Psd-95的二聚抑制劑的脂肪酸衍生物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了能夠結合PSD?95的PDZ域的脂肪酸衍生的化合物，及其作為PSD?95介導的蛋白質?蛋白質相互作用的抑制劑的醫藥用途。
【專利說明】
PSD-95的二聚抑制劑的脂肪酸衍生物
技術領域
[0001 ]本發明涉及能夠與PSD-95的roz域結合的化合物，以及其作為PSD-95介導的蛋白 質-蛋白質相互作用的抑制劑的醫藥用途。
【背景技術】
[0002] 突觸后密度蛋白質-95(PSD-95)是人類中由DLG4(大盤狀同系物4(disks large homolog 4))基因編碼的蛋白質。PSD-95是膜相關鳥苷酸激酶(MAGUK)家族成員并且與PSD- 93-起募集為相同NMDA受體和鉀通道組。
[0003] PSD-95是含PDZ域的蛋白質的MAGUK家族的最佳研究成員。類似于所有MA⑶K家族 蛋白質，其包括三個roz域、一個SH3域和一個經連接子區域連接的鳥苷酸激酶樣域(GK)。其 幾乎僅位于神經元的突觸后密度，并且涉及錨定突觸蛋白質。其直接和間接結合配偶體 (partner)包括神經連接蛋白質、神經元型一氧化氮合酶（nNOS)、N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA)受體、AMPA受體和鉀通道。
[0004] PDZ域是各種有機體包括人的支架蛋白質中主要發現的具有80-90個氨基酸的常 見結構域。PDZ是三種蛋白質一PSD-95、果繩大盤狀腫瘤抑制基因 （Drosophila disc large tumor suppressor，Dlgl)和閉鎖小帶蛋白質-1(Z0-1)-的第一個英文字母的縮寫詞，所述 三種蛋白質是最先發現的包含所述域的蛋白質。
[0005] 通常，PDZ域通過與其C末端結合而與其他蛋白質相互作用。這通過β折疊增加(β- sheet augmentation)實現，這是指FOZ域中的β折疊通過加入結合配偶體蛋白質的C末端延 長并由此形成延長的β折疊樣結構。
[0006] PDZ域發現于真核和真細菌界中均有的大量蛋白質中，而它們在古生菌蛋白質中 僅存在極少實例。PSD-95的三個PDZ域，即PDZ1-3,與具有類似共有序列例如Ser/Thr-X- Val/Ile/Leu-C00H的肽配體結合。
[0007] PDZ域與C-末端肽的相互作用的結構基礎首先由與天然肽配體CRIPT(序列： YKQTSV)絡合的PSD-95的Η)Ζ3的X-射線晶體結構闡明。PDZ3包含六個反平行的β-鏈() 和兩個α-螺旋(αΑ和αΒ)，并且C-末端肽配體結合于邱鏈和αΒ螺旋之間的凹槽中。肽配體的 兩個殘基被認為對于親和性和特異性是特別重要的，其為從C-末端開始數的第一個(Ρ，和 第三個(Ρ，氨基酸。PQ位的氨基酸側鏈伸出至疏水口袋中并且需要具有脂族側鏈的氨基酸 (Val、Ile和Leu)。在PDZ3-CRIPT X-射線晶體結構中，Ser或Thr(P-2)的羥基氧與His372的咪 唑側鏈的氮形成氫鍵，并且該相互作用已顯示為roz域/配體相互作用的親和性的重要決定 因素。PDZ域的保守的Gly-Leu-Gly-Phe(PDZ3中的322-325位)基序和帶正電荷的殘基(PSD- 95TOZ3中的Arg318)介導與C末端羧酸酯基團的結合。
[0008] PSD-95的PDZ1和PDZ2域與若干蛋白質相互作用，包括同時結合NMDA-型親離子谷 氨酸受體和一氧化氮(N0)合酶nNOSaNMDA受體是興奮性毒性的主要介導物，即，谷氨酸介導 的神經毒性，其涉及神經變性疾病和急性腦損傷，并且雖然NMDA受體的拮抗劑通過防止谷 氨酸介導的離子流有效降低興奮性毒性，但是它們還阻止生理學重要過程。因此，NMDA受體 拮抗劑不能用于例如中風的臨床試驗，這是由于低耐受性和缺乏效力。相反，興奮性毒性的 特異性抑制可以通過使用PSD-95抑制劑擾亂細胞內nNOS/PSD-95/NMDA受體絡合物而獲得。
[0009] PSD-95分別通過rozi和roZ2同時結合NMDA受體，主要為GluN2A和GluN2B亞單位， 和nNOS。激活匪DA受體引起鈣離子流入，其激活nNOS，由此導致N0產生。因此，PSD-95介導 NMDA受體激活和N0產生之間的特定締合(association)，其如果持續較長時間則對細胞是 有害的，并且是谷氨酸介導的神經毒性的關鍵促進劑。通過靶標PSD-95抑制nN0S/PSD-95/ NMDA受體相互作用的三元絡合物，其已知為通過損害鈣離子進入和NO產生之間的功能連接 而防止小鼠中的缺血性腦損傷，同時生理功能例如離子流和NMDA受體的促生存信號轉導途 徑仍保持完整。W02010/004003公開了通過由聚乙二醇接頭(PEG)連接的二聚肽配體抑制 PSD-95的概念。這些二聚體同時結合PSD-95的PDZ1和PDZ2域。
[0010] 靶向PSD-95的二聚化配體作為慢性疼痛治療處于臨床前評價中（Andreasen等人， Neuropharmacol，2013，67,193-200;Bach等人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)。然而，治 療肽通常易受從血液中除去以及通過腎清除和肝代謝而降解的影響。因此，需要改善藥代 動力學性質并且因此增加二聚肽配體的穩定性和半衰期。

【發明內容】

[0011] 為了解決關于提供改善的藥代動力學性質和增加 PSD-95二聚肽配體的體內穩定 性的所述問題，本發明描述了一類新的化合物，其中兩個肽配體通過接頭例如NPEG接頭連 接，其中一種或多種脂肪酸或脂肪酸衍生物已直接結合NPEG接頭或通過其他接頭結合。
[0012] 本發明人由此開發了二聚PSD-95配體的衍生物，其與未連接脂肪酸的化合物，例 如TO2010/004003公開的化合物相比，具有改善的體外血漿半衰期。此外，該化合物顯示出 皮下給藥時在皮下儲庫(depot)中增加的保留時間(residence time)。
[0013] 在一個方面，本發明涉及包含第一肽(Pi)和第二肽(p2)的化合物，其中pjpp2各自 包含至少兩個蛋白質或非蛋白質氨基酸殘基，并且其中P#PP2均通過其N-末端與第一接頭 U連接，并且其中U包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個氧原子被氮原子替換以得 到NPEG，并且其中白蛋白結合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L2與NPEG的氮原子連 接。
[0014]已經證明了本發明的化合物與PSD-95的PDZ1-2結合（當選擇如本文所定義的PjP P2時）。由于PSD-95是治療的重要靶標，因此本發明一方面涉及用作藥物的本文定義的化合 物。
[0015] 更具體地，本發明的化合物可以一方面用于治療或預防興奮性毒性相關疾病，或 者預防和/或治療疼痛。
[0016] 本發明化合物可以通過包括下述步驟的方法按計劃合成：
[0017] a)制備 NS-NPEG 二酸接頭，
[00?8] b)使用基于Fmoc的固相肽合成制備肽，
[0019] C)使Fmoc-脫保護的肽與Ns-NPEG二酸接頭二聚化，
[0020] d)任選通過中間體接頭，例如氨基酸接頭(L2)，使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶 聯。
【附圖說明】
[0021] 圖1:參比配體UCCB01-125和UCCB01-144的結構。首字母表示L-氨基酸，除了'Ν' (氮）、'〇'（氧）。
[0022] 圖2:FA-連接的二聚化配體（1-12)和UCCB01-125和UCCB01-144的HSA的親和性。數 據顯示為平均值土 SEM，n = 3。
[0023] 圖3:如經FP測定的FA-連接的二聚化配體（1-12)和UCCB01-125和UCCB01-144與 PSD-95TOZ1-2的親和性。A)在TBS中測量；B)在TBS+HSA中測量；C)在TBS+HSA中測量，fu校 正。數據顯示為平均值土 SEM，n2 3。
[0024] ?4 :化合物（UCCBO1 -125、1、4、7、13)的體外血漿穩定性。計算的半衰期為： 1]〇^01-125:1.711;1:23.611;4、7和13 :>2411。
[0025]圖5:大鼠皮下給藥后二聚化配體UCCB01-125(兩個劑量)和化合物1、4、7和13的血 衆分布。
[0026] _: FA-連接的二聚化配體(1 -12)的合成。該圖的方案1中例示的合成的反應條件 如下：（a)Fmoc-GABA-〇H/Fmoc-(l)-Glu-〇tBu/Fmoc-5-Ava，HATU，三甲基吡啶，DMF(lh x2)， 然后 20% 哌啶/DMF;(b)FAl/FA2/FA3/FA4，HBTU，DIPEA，DMF/DCM，45min，然后 TFA/TIPS/H2O (90/5/5); (c)0 · 5M LiOH，H20/ACN(75/25)，30min，然后TFA至pH〈2。三角形表示E和T為經側 鏈保護的（叔丁基）。
