專利名稱：聚乙二醇-脂肪酸衍生物及其藥物結合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的、對水解穩定的，通過醚鍵連接的聚乙二醇-脂肪酸衍生物，它們的制備辦法，以及該類衍生物與藥物的結合產物，及其醫藥用途。
背景技術：
天然藥物活性成分中的蛋白質、多肽、萜類、甾體、生物堿、黃酮、蒽醌、苯丙素酚類等在生理活性上都表現出各種有效的性能，在醫藥中得到了廣泛的應用。它們的甙類、核苷類、多肽類衍生物也有相當的應用。作為天然活性成分，它們具有生物降解快，基本無殘留，毒副作用小等優點。但同時也有相應的問題存在，例如生物利用率低、生理半衰期短、水溶性差、引發機體免疫等不利之處。
解決此問題，已廣泛地使用聚乙二醇(PEG)衍生物，使其與蛋白質、肽或其他治療藥物結合，以降低生物降解作用，延長藥物的生理半衰期、降低其免疫原性和毒性。在臨床使用中，PEG及其衍生物作為制作藥物制劑的載體已經在很多商業藥品中得到了廣泛的應用。而將PEG鍵合到藥物分子的嘗試在最近十年里也得到了長足的發展。如PEG-intron_，一種α-干擾素與聚乙二醇的鍵合物就表現出了更長的循環半衰期和更好的治療效果。紫杉醇與聚乙二醇的鍵合物也相應的降低了毒性和延長了生物活性。聚乙二醇在人體內的代謝過程已相當清楚，是一種安全的，無副作用的藥物改性劑。
聚乙二醇可以用于和很多藥物連接。在與藥物結合時，常用到一種被稱為聚乙二醇化(PEGylation)的工藝，即聚乙二醇兩端的一個或二個端基被化學活化后具有一適當的官能團，此官能團對要結合的藥物中的至少一個官能團具有活性，能與之形成化學鍵。形成的鍵合物可在體內適當的情況下釋放出活性成分。
活性聚乙二醇(PEG)衍生物在很多文獻中均有報道。第5672662號美國專利描述了制備線形PEG的丙酸和丁酸以及它們的NHS酯。第5643575號美國專利描述了一種U形結構的PEG衍生物，在這種結構中，兩個線形PEG結構通過相同的基團連接到同一個分子上。但是在這些酸性基團和PEG之間的連接基團的疏水性從來沒有被認真地考慮和研究過。
PEG脂肪酸作為一種表面活性劑在廣泛地應用。但是脂肪酸部分在和PEG的連接過程中采用的多是脂肪酸的羧酸基團和PEG中的羥基或者氨基連接，形成的酯鍵或者酰胺鍵缺乏一定的穩定性。在這些結構中，脂肪酸的羧酸基團沒有了，無法和藥物分子鍵合。
采用醚鍵連接的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物將會具有更高的水解穩定性，它在PEG骨架和脂肪酸酸性基團之間提供了一個穩定的連接方式，有利于保證脂肪酸在以后的藥物連接過程中保持足夠的特性。這種連接方式所得到的PEG衍生物和藥物連接，將在水溶液中形成一種微球結構，藥物分子及疏水性的脂肪酸骨架會被PEG包裹在其中而得到保護。能夠有效的降低酶降解作用，提高在生物體內的半衰期和改變體內分布。如果它連接的對象本身也是一個疏水性的藥物前體，將會獲得更好的效果。當前商業中的PEG的羧酸衍生物，比如羧甲基化PEG、PEG丙酸、PEG丁酸都不具備足夠強的疏水性基團，因此它們和藥物結合物，比如紫杉醇，不形成微球結構，在水中會很快被水解掉而釋放出PEG成分。
本發明所提供的一系列酸性PEG衍生物將具有較長的疏水性基團，因此能夠提供更好的半衰期保護和提高治療效果。針對不同藥物的特性可以選用不同長度的疏水性基團，可以有效的提高相應藥物的穩定性和生物降解特性。
同時該聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物還可以進一步衍生為其他活性形式，比如NHS酯或者馬來酰胺，它們能夠在水溶液中和蛋白類藥物直接反應獲得活性鍵合物。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種如下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物 或B′-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-B(II)其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整數；并且A為C1-12的烷氧基、環烷氧基或烷氧芳基，或一個酯基；B和B’為羧基或選自酯基、酰氯、酰阱、馬來酰亞胺和吡啶并二硫化物之一的官能團。
