-18粗品，加入適當的純化水配置成10g/l的溶液，超聲攪拌至無 顆粒狀澄清溶液。
[0034] 過濾:將ID-18的溶液用沙芯過濾器0.45um的混合濾膜過濾.
[0035] 制備:一次純化
[0036] 平衡：制備柱用5%乙腈+95%三氟乙酸水溶液，流速80ml/min沖洗lOmin。
[0037]上樣：用輸液栗上樣，流速80ml/min，并采集基線，收取在紫外波長220nm吸收大于 200mv的溶液，檢測是否有樣品沖出。
[0038]二、聚乙二醇修飾多肽的步驟
[0039] mPEG-SC20K 與 HS-1 的反應：
[0040]分別稱取 2gmPEG-SC2〇K 和106 · 24mgHS-l (摩爾比為1 · 5:1)置于 40ml-100ml 配好的 PH5-8.5的PBS緩沖溶液中在4°C條件下過夜使其進行反應，PEG-SC500-20000都可進行連接 反應合成修飾多肽。
[0041 ] 三、分離純化步驟
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