[0027] 圖7:十八烷二酸二甲酯的單皂化。反應條件：（a)Na0H(leq.)，Me0H，45°C，0/N。
【具體實施方式】
[0028] I.定義
[0029] 酰胺鍵:本文使用的術語'酰胺鍵'是通過羧酸和胺之間的反應(并且伴隨消除水) 形成的化學鍵。當反應是在兩個氨基酸殘基之間進行時，作為反應結果形成的鍵稱為肽鍵 (peptide linkage,peptide bond)；
[0030] 金:本文使用的術語'包含'應以包括方式理解。因此，例如，包含化合物X的組合 物可以包含化合物X和任選其他化合物。
[0031] 二聚體:本文使用的術語二聚體是指經化學或物理相互作用締合的兩個相同或不 相同的化學部分。例如，二聚體可以是同源二聚體，例如經接頭連接的兩個相同肽。二聚體 也可以是異源二聚體，例如經接頭連接的兩個不同肽。二聚體的實例是本發明的PSD-95抑 制劑，其是包含通過接頭的方式共價連接的兩個肽或肽類似物的化合物，其中所述肽或肽 類似物能夠同時與PSD-95的rozi和roZ2結合或相互作用。
[0032] 二肽:本文使用的術語'二肽'是指經肽鍵連接的兩個天然或非天然氨基酸。
[0033]乙二醇部分:本文使用的術語'乙二醇部分'是指組成PEG或NPEG接頭的結構單元。 '乙二醇部分'的另一個名字是'氧乙稀(oxyethyleneZ，并且單體單元的化學式是：
[0034]
[0035] 脂肪酸:本文使用的術語脂肪酸(縮寫為FA)通常是指具有長脂族碳鏈的羧酸，其 可以為飽和或不飽和的。脂肪酸可以選自短鏈脂肪酸(SCFA)、中鏈脂肪酸(MCFA)、長鏈脂肪 酸(LCFA)和極長鏈脂肪酸(VLCFA)。短鏈脂肪酸(SCFA)是具有少于六個碳的脂族尾部的脂 肪酸（即，丁酸）。中鏈脂肪酸(MCFA)是具有6-12個碳的脂族尾部的脂肪酸，其可以形成中鏈 甘油三酯。長鏈脂肪酸（LCFA)是具有13-21個碳的脂族尾部的脂肪酸。極長鏈脂肪酸 (VLCFA)是具有長于22個碳的脂族尾部的脂肪酸。本發明的脂肪酸可以是本領域技術人員 已知的任何合適的脂肪酸或者脂肪酸衍生物。
[0036] 接頭:本文使用的術語'接頭'是指形成從一個化學實體到另一個的連接的一個或 多個原子。例如，'第一接頭'在本文是指PEG或NPEG，其通過與其各個N-末端形成連接而將 兩個roz-域結合肽連接在一起。
[0037] 非蛋白質氨基酸:非蛋白質氨基酸還稱為非編碼的、非標準的或非天然氨基酸，其 不由遺傳密碼編碼。非蛋白質氨基酸的非窮盡列舉包括氨基-正丁酸、正纈氨酸、正亮氨 酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、氨基-正庚酸、哌啶羧酸(pipecolic acid)、aj-二 氨基丙酸、α，γ_二氨基丁酸、鳥氨酸、別蘇氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、β_丙氨酸、β-氨基- 正丁酸、氨基異丁酸、γ_氨基丁酸、氨基異丁酸、異纈氨酸、肌氨酸、Ν-乙基甘氨酸、Ν- 丙基甘氨酸、N-異丙基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-乙基丙氨酸、N-甲基β-丙氨酸、N-乙基β-丙 氨酸、異絲氨酸和a-羥基-γ -氨基丁酸。
[0038] NPEG:本文使用的術語NPEG是PEG接頭的接頭衍生物，但是其中一個或多個骨架氧 原子被氮原子替換。
[0039] Ns-NPEG二酸接頭:'Ns-NPEG二酸接頭'是這樣的結構，其中在接頭氮上NPEG接頭 的氮被鄰-硝基苯磺酰基(Ns)保護基保護，并且其中NPEG接頭的末端包含羧酸。這種化學試 劑或構造塊(building block)用于使兩個肽部分Pi和P2二聚。
[0040]四運:本文使用的術語'PDZ'是指突觸后密度蛋白質_95(^ostsynaptic density protein-95，PSD_95)、果繩大盤狀腫瘤抑制基因 （Qrosophila homologue discs large tumor suppressor，DlgA)和閉鎖小帶蛋白質-1 (名onula occludens-lprotein，zo_l) 〇 [00411 PEG:本文使用的術語' PEG '是指上文討論的乙二醇部分的聚合物。PEG具有化學式 C2n+2H4n+60n+2，并且重復結構為：
[0042]
[0043] 其中例如12個PEG部分或PEG12相當于12個乙二醇部分的聚合物。
[0044] 藥代動力學分布:本文使用的術語'藥代動力學分布'是指本文所述化合物的吸收 于血流中、分布于組織中、代謝和排泄的體內特征。藥代動力學分布包括的參數的實例是體 外血漿半衰期，其模擬血漿蛋白酶代謝化合物。
[0045] 蛋白質氨基酸:還稱為天然氨基酸的蛋白質氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、硒代半 胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨 酸、天冬酰胺、脯氨酸、吡咯賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和酪 氨酸。
[0046] PSD-95:本文使用的術語'PSD-95'是指突觸后密度蛋白質-95。
[0047] PSD-95抑制劑:本文使用的術語'PSD-95抑制劑'是指與PSD95的PDZUPDZ2或PDZ1 和PDZ2二者結合并且抑制由細胞中這些PDZ域促進的蛋白質-蛋白質相互作用的化合物。 PSD-95抑制劑抑制的相互作用的實例是nN0S、PSD-95和NMDA受體之間的三元絡合物形成。
[0048] II.具有改善的血漿半衰期的二聚化合物
[0049] 靶向PSD-95的二聚化配體作為慢性疼痛和缺血性中風的治療處于臨床前評價中 (Andreasen等人，Neuropharmacol，2013，67，193-200 ; Bach等人，PNAS USA，2012，109， 3317-3322)。然而，治療肽通常易受蛋白酶降解和腎過濾和/或肝代謝消除的影響(Tang等 人，J Pharm Sci，2004，93，2184-204)。由于二聚化配體的有限大小，它們可能通過腎過濾 從血液中清除，這是因為腎通常過濾出分子量低于60kDa的化合物（Dennis等人，J Bi〇lChem2002,277,35035-43)。為了制備更適合慢性疾病例如神經性疼痛的臨床應用的二 聚肽配體，給藥方案應該盡可能簡單，優選每日一次，以增加順應性（Claxton等人， ClinTher 2001，23，1296-310)。此外，患者通過適當途徑的自我給藥，例如皮下（8.〇.)給 藥，優于i.v.(靜脈內）注射。皮下給藥的主要限制是需要藥物高度有效、高度濃縮、可溶并 從循環緩慢降解和排泄的低注射體積的要求(Dychter等人，J InfusNurs 2012,35,154- 60)。此外，藥物應該在注射儲庫中穩定并且緩慢吸收于循環中以延長藥物作用(Havelund 等人，Pharm Res 2004,21，1498-504)。因此，二聚肽配體的藥代動力學分布和體內半衰期 應該進一步優化以解決這些問題。
[0050] 白蛋白結合
[00511人血清白蛋白（HSA)是人血清中最豐富的蛋白質，占55%的總血清蛋白質 (Elsadek等人，J Control Release 2012,157,4-28)，其提供解決這些問題的機會。HSA的 平均血液濃度為520_830μΜ，并且分子量為約66.5kDa(Kragh_Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002,25,695-704 ) dSA在血液、肌肉組織和皮膚中是豐富的（Sleep等人， BiochimBiophysActa 2013，1830,5526_34)，但是在正常條件下不存在于神經元內。然而， 在其中血腦屏障（BBB)受損的疾病狀態例如中風中，其可能進入神經元（L0berg，APMIS 1993，101，777-83)。批4充當許多內源性配體例如脂肪酸$48)、血紅素、膽紅素和色氨酸 (Simard等人，PNAS USA，2005,102,17958-63;Kragh-Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002， 25,695-704)和藥物例如華法林和地西泮以及金屬離子的運輸和儲庫蛋白（Yamasaki等人， BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)。