在本發明的一個優選實施方案中，提供一種如下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物CH3O-PEG-O-(CH2)l-COOH(Ia)或HOOC-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-COOH(IIa)
其中PEG是聚乙二醇聚合物，包括支鏈、直鏈、星形和樹形；l是4-18的整數。
本發明也包括下式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物 或 其中PEG是聚乙二醇聚合物，包括支鏈、直鏈、星形和樹形；l是4-18的整數；F為一個官能團，它和酸性基團共同組成了一個活性的官能團，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)、酰氯、酰阱、馬來酰亞胺、吡啶并二硫化物。能夠和藥物分子中的氨基、羥基，巰基等反應。
本發明還提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物 其中，F為一個官能團，它和酸性基團共同組成了一個活性的官能團，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)、酰氯、酰阱、馬來酰亞胺、吡啶并二硫化物。能夠和藥物分子中的氨基、羥基，巰基等反應；Y為一個活性官能團，包括酯基(比如NHS酯或者HOBT酯)；并且，所述的作為F的酯基和作為Y的酯基可以相同或不同。
本發明還提供了一種制備如式(Ia)的化合物的方法，該方法包括采用PEG和溴代氰化物反應，然后水解氰基得到相應的酸性基團的步驟。
本發明進一步提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物和藥物連接的結合物 或 其中A為如上所述的基團；X和X’相同或不同，為O、NH或S；Drug為藥物分子。
本發明優選提供如下通式的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物和藥物連接的結合物
其中PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整數；X為連接基團，包括O、NH、S等；Drug為藥物分子。
根據本發明的另一個方面，其提供包含上述聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物作為活性成分的藥物組合物。
根據本發明的再一個方面，其提供所述聚乙二醇(PEG)-脂肪酸活性衍生物在制備藥物及藥物組合物中的用途。
根據本發明的藥物結合物可改善藥物吸收，延長作用時間，增強療效，降低給藥劑量及避免某些毒副作用。
具體實施例方式
在本發明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物中所用的聚乙二醇是一種親水性聚合物，這種親水性聚合物還可以是聚乙二醇與聚丙二醇、聚乙烯醇、或者聚丙烯嗎啉的共聚物，其中特別優選是聚乙二醇。此等親水性聚合物通過對游離端羥基的修飾，將脂肪酸等酸性基團結合到該聚合物的母體上，使該聚合物能夠提供與藥物分子的連接點，由此與蛋白質、多肽或者其他天然藥物活性成分中的游離氨基、羥基等連接在一起。
本發明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物與普通的PEG脂肪酸表面活性劑不同之處在于，采用的是醚鍵將脂肪酸和PEG連接起來，這種結構的水解穩定性明顯高于普通的酯鍵和酰胺鍵；同時，在本發明的結合物中，游離的脂肪酸的羧基基團提供了與蛋白質、多肽或者其他天然藥物活性成分的結合點。因此，這種結構將會顯著改善藥物前體在體液中的水解穩定性。由于諸如脂肪酸本身所含有的非親水性基團，因此更有利于和一些非親水性的藥物分子，如一些天然藥物活性成分結合，從而使該結合物在水溶液中形成以若干分子聚集組成分子團的微球結構。該結構保留了親水性聚合物良好的親水性、柔性、抗巨噬細胞吞噬性等優良特性，同時提供了對藥物分子的緩釋控釋，可以極大的延長藥物，尤其是天然藥物分子，在體內的停留周期。
本發明的一個優點是除了保留有親水性聚合物如聚乙二醇通常的溶解性、非免疫原性和無毒等特征外，醚鍵結構將有助于保持藥物分子的穩定性，減低在到達靶器官的非正常損耗。同時微球結構也有助于改善在體內的分布，保證了藥物分子的有效血藥濃度和分步釋放。
現在以聚乙二醇衍生物為例，說明本發明中親水性聚合物與脂肪酸的連接。
聚乙二醇衍生物的結構中包括了聚合物支鏈部分和端基功能團部分，分別描述如下。
聚乙二醇(PEG)，其結構通式如I所示 其中R為H或C1-12烷基，n為任何整數，表征其聚合度。