[0052]已經廣泛研究了 HSA的結構，并且HSA的多于90個不同X-射線結構儲存在具有71個 不同配體的蛋白質數據庫（Protein Data Bank,Η)Β，26/09/2013存入hHSA是具有80x80x 30 A的合適尺寸的心型分子，并且由三個類似域（Ι、Π 和III)組成，其被進一步分為兩個 亞域(a和b) (Sugio等人，Protein Eng 1999,12,439_46)。大部分藥物在Sudlow' s位點 1(還 稱為華法林位點）和II(還稱為地西泮位點）結合(Elsadek等人，J Control Release 2012， 157，4-28; Yamasaki等人，BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)，由在1975年通過熒 光光譜鑒定位點的Sudlow和同事的創舉工作命名（Sudlow等人，MolPharmacol 1975，11， 824-32)。已經繪制了兩個藥物結合位點，并且分別在亞域Ila(來自亞域Ilia和lib中的殘 基）和IIla內發現（Yamasaki等人，BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)。Sudlow' s位 點I和Π 的一般結合的一個重要例外是脂肪酸(FAs)。
[0053]從1970開始已知藥物的高HSA結合增加藥物半衰期的概念。然而，使用HSA增加治 療肽和蛋白質的半衰期的具體概念發展得更緩慢，從2002(約250個出版物/年）至2010(約 500個出版物/年)每年出版物數目加倍(Elsadek等人，J Control Release 2012,157，4_ 28)。已經描述了若干基于肽的HSA結合部分，包括HSA結合序列，其由噬菌體展示鑒定 (Dennis等人，J BiolChem2002，277，35035-43)，從天然來源（Jonsson等人，Protein Eng Des Sel 2008,21，515_27)和所謂的adnectins(Lipovsek等人，Protein Eng Des Sel 2011，24,3-9)分離。然而，這些可能易受蛋白酶降解的影響，其在目前的皮下給藥的情況下 可能特別成問題，其中假設開發的化合物于皮下儲庫中保留若干小時。
[0054] 總體結構
[0055]為了改善藥代動力學分布，本發明人研究了脂肪酸和接頭類型對HSA親和性、PSD- 95親和性和產生的化合物的疏水性的影響。在這種情況下，已經鑒定了提供所需HSA-結合 分布和人血漿中增強的穩定性的新化合物。
[0056]因此，在一個方面，本發明涉及包含第一肽(P〇和第二肽(P2)的化合物，其中PjP P2各自包含至少兩個蛋白質或非蛋白質氨基酸殘基，并且其中P#PP2均通過其N-末端與第 一接頭Li連接，并且其中U包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個氧原子被氮原子替 換以得到NPEG，并且其中白蛋白結合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L2與NPEG的氮原 子連接。
[0057]在某些實施方案中，所述化合物具有通式（I):
[0058]
[0059]白蛋白結合部分可以是任何合適的結合白蛋白的化學基團，優選的白蛋白結合部 分是脂肪酸(FA)。在一個實施方案中，所述化合物因此具有通式(II):
[0060]
[0061] 脂肪酸可以是任何合適的脂肪酸，例如飽和或不飽和脂肪酸。如上面式(I)和（II) 所例示的，白蛋白結合部分例如脂肪酸可以通過第二接頭L2任選與NPEG接頭(U)的氮原子 連接。在其中包括第二接頭1^的實施方案中，該接頭包含氮原子。
[0062] 在一個實施方案中，本發明的化合物具有式(III)或（IV)的一般結構：
[0063]
[0064] 其中
[0065] RjPR2各自選自Η和 C00H，
[0066] η為0-48的整數，
[0067] m為1-48的整數，
[0068] p為0-28的整數，
[0069] q為0-28的整數，
[0070] i為0-12的整數，
[0071] j為0-12的整數，
[0072]并且其中丹和內各自選自肽，其包含至少兩個蛋白質或非蛋白質氨基酸殘基。 [0073]第一接頭(U)
[0074]脂肪酸在活性上顯示的性質依賴于這些部分連接的方式。通過第一接頭 L!和第二接頭L2實現連接。W0 2012/156308在某種程度上描述了第一接頭1^，其由形成聚乙 二醇的許多乙二醇部分組成，其中一個氧原子已被氮原子替換以形成NPEG接頭。NPEG接頭 可例示為在氮原子兩側的每側上為一定數目（P，q)的乙二醇部分。
[0075] 在本發明的不同實施方案中在氮原子兩側的乙二醇部分的數目是可變的。在一個 實施方案中，一側乙二醇部分的數目（P)與另一側乙二醇部分的數目相同，即，P = q。在其他 實施方案中p>q或p〈q。
[0076] 在一個實施方案中，p和q的總和是0-28的整數，例如其中乙二醇部分的數目p選自 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或 28 〇
[0077] 在一個實施方案中，乙二醇部分的數目p為1-4，因為該范圍的p提供了對PSD-95的 最高親和性。
[0078] 在一個實施方案中，乙二醇部分的數目q選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 個乙二醇部分。
[0079]在一個實施方案中，乙二醇部分的數目q為1 _4，因為該范圍的q提供了對PSD-95的 最高親和性。
[0080] 在一個實施方案中，乙二醇部分的總數p+q為2-12,因為該范圍內的接頭長度提供 了對PSD-95的最高親和性。
[0081] 在一個實施方案中，乙二醇部分的數目p+q為4,因為該范圍的接頭長度提供了對 PSD-95的極最高親和性。
[0082] 在另一實施方案中，乙二醇部分的數目p+q為6,因為該范圍的接頭長度提供了對 PSD-95的極高親和性。
[0083] 第二接頭(L2)
[0084] 第二接頭1^2是任選的并且取決于特定目的所需的物理或化學性質可以被包括或 排除。若存在，第二接頭L2包含氮原子。第二接頭L2可以例如選自γ-Glu、γ-丁酸(GABA)、5- 氨基戊酸（5-Ava)、蛋白質氨基酸、非蛋白質氨基酸和具有通SH2N-[Q]-C00H的任何化合 物，其中Q是任何合適的一個或多個原子或分子。
[0085] 如上文所述，第二接頭可以包含重復碳部分，由此形成例如烷基或烯基鏈。重復單 元（i)和/或(m)的數目可以取決于所需性質而變化。因此，i和/或m是各自選自0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數。
[0086] 在一個實施方案中，η是1-3的整數，例如在其中n = l或n = 2或n = 3的實施方案中。 [0087] 在某些實施方案中，i和/或j是0-12的整數，例如選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11和12的整數。
[0088] 在某些實施方案中，選擇接頭LjPL2使得本發明的化合物選自：
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 在進一步的實施方案中，選擇接頭使得本發明的化合物選自：
[0093]
[0094]
[0095]
υ
[0096] 脂肪酸(FA)
[0097] 脂肪酸是飽和或不飽和的具有脂族尾部(鏈)的羧酸。大部分天然發現的脂肪酸具 有4-28的偶數個碳原子的鏈。脂肪酸通常源自甘油三酯或磷脂。當它們不與其他分子連接 時，它們稱為游離脂肪酸。
[0098] 具有碳碳雙鍵的脂肪酸稱為不飽和脂肪酸，而沒有雙鍵的脂肪酸稱為飽和脂肪 酸。不飽和脂肪酸在碳原子之間具有一個或多個雙鍵。在某些實施方案中，本發明的化合物 包含不飽和脂肪酸。在這種實施方案中，通式(III)、（IV)、(V)或(VI)的指示物(i)和/或(j) 是各自選自0-12的整數，例如選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整數。
[0099] 不飽和脂肪酸可以順式或反式構型，或者二者的混合物獲得。
[0100] 順式構型是指相鄰氫原子在雙鍵同側上。雙鍵的剛性固定其構象并且在順式異構 體的情況下，引起鏈彎曲并且限制脂肪酸的構象自由。鏈具有的順式構型的雙鍵越多，柔性 越小。當鏈具有許多順式構型的雙鍵時，其以其最易獲得的構象變得完全彎曲。例如，具有 一個雙鍵的油酸在其中具有〃扭結(kink)"，而具有兩個雙鍵的亞油酸具有更顯著的彎曲。 具有三個雙鍵的亞麻酸具有鉤狀形狀。在受限環境中，其效果為例如當脂肪酸為脂質雙 分子層的一部分磷脂或脂質液滴的甘油三酯時，順式雙鍵限制脂肪酸緊密包裹的能力并且 因此可能影響膜或脂肪的熔化溫度。
[0101] 相反，反式構型是指兩個相鄰氫原子結合于雙鍵的相對兩側。因此，它們不引起鏈 過度彎曲，并且它們的形狀類似于直鏈飽和脂肪酸。
[0102] 選擇任何適合預定目的的脂肪酸，包括順式、反式或混合脂肪酸，均在本發明的范 圍內。
[0103] 本發明的化合物可以包含任何合適的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個實施方案 中，脂肪酸是通式(ΠΙ)或（IV)定義的脂肪酸，其中m是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數，例如其中111是10-16的整數，例如其中111=10 或其中m= 16,其毫無疑問地確定高度HSA相互作用(表1)。
[0104] 本發明的脂肪酸可以為C4-C22脂肪酸或選自辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚 酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸、蠟酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、十六碳烯酸、油酸、 反油酸、異油酸、亞油酸、反式亞麻酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二 碳六烯酸的脂肪酸。
[0105] 肽沾釉^)
[0106] 本發明的化合物包含兩個肽PdPP2 UPP2可各自為任何肽，各自包含至少兩個氨 基酸殘基，并且本發明的二聚化合物因此可以適合預定目的。
[0107] 在優選的實施方案中，本發明的化合物為PSD-95抑制劑，其中兩個肽與PSD-95的 rozi-2結合。因此，在某些實施方案中，化合物為通式(I)、（π)、（in)或（iv)中任一者限定 的化合物，其中：
[0108] ?!包含氨基酸序列X4X3X2XKSEQ ID N0:1)，和
[0109] P2包含氨基酸序列Z4Z3Z2ZKSEQ ID N0:2)，
[0110] 其中
[0111] aWdP/SZl·為選自I、L和V的氨基酸殘基，
[0112] b)X2 和/或 Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N- Me-S和N-Me-V的氨基酸殘基，
[0113] c)X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0114] d)X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0115]其中XjPZi均各自表示包含游離羧酸的最終C-末端氨基酸殘基。
[0116]因此，在某些實施方案中，本發明的化合物具有式(V)或(VI)的一般結構：
[0117]
[0118]
[0119] RjPR2各自選自Η和 C00H，
[0120] η為0-48的整數，
[0121] m為1-48的整數，和
[0122] p為0-28的整數，
[0123] q為0-28的整數，
[0124] i為0-12的整數，
[0125] j為0-12的整數，
[0126] Χ5和/或Z5為任選的氨基酸殘基、肽或多肽，
[0127] X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0128] X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0129] X2 和/或 Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N-Me-S 和N-Me-V的氨基酸殘基，
[0130] XjP/^Zi為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0131 ]如果χ5為單一氨基酸殘基，則其選自蛋白質和非蛋白質氨基酸殘基。
[0132] 在一個實施方案中，Χ5為選自I、A、L和V的氨基酸殘基。
[0133] X5也可以為具有由2-100個氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽或多肽，其中所述 肽或多肽的C末端是選自I、A、L和V的氨基酸殘基。
[0134] 在本發明的某些實施方案中，X5為包含2-100個殘基的肽，例如2-90個氨基酸殘 基，例如2-80個氨基酸殘基，例如2-70個氨基酸殘基，例如2-60個氨基酸殘基，例如2-50個 氨基酸殘基，例如2-40個氨基酸殘基，例如2-30個氨基酸殘基，例如2-20個氨基酸殘基，例 如2-10個氨基酸殘基，例如2-9個氨基酸殘基，例如2-8個氨基酸殘基，例如2-7個氨基酸殘 基，例如2-6個氨基酸殘基，例如2-5個氨基酸殘基，例如2-4個氨基酸殘基，例如2-3個氨基 酸殘基，其中C末端是選自I、A、L和V的氨基酸。
[0135] 本發明的概念通常是可得的，如通式（1)、（11)、（111)、（1￥)、（￥)和以)例示的，本 發明人已經制備了本發明內的許多化合物，包括適合與PSD-95的PDZ1-2結合的PjPP2的肽 基序。
[0136] 閔此，亦一個窀施方鎣中，木發明的化合物詵白，
[0137]
[0138]
[0139]
[0140] 聯。
[0154] 在一個實施方案中，可以如下所定義來合成本發明的化合物。
[0155] Ns-NPEG二酸接頭：在固相上或在溶液中制備鄰硝基苯磺酰基(Ns)-保護的NPEG接 頭。
[0156] 固相操作通常由用Fm〇c-NH-PEG-CH2CHKOOH裝載可用于固相肽合成的固體載體 (例如2-氯三苯甲基氯樹脂)開始，該操作使用針對具體樹脂的合適的有機溶劑(例如DCM、 DMF、ACN、THF)和堿(例如DI PEA、DBU、三甲基吡啶、NMM)。
[0157] Fmoc基團可以通過堿(例如哌啶、二甲基胺、嗎啉、哌嗪、二環己基胺、DMAP)在適當 溶齊丨J (例如DMF、DCM、ACN、THF)中移去。
[0158] 可使用堿(例如DIPEA、DBU、三甲基吡啶、NMM)和適當溶劑(例如THF、DCM)使鄰硝基 苯磺酰氯與游離胺偶聯以得到Ns-nh-peg-ch2ch2coo-樹脂。
[0159] 可通過使用Mi tsunobu-化學將接頭產物的第二部分與樹脂連接的接頭部分連接。 用三苯基膦、H0-PEG_CH2CH2C00tBu、溶劑和偶氮二羧酸的酯或酰胺試劑(例如偶氮二羧酸二 異丙酯，DIAD;偶氮二羧酸二乙酯，DEAD;1，1'_(偶氮二羰基)-二哌啶，ADDP)處理樹脂。
[0160] 通過用酸例如三氟乙酸(TFA)處理樹脂獲得最終的Ns-NPEG二酸接頭。
[0161] 固相操作可以通過如下進行：用Ns保護NH2-PEG-CH2CH 2COOtBu的氨基，隨后使用三 苯基膦和DI AD、DEAD或ADDP或類似試劑、H0-PEG_CH2CH2C00tBu和適當溶劑(THF、DCM)進行在 溶液中的Mitsunobu化學。然后通過用酸例如TFA處理獲得最終的Ns-保護的NPEG-接頭。
[0162] 肽合成:通過基于Fmoc的固相肽合成使用固體載體(例如2-氯三苯甲基氯樹脂或 Wang樹脂）、Fmoc-保護的氨基酸、堿、偶聯試劑(例如HBTU [N，N，Y，Μ -四甲基-0-(1H-苯并 三唑-1-基)脲鑰六氟磷酸鹽]、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-Ν，Ν，ΥΥ -四甲基脲鑰六氟磷 酸鹽[HATU]、PyB0B、DIC/H0Bt)和溶劑合成肽序列。除了偶聯試劑，還可以使用Fmoc-保護的 氨基酸的活化酯(例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯）。
[0163] 二聚化:經樹脂上二聚化(on-resin dimerization)方法通過在堿、偶聯試劑和適 當溶劑(例如DMF、DCM、THF)中用亞化學計量的量(例如1/6)的Ns-NPEG二酸接頭反復處理樹 月旨，使Fmoc-脫保護的樹脂連接肽與Ns-NPEG二酸接頭二聚化。除了偶聯試劑外，還可以使用 Ns-NPEG接頭的活化酯。
[0164] 還可以使用Ns-NPEG接頭的活化酯（例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯）以及1-羥基_ 7_氮雜苯并三唑(HOAt)或羥基苯并三唑(HOBt)和適當的側鏈保護的肽(例如叔丁基)在溶 劑(例如ACN、DMF、DCM、THF)中而在溶液中形成二聚化的方法。而且，溶液中的二聚化可以使 用Ns-NPEG二酸接頭、偶聯試劑(例如HBTU、HATU等）、堿和溶劑來進行。
[0165] Ns-基團通過巰基乙醇和1，8_二氮雜二環[5.4.0]^碳_7_烯(DBU)或者通過苯 硫酸納移去。