當R為低級烷基時，R可以是含有1-6個碳原子的任何低級烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基或正己基。當R為環烷基時，R優選為含3-7個碳原子的環烷基，如環丙基、環丁基和環己基。優選的環烷基為環己基。其典型的化合物是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其他聚乙二醇類似物或聚乙二醇共聚物也可用于此發明應用，如聚丙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯嗎啉等。
對聚乙二醇而言，一般采用分子量予以表示，只要使形成結合物的聚乙二醇的分子量為300～60000道爾頓，這相當于n為大約6～1300。更優選的是，n為28、112和450，這分別相應于分子量為1325、5000和20000。由于通常由其平均分子量而非自重復單元限定的起始PEG化合物的潛在不均一性，優選用分子量表征聚乙二醇聚合物，而不是用整數n表示PEG聚合物中的自重復單元。各種分子量的起始PEG化合物可以通過本領域中的已知方法制備或者可以從商業來源得到。
本發明中聚乙二醇(PEG)-脂肪酸制備部分是采用PEG和溴代氰化物反應，然后水解氰基得到相應的酸性基團的方法。在實際應用中，需要對親水性聚合物的端基部分予以活化，以保證其能夠和溴代氰化物發生反應而將二者結合。常用的方法是用氫化物將PEG端基的羥基活化為醇鈉或醇鉀，以提高其和溴代物的反應性質。一個典型的反應如下
親水性聚合物上如果有游離羥基，則該游離羥基可用C1-12烷氧基、環烷氧基或芳烷氧基封端，優選是甲氧基、乙氧基、異丙氧基、環丙氧基、環丁氧基、環己氧基以及芐氧基。
另外，在該親水性聚合物上還可連接靶向分子，如抗體等，以便定向轉運本發明的結合物。
在目前使用的許多藥物、尤其是天然藥物成分中都含有氨基、羥基等官能團。親水性聚合物的羧酸基團與藥物分子可例如通過酯基合成反應而結合在一起，該過程可簡單地如下所示 酯基在生物體中可以通過生物降解的方式除去，而釋放出活性成分。
在本發明的藥物結合物中可使用合適的藥物分子構成其中的藥物部分，其包括氨基酸、蛋白質、酶、核苷、糖類、有機酸、甙類、黃酮類、醌類、萜類、苯丙素酚類、甾體及其甙類、生物堿等。
上述的可以與本發明的聚乙二醇(PEG)-脂肪酸衍生物結合的蛋白質選自促白細胞生成素(GCSF)，促紅細胞生成素(EPO)、白介素(IL)、干擾素、水蛭素、抗體中的一種。
在本發明的藥物結合物中，藥物分子部分優選是由天然植物中分離的藥物活性成分，如華蟾酥毒基、甘草次酸、和東莨菪內酯。該藥物分子部分特別優選于治療腫瘤的天然藥物，例如紫杉醇、喜樹堿、依托泊苷以及它們的衍生物等。
本發明的藥物結合物可以純化合物形式或適宜的藥物組合劑型式進行給藥，可采用任何可接受的給藥方式進行。組合劑形包含常規藥用載體或賦形劑和作為活性成分(一種或多種)的本發明的結合物，此外，還可包含其它藥劑、載體、輔劑等。
通常，根據所需給藥方式，藥學上可接受的組合劑型將包含約1至約99重量％的本發明藥物結合物、以及99至1重量％的適宜的藥用賦形劑。優選組合物包含約5至75重量％的本發明藥物結合物，其余為適宜的藥用賦形劑。
優選的給藥途徑是注射給藥，采用常規日劑量方案，該方案可根據疾病的嚴重程度進行調整。本發明的結合物或其藥學上可接受的鹽也可配制成注射用劑，例如使用約0.5至約50％的活性成分分散于可采用液體形式給藥的藥用輔劑中，實例為水、鹽水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，從而形成溶液劑或混懸劑。
如果需要的話，本發明的藥物組合劑型還可包含少量的輔助物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、抗氧化劑等，例如檸檬酸、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等。
該類劑型的實際制備方法是本領域的技術人員公知的或者顯而易見的，例如可參見Remington的“制藥學”(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，(MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。無論如何，按照本發明的技術，所使用的組合物劑型將含有治療有效量的本發明結合物，以用于治療相應的疾病。