[0166 ] 接頭和脂肪酸綴合:可以通過Fmo c -保護的接頭（例如Fmo c -G1 u-01 Bu、Fmo c -GABA、 Fmoc-5-Ava-OH)的連續偶聯使用偶聯試劑和用于活化的堿，使氨基酸接頭與NPEG-二聚化 的且樹脂連接的肽的游離氮偶聯。除了偶聯試劑外，還可以使用Fmoc-保護的氨基酸接頭的 活化酯。隨后通過脫保護方法移去Fmoc基團。
[0167]使用偶聯試劑和用于活化的堿使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯。或者，作為活 化酯偶聯。如果脂肪酸含有羧基，除了與接頭-二聚體綴合物的胺反應的羧基外，這些還可 以作為酯例如甲酯保護。
[0168] 可將脂肪酸-連接的二聚化配體與樹脂分離并伴隨使用酸例如TFA或HC1的側鏈脫 保護。
[0169] 可通過在含水堿(例如NaOH、LiOH)和乙腈中攪拌分離的產物，隨后用TFA或HC1酸 化來移去酯保護基團。
[0170]通過凍干和HPLC純化或者類似色譜方法獲得本發明的化合物。
[0171]在進一步的實施方案中，本發明的化合物的合成如實施例1所定義來進行。
[0172] 實施例
[0173] 實施例1:合成
[0174] 如先前所述合成樹脂連接的NPEG4IETAV(SEQIDN0:3)二聚化配體（Il)(Bach等 人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)。由此，通過兩個連續偶聯使用HATU作為偶聯試劑、隨 后用哌啶/DMF脫保護，使適當保護的接頭（分別為Fm〇C-GABA-OH、Fm〇C-(l)-Glu-0tBu和 Fmoc-5-Ava)與NPEG4接頭中的氮連接，得到中間體12-4(圖6)。使用固相肽合成條件容易得 使脂肪酸(FA1-4,圖6)與接頭中釋放的氮連接，并與樹脂分離，同時伴隨側鏈保護基的脫保 護。然后通過皂化分離的產物、隨后酸化，移去單保護的FA構造塊(十二烷二酸甲酯和十八 烷二酸甲酯，FA2和FA4)的末端甲基保護基（圖6)。凍干后，將粗產物溶于100%DMS0并通過 大規模C18RP-HPLC純化。凍干半純的餾分(50-90%純度），再次溶于DMS0/ACN/U0并通過制 備C4RP-HPLC純化(>95 % 純度）。
[0175] 圖6例示了 FA-連接的二聚化配體(1-12)的合成。方案1的反應條件如下：（&奸!11〇(3- GABA-〇H/Fmoc-(1)-Glu-〇tBu/Fmoc-5-Ava，HATU，三甲基吡啶，DMF( lh x2)，然后20 %哌啶/ DMF; (b)FAl/FA2/FA3/FA4，HBTU，DIPEA，DMF/DCM，45min，然后TFA/TIPS/H20(90/5/5) ;(c) 0.5M Li0H，H20/ACN(75/25)，30min，然后TFA至pH〈2。三角形表示E和T是經側鏈保護的（叔 丁基）。
[0176] 十八烷二酸單甲酯(FA4)不是可商購得到的，而是通過用一當量的NaOH單皂化相 應的二甲酯來合成，如先前所述(Jonassen等人，Pharm Res，2012,29,2104-2114)(圖7)〇
[0177] 總之，實施例1證明了本發明化合物可以合成并以純的形式獲得。
[0178] 實施例2:測定對HSA的親和性的方法
[0179] 使用TransilXL HAS結合測定試劑盒(Sovicell GMBH，Leipzig，Germany)評價合成 的FA-連接的二聚化配體（1 -12)的HSA親和性。還針對比較測試了二聚化配體UCCB01 -125 (Bach等人，Angew· Chem，Int ·Ed，2009，48，9685-9689)和UCCB01-144(Bach等人，PNAS USA， 2012,109,3317-3322)(表1，圖1)。
[0180] 測定試劑盒由具有增加濃度的固定HSA的預填充的孔以及兩個無 HSA的對照孔組 成。已經以隨機模式固定HSA以確保HSA上的所有結合位點是可用的。為了進行測定，用已知 濃度的測試化合物孵育孔，并且使用分析RP-HPLC (C8柱）量化化合物的未結合量。由RP- HPLC數據通過與無 HSA的對照樣品比較來計算每個數據點的未結合藥物的分數(fu)。然后 針對孔中總HSA濃度(CHSA)繪制每個數據點的HSA-結合藥物(f b = 1 -f u)與未結合藥物的比 例，并擬合為線性模型，如方程1所給出，從而得到作為擬合曲線的斜率的1/Kd。
[0181]
[0182] 在方程1中，假定藥物結合HSA的濃度（[HSA-D])遠低于孔中HSA的總濃度（[HSA-D] 〈〈CHSA)。已經設計了測定試劑盒，使得該假定對于其中fU>l %的化合物是有效的。
[0183] 使用計算的KD-值，使用方程2計算在HAS的生理濃度(588μΜ)的fb。
[0184] 方程 2
[0185] 總之，實施例2證明了可以測定以及如何測定本發明化合物與人血清白蛋白（HSA) 的結合。
[0186] 實施例3:對HSA的親和性
[0187] 不含FAs的二聚化配體UCCB01-125和UCCB01-144顯示HSA親和性分別為154.3μΜ和 317.5μΜ，其相對于HSA結合分數(fb)分別為75 %和65 % (表1)。然而，所有FA-連接的二聚化 配體（1-12)顯示與無 FA的配體相比，對HSA的親和性明顯更高，且相應的fb值更高(表1)。因 此，這清楚地證明了作為將FA與二聚化配體綴合的結果，HSA結合得到了顯著增強。
[0188] 與具有較短接頭(GABA，yGlu)的化合物相比，含有較長5-Ava接頭的化合物通常 具有略低的對HAS的親和性(表1，圖2)。γ Glu接頭(R1)中的其他酸部分似乎對此處合成的 FA-連接的二聚化配體的HSA親和性沒有任何影響(表1，圖2)。這與其他蛋白質-配體體系中 觀察到的相反（Hackett等人，Adv Drug Deliv 1^￥，2013,65，1331_1339)，并且表明丫6111 接頭的游離羧酸酯不是本發明化合物與HSA連接的必需特征。
[0189] 與連接較短FAs (m = 10)的二聚化配體相比，與長FAs (m = 16)連接的二聚化配體顯 示更好的HSA親和性(表1);并且末端羧基(R2)對HSA親和性具有負面影響(表1和圖2)。 [0190] 表1:針對FA-連接的二聚化配體（1-12)和二聚化配體UCCB01-125和UCCB01-144的 HAS結合以及結合化合物的計算分數a
[0191
[0192]
[0193] a數據顯示為平均值土SEM，n = 3
[0194] 總之，實施例3證明了與非FA-衍生的二聚化參比肽相比，本發明化合物具有增加 的HSA親和性。
[0195] 實施例4:測定對PSD-95的Η)Ζ1-2親和性的方法：
[0196] 使用體外熒光偏振（FP)測定測量對PSD-95的親和性，如Bach等人（PNAS USA， 2012，109,3317-3322)所述。首先，獲得飽和結合曲線以確定二聚化熒光探針和PSD- 95TOZ1-2之間的相互作用的KD值。于恒定濃度(0.5nM)的探針中加入增加濃度的Η)Ζ1-2。在 激發/發射波長635/670nm測量樣品的熒光偏振，并使用程序GraphPad Prism將FP值擬合至 一個位點結合模型。然后，在異種競爭結合測定中確定非熒光二聚化配體和PDZ1-2之間的 親和性，其中向固定濃度的二聚化探針(〇.5nM)和Η)Ζ1-2(4ηΜ)中加入增加濃度的配體。在 GraphPad Prism中將FP值擬合至一個位點競爭(可變斜率)模型。將所得IC5Q轉換為競爭抑 制常數，1^值，如附1?)1〇￥81^-&31681^等人，八11&113;[0(31161]1，2004,332,261-273所述。如上所 述用1 % HSA在該測定中進行改良的FP測定。
[0197] 總之，實施例4證明了如何測試本發明化合物與PSD-95的Η)Ζ1-2的結合。
[0198] 實施例5:對PSD-95的Η)Ζ1-2的親和性：
[0199] 在FP測定中評價合成的FA-連接的二聚化配體對PSD-95 PDZ1-2的親和性。使用 UCCB01-125和UCCB01-144作為參比化合物（Bach等人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)(表 2,圖3)。
【申請人】首先使用簡單的tris-緩沖鹽水(TBS)緩沖劑測量親和性(表2,圖3A);但是， 此外，
【申請人】通過進行FP測定用存在于測定緩沖劑中的HSA研究HSA是否影響FA-連接的二 聚體結合PSD95 PDZ1-2的能力（表2，圖3B)。由于探針與較高濃度HSA的結合，此處將HSA濃 度設定為1% (~150μΜ)，其約為估計的生理學血液濃度（520-830μΜ)的四分之一(Kragh- Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002,25,695_704)〇
[0200] 對于傳統小分子藥物，普遍接受的是藥物的未結合部分自由擴散穿過膜并且通過 與其革E標相互作用發揮生理學效應(Berezhkovskiy等人，J Pharm Sci2007,96,249-257)。 即，如果藥物與另一分子結合，則其不能同時與靶標相互作用。為了說明這一點，在150μΜ的 HSA濃度由方程2(fu=l-fb)計算未結合藥物分數(fu)，并且針對計算的fu校正FP測定數據 (TBS+HSA)(表2,圖 3C)。
[0201] 表2:如經FPa測定的FA-連接的二聚化配體（1-12)和二聚化配體（UCCB01-125和 UCCB01-144)的對PSD-95PDZ1-2的親和性、未結合藥物的計算分數(fu)b、f u-校正的FP數據a以及如經RP-HPLC(C8柱)e測定的化合物的保留時間(Rt)。
[0204] ^TBS和含1%HSA的TBS中記錄FP數據。數據顯示為平均值土SEM，n 2 3.
[0205] 噴據方程 2計算的 Fu，f b = 1 _f u，cn = 1.
[0206] 對于所有FA-連接的二聚化配體而言，其在TBS中對PSD-95 PDZ1-2的親和性與 UCCB01-125的親和性是可比的（表2,圖3A)，這表明PSD-95PDZ1-2親和性不受FA-衍生化影 響。
[0207] 含1%HSA的TBS中的PSD-95 PDZ1-2親和性在化合物之間顯著并且系統地變化(表 2，圖3B)。與較長FAs(C18:0或C17:0-C00H)連接的二聚化配體所具有的PSD-95 Η)Ζ1-2親和 性通常明顯小于與較短FAs(C12:0或Cll: 0-C00H)連接的二聚化配體的親和性的1/50。 [0208] 當針對fu校正FP數據時(表2,圖3C)，顯示每個接頭系列內PSD-95H)Zl-2親和性的 系統排序。C12:0-連接的二聚化配體（1、5、9)具有最高親和性，隨后是Cll:〇-⑶0H(2、6、 10)、C18:0(3、7、11#PC17:0-C00H(4、8、12)。
[0209] Fu-校正的FP數據還顯示當在TBS+HSA中進行FP測量時，觀察到的C18:0-連接的二 聚化配體3、7和11的50-倍親和性損失主要由化合物與HSA的高度結合導致，盡管與TBS中記 錄的FP數據相比3和7觀察到4-5倍的PSD-95親和性降低(3:Ki = 57.2nM vs ll.lnM;7:Ki = 59. InM vs 17. OnM，表2)，但是在目前的情況下，親和性降低是HSA-依賴性的，這是因為在 TBS中未觀察到親和性下降。
[0210] 兩個5-Ava-連接的二聚化配體11和12與相應的GABA和γ Glu-連接的二聚化配體 (3、4、7和8)相比，受HAS的影響較少。
[0211 ]總之，實施例5證明了本發明的化合物與PSD-95的Η)Ζ卜2結合。
[0212] 實施例6 :FA-連接的二聚化配體的疏水性
[0213] 具有對HSA最高親和性的化合物(3、7、11)也是最具疏水性的合成化合物，如通過 分析性RP-HPLC測定的保留時間(Rt)判斷(表2)。為了增加親水性并由此增加這些化合物的 溶解度，制備3和7的類似物，其中用IETDV(SEQ ID N0:4)而非IETAV(SEQ ID N0:3)替換肽 序列（13，15;表3)，這是因為由Asp(D)部分引入的額外電荷可以增加二聚體的親水性。也合 成了含有末端酸部分的最高HSA親和性化合物的IETDV類似物(4)并測試（14)用于比較。使 用適當的肽序列（IETDV)作為起始點與1-12類似地合成這些FA連接的二聚體(圖6)。
[0214] 相對于基于IETAV的化合物(3、4、7)而言，HPLC分析顯示對于基于IETDV的化合物 (13-15)的Rt值較小地減少或沒有減少，并且因此疏水性較小地降低或沒有降低;但是觀察 到HSA親和性系統地降低(表3)。例如，在分析性RP-HPLC上13比IETAV類似物早3分鐘洗脫出 (13:58111丨11，3:61111丨11，表3)，但是批厶親和性降低（13:& = 83.(^]\1，3:& = 4.84]\1，表3)。
[0215] 表3 :具有不同肽序列的FA-連接的二聚類似物的比較。3、4和7肽序列IETAV(SEQ ID N0:3);13、14和 15肽序列IETDV(SEQ ID N0:4)。
[0216]
[0218]總之，實施例6證明了 HSA親和性不僅依賴于選擇的脂肪酸，而且依賴于選擇的肽 序列。
[0219] 實施例7:化合物1、4、7和13的血漿穩定性
[0220] 在改良版本的體外血漿穩定性測定中評價1、4、7和13的血漿穩定性(Bach等人， Angew. Chem，Int. Ed，2009，48，9685-9689)。在原始操作中，在人血漿中孵育研究的化合物。 然后在合適的時間點將樣品取出并通過用三氯乙酸(TCA)沉淀除去血清蛋白，然后通過RP- HPLC分析上清液。將獲得的峰面積標準化為To的量并擬合至一階衰減模型以計算半衰期。 當將該方法應用于FA-連接的二聚化配體時，樣品回收率低（〈5%)。這是由在TCA沉淀期間 除去作為HSA-結合的復合物的FA-連接的二聚化配體導致。因此，在TCA沉淀之前，進行樣品 在固體鹽酸胍(GnHCl)中的溶解至6M最終濃度。其目的是呈現樣品中的HSA，由此釋放FA-連 接的二聚化配體。
[0221] 在體外血漿穩定性測定中所有FA-連接的二聚化配體比UCCB01-125更穩定（圖4)。 不受理論限制，預期這是由于化合物的更高HSA結合，由此降低了酶消化可得的游離化合物 濃度。含有較短C12:0FA的化合物（1)比高度穩定的含有更長C18:0或C17:0-C00H FA的化合 物降解更快(4、7、13)。延長的穩定性可解釋為增加的HSA親和性(其防止蛋白酶使基于二聚 肽的化合物分裂)以及經FA介導的位阻。
[0222] 總之，實施例7證明了體外評價血漿穩定性的方法，且與非FA-連接的參比化合物 相比，本發明的FA連接的二聚化合物具有增加的血漿穩定性和半衰期。
[0223] 實施例8:體內藥代動力學研究
[0224] 為了測定FA-連接的化合物的藥代動力學性質，
【申請人】在雄性Wistar大鼠中單次 皮下（s.c.)推注后通過LC-MS/MS測量血液中所選化合物的濃度（圖5)。由此，顯而易見的是 所有FA-連接的二聚化配體與無 FA的二聚化配體(UCCB01-125)相比具有較長的T1/2和更大 的Tmax(表4和圖5)。1的效果最小，但是4、7和13非常顯著，其顯示Τ1/2大于8小時，相當于與 UCCB01-125相比>16-倍增加。增加的Tmax可解釋為由注射位點的延長的吸收。總之，這些性 質能夠通過皮下儲庫注射給藥并且由此緩慢和持續釋放化合物進入血液，由此需要較少給 藥即可保持藥物相關血液濃度。
[0225] 表4:大鼠中皮下注射后FA-連接的二聚化配體的藥代動力學參數
[0226]
[0227] a數據表示為平均值土 SEM，n = 3。
[0228] 實施例9:序列
[0229] SEQ ID N0:1
[0230] X4X3X2X1
[0231] 其中
[0232] X4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0233] X3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0234] Χ2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-厶、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0235] h為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0236] SEQ ID NO:2
[0237] Z4Z3Z2Z1
[0238] 其中
[0239] Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0240] Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0241] Z2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-八、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0242] Z!為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0243] SEQ ID NO:3
[0244] IETAV
[0245] SEQ ID NO :4
[0246] IETDV
[0247] SEQ ID NO :5
[0248] X5X4X3X2X1
[0249] 其中
[0250] X5為任意氨基酸殘基，
[0251] X4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0252] X3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0253] Χ2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-八、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0254] 心為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0255] SEQ ID NO:6
[0256] Z5Z4Z3Z2Z1
[0257] 其中
[0258] Z5為任意氨基酸殘基，
[0259] Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0260] Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0261] Z2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-厶、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0262] &為選自I、L和V的氨基酸殘基。
【主權項】
1. 化合物，其包含第一肽(Pi)和第二肽(p2)，其中PdPP2各自包含至少兩個蛋白質或非 蛋白質氨基酸殘基，并且其中PdPP 2均通過其N-末端與第一接頭1^綴合，并且其中U包含聚 乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個氧原子被氮原子替換以得到NPEG，并且其中白蛋白 結合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L 2與NPEG的氮原子連接。2. 根據權利要求1的化合物，其中所述化合物具有式(I)的一般結構：α3. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述白蛋白結合部分是脂肪酸(FA)。4. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物具有式(II)的一般結構：5. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述脂肪酸是飽和或不飽和脂肪酸。6. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中通過第二接頭。將所述脂肪酸與NPEG接 頭(U)的氮原子連接，其中L2包含氮原子。7. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中第二接頭1^2包含一個或多個部分，其選自 γ -Glu、γ -丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5-Ava)、蛋白質氨基酸、非蛋白質氨基酸，和具有通式 H2N-[Q]-COOH的任何化合物，其中Q為任何合適的一個或多個原子。8. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物具有式（III)或（IV)的一般 結構：其中 Ri和R2各自選自Η和COOH， η為0-48的整數， m為1-48的整數， P為0-28的整數， q為0-28的整數， i為0-12的整數， j為0-12的整數， P!和P2各自選自肽，其包含至少兩個蛋白質或非蛋白質氨基酸殘基。9. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中p = q。10. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中P>q。11. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中P〈q。12. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中p和q的總和是1-28的整數。13. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的數目p選自0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。14. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的數目p為0-4。15. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的數目q選自0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 個乙二醇部 分。16. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的數目q為0-4。17. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的總數p+q為2-12。18. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的總數p+q為4。 19 .根據前述權利要求中任一項的化合物，其中乙二醇部分的總數p+q為6。20. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中η為選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數。21. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中η為1-3的整數。22. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中η = 1。23. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中η = 2。24. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中η = 3。25. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中m為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數。26. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中m為10-16的整數。27. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中m= 10。28. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中m= 16。29. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述脂肪酸為(：4-&2脂肪酸。30. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述脂肪酸選自辛酸、癸酸、月桂酸、肉 豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸和蠟酸。31. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述脂肪酸選自肉豆蔻烯酸、棕櫚油 酸、十六碳烯酸、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反式亞麻酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳 五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。32. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中 Pi包含氨基酸序列X4X3X2Xi(SEQ ID ΝΟ:1)，和 Ρ2包含氨基酸序列Z4Z3Z2ZKSEQ ID ΝΟ:2)， 其中 aWdP/SZi為選自I、L和V的氨基酸殘基， b)X2 和/或 Z2 為選自 N-Me-V的氨基酸殘基， c )X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基， d)X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基， 其中XjPZi均各自表示最終的包含游離羧酸的C-末端氨基酸殘基。33. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物具有式(V)或(VI)的一般結 構：其中 Ri和R2各自選自Η和COOH， η為0-48的整數， m為1-48的整數，和 P為0-28的整數， q為0-28的整數， i為0-12的整數， j為0-12的整數， X5和/或Z5為任選氨基酸殘基、肽或多肽， X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基， X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基， X2和/或Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N-Me-S^PN-Me-V的氨基酸殘基， Χι和/或叾:為選自I、L和V的氨基酸殘基。34. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中X5為蛋白質或非蛋白質氨基酸殘基。35. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中Χ5為選自I、A、L和V的氨基酸殘基。36. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其中X5為肽或多肽，其具有由2-100個氨基酸 殘基組成的氨基酸序列，其中所述肽或多肽的C末端是選自I、A、L和V的氨基酸殘基。37. 根據權利要求2和3中任一項的化合物，其中X5為肽，其包含2至100個殘基，例如2至 90個氨基酸殘基，例如2至80個氨基酸殘基，例如2至70個氨基酸殘基，例如2至60個氨基酸 殘基，例如2至50個氨基酸殘基，例如2至40個氨基酸殘基，例如2至30個氨基酸殘基，例如2 至20個氨基酸殘基，例如2至10個氨基酸殘基，例如2至9個氨基酸殘基，例如2至8個氨基酸 殘基，例如2至7個氨基酸殘基，例如2至6個氨基酸殘基，例如2至5個氨基酸殘基，例如2至4 個氨基酸殘基，例如2至3個氨基酸殘基，其中C末端是選自I、A、L和V的氨基酸。38.根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物選自：39.根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物選自：40.根據前述權利要求中任一項的化合物，其中所述化合物選自：41. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其為所述化合物的藥用鹽或前藥形式。42. 根據前述權利要求中任一項的化合物，其用作藥物。43. 根據權利要求1-41中任一項的化合物，其用于治療或預防疼痛。44. 根據權利要求1-41中任一項的化合物，其用于治療或預防興奮性毒性相關疾病。45. 根據權利要求44的化合物，其中所述疾病為對CNS的缺血性或外傷性損傷/CNS中的 缺血性或外傷性損傷/CNS的缺血性或外傷性損傷。46. 制備根據權利要求1-41中任一項的化合物的方法，所述方法包括下列步驟： a) 制備Ns-NPEG二酸接頭， b) 使用基于Fmoc的固相肽合成來制備肽， c) 用Ns-NPEG二酸接頭使Fmoc-脫保護的肽二聚化， d) 任選通過中間體接頭，例如氨基酸接頭(L2)，使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯。47. 根據權利要求46的方法（步驟a )，其中鄰硝基苯磺酰基(Ns)-保護的NPEG接頭在固 相上或溶液中制備。48. 根據權利要求47的方法，其中固相操作通過如下進行：用Fmoc-NH-PEG-CH2CH2⑶0H 裝載適合固相肽合成的固體載體，例如2-氯三苯甲基氯樹脂，所述操作使用有機溶劑例如 DCM、DMF、ACN或THF;和堿例如DI PEA、DBU、三甲基吡啶或NMM。49. 根據權利要求47-48中任一項的方法，其中Fmoc基團通過堿例如哌啶、二甲基胺、嗎 啉、哌嗪、二環己基胺或DMAP在適當溶劑例如DMF、DCM、ACN、THF中移去。50. 根據權利要求47-49中任一項的方法，其中使用合適的堿例如DIPEA和合適的溶劑 例如THF、DCM將鄰硝基苯磺酰氯與游離胺偶聯，由此獲得Ns-NH-PEG-CH 2CH2C00-樹脂。51. 根據權利要求47-50中任一項的方法，其中使用Mitsunobu化學將接頭產物的第二 部分與樹脂連接的接頭部分連接，且其中隨后用三苯基膦、H0-PEG_CH 2CH2C00tBu、溶劑和偶 氮二羧酸的酯或酰胺試劑例如偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)、偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)或1， 1'-(偶氮二羰基)_二哌啶(ADDP)處理樹脂，隨后用酸例如三氟乙酸(TFA)處理樹脂，由此得 到最終的Ns-NPEG二酸接頭。52. 根據權利要求46的方法(步驟a)，其中溶液相操作通過如下進行：用Ns保護NH2-PEG-CH2CH 2COOtBu的氨基，然后使用三苯基膦和DIAD、DEAD或ADDP或類似試劑、H0-PEG-CH2CH 2COOtBu以及適當溶劑(THF、DCM)進行溶液中的Mi t sunobu化學，并用酸例如TFA處理， 由此得到Ns-保護的NPEG-接頭。53. 根據權利要求46的方法(步驟b)，其中使用基于Fmoc的固相肽合成來合成肽，該合 成使用固體載體例如2-氯三苯甲基氯樹脂或Wang樹脂，Fmoc-保護的氨基酸，堿，偶聯試劑 例如ΗΒΤΙ^Ν,Ν,Υ-四甲基-0-(1Η-苯并三唑-1-基)脲鑰六氟磷酸鹽]、0-(7-氮雜苯并三 唑-1 -基）-N，N，YY -四甲基脲鑰六氟磷酸鹽[HATU]、PyBOB、DIC/HOBt，和溶劑;或者通過 使用Fmoc-保護的氨基酸的活化酯，例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯來合成肽。54. 根據權利要求46的方法（步驟c)，其中用Ns-NPEG二酸接頭使用樹脂上二聚化方法 使Fmoc-脫保護的樹脂連接的肽二聚化，所述樹脂上二聚化方法包括用亞化學計量量例如 1/6的Ns-NPEG二酸接頭、堿、偶聯試劑和適當溶劑例如DMF、DCM或者THF反復處理樹脂;或者 通過使用Ns-NPEG接頭的活化酯例如五氟苯基酯或琥珀酰亞胺酯。55. 根據權利要求46的方法（步驟c)，其中所述二聚化方法在溶液中進行，其使用Ns-NPEG接頭的活化酯例如五氟苯基酯或琥珀酰亞胺酯以及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)或 羥基苯并三唑(HOBt)和適當的側鏈保護肽例如叔丁基;在溶劑例如ACN、DMF、DCM或THF中。56. 根據權利要求46的方法（步驟c)，其中所述二聚化方法在溶液中進行，其使用Ns-NPEG二酸接頭、偶聯試劑(例如HBTU、HATU等）、堿和溶劑。57. 根據權利要求54-56中任一項的方法，其進一步包括以下步驟:通過硫醇例如巰基 乙醇和1，8-二氮雜二環[5.4.0]^碳-7-烯(DBU)或者通過苯硫酚鈉移去Ns-基團。58. 根據權利要求46的方法(步驟d)，其還包括使用偶聯試劑和活化用堿或者使用活化 酯使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯。59. 根據權利要求46的方法(步驟d)，其還包括使氨基酸接頭與NPEG-二聚的且樹脂結 合的肽的游離氮偶聯，其通過連續偶聯Fmoc-保護的接頭例如Fmoc-Glu-〇tBu、Fmoc-GABA或 Fmoc-5-Ava-OH進行;通過使用偶聯試劑和活化用堿或者通過Fmoc-保護的氨基酸接頭的活 化酯進行。60. 根據權利要求58-59中任一項的方法，其中脂肪酸的羧基任選作為酯例如甲酯保 護。61. 根據權利要求46-60中任一項的方法，其中任選從樹脂切割脂肪酸連接的二聚化配 體，使用伴隨的通過酸例如TFA或HC1進行的側鏈脫保護。62. 根據權利要求46-61中任一項的方法，其中酯保護基團通過如下移去：在含水堿例 如NaOH或LiOH中攪拌切割的產物;然后使用TFA或HC1酸化。63. 根據權利要求46-62中任一項的方法，其中通過凍干和使用色譜方法的純化獲得最 終產物。64. 根據權利要求63的方法，其中使用HPLC進行純化。
【文檔編號】A61K38/17GK105828832SQ201480065303
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年11月26日
【發明人】K·斯特羅姆加德, A·巴赫, K·B·尼森
【申請人】哥本哈根大學