實施例下面結合實例描述本發明的聚乙二醇-脂肪酸衍生物，其藥物結合物及其制備方法，它不限制本發明，本發明的范圍由權利要求限定。
實施例1甲氧基聚乙二醇己酸的制備
10克甲氧基聚乙二醇(分子量為10000)溶解在100毫升甲苯中，加熱蒸出70毫升，溶液冷卻到35℃加入30毫升無水四氫呋喃，加入0.1克氫化鈉，攪拌30分鐘。在溶液中添加1克6-溴己腈，35℃過夜攪拌。減壓濃縮溶液，加入100毫升異丙醇。過濾收集沉淀真空干燥，產率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇-己腈(mPEG-O-CH2CH2O-CH2CH2CH2CH2CH2CN，分子量為10000，由上步制得)溶解在50毫升37％的濃鹽酸中，室溫下攪拌三天，加入150毫升8％的氯化鈉溶液稀釋，用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮。中間產物溶解在50毫升10％的氫氧化鉀溶液中，室溫下攪拌一天，用鹽酸調pH＝2.6，再加入8克氯化鈉。用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥。真空濃縮，加入100毫升異丙醇沉淀。過濾收集沉淀真空干燥，產率6.5克(72％)。
實施例2甲氧基聚乙二醇庚酸的制備
10克甲氧基聚乙二醇(分子量為10000)溶解在100毫升甲苯中，加熱蒸出70毫升，溶液冷卻到35℃加入30毫升無水四氫呋喃，加入0.1克氫化鈉，攪拌30分鐘。在溶液中添加1克6-溴庚腈，35℃過夜攪拌。減壓濃縮溶液，加入100毫升異丙醇。過濾收集沉淀真空干燥，產率9.5克(95％)。
9克甲氧基聚乙二醇-庚腈(分子量為10000，mPEG-O-CH2CH2O-CH2CH2CH2CH2CH2CN，由上步制得)溶解在50毫升37％的濃鹽酸中，室溫下攪拌三天，加入150毫升8％的氯化鈉溶液稀釋，用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，真空濃縮。中間產物溶解在50毫升10％的氫氧化鉀溶液中，室溫下攪拌一天，用鹽酸調pH＝2.6，再加入8克氯化鈉。用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥。真空濃縮，加入100毫升異丙醇沉淀。過濾收集沉淀真空干燥，產率6.1克(68％)。
實施例3聚乙二醇二庚酸的制備
10克聚乙二醇(分子量為10000)溶解在100毫升甲苯中，加熱蒸出70毫升，溶液冷卻到35℃加入30毫升無水四氫呋喃，加入0.2克氫化鈉，攪拌30分鐘。在溶液中添加2克6-溴庚腈，35℃過夜攪拌。減壓濃縮溶液，加入100毫升異丙醇。過濾收集沉淀真空干燥，產率9.5克(95％)。
9克聚乙二醇-二庚腈(分子量為10000，由上步制得)溶解在50毫升37％的濃鹽酸中，室溫下攪拌三天，加入150毫升8％的氯化鈉溶液稀釋，用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥。真空濃縮。中間產物溶解在60毫升10％的氫氧化鉀溶液中，室溫下攪拌一天，用鹽酸調pH＝2.6，再加入8克氯化鈉。用二氯甲烷萃取三次。合并有機相，用無水硫酸鈉干燥。真空濃縮，加入100毫升異丙醇沉淀。過濾收集沉淀真空干燥，產率6.3克(70％)。
實施例4甲氧基聚乙二醇庚酸N-羥基丁二酰亞胺酯的制備 1克甲氧基聚乙二醇庚酸(分子量為10000，由實施例2制備)溶解在200毫升無水二氯甲烷中，加入14.7毫克N-羥基丁二酰亞胺和23毫克DCC，35℃過夜攪拌。減壓濃縮溶液，加入20毫升異丙醇。過濾收集沉淀真空干燥，產率0.9克(90％)。
實施例5甲氧基聚乙二醇庚酸和紫杉醇結合物的制備
mPEG-O-CH2CH2-OCH2CH2CH2CH2CH2COOH 紫杉醇 其中，Paclitaxel紫杉醇0.6克甲氧基聚乙二醇庚酸(分子量為10000，由實施例2制備)，溶解在10毫升二氯甲烷中，溶液中滴加60毫克紫杉醇、8毫克DMAP和18毫克DCC，溶液攪拌6小時。減壓蒸餾除去溶劑。剩余物加入20毫升異丙醇(IPA)。過濾收集沉淀再用乙醚洗滌后抽干，真空干燥。產率0.54克(90％)。
實施例6甲氧基聚乙二醇庚酸N-羥基丁二酰亞胺酯和促白細胞生成素(GCSF)結合物的制備6毫克甲氧基聚乙二醇庚酸N-羥基丁二酰亞胺酯(分子量為10000，由實施例4制備)，溶解在5毫升(pH7.4)的PBS緩沖鹽溶液中，其中含有1毫克/毫升促白細胞生成素。該反應體系中聚乙二醇和促白細胞生成素(GCSF)的比例為3∶1，在4℃震搖一小時然后在室溫震搖8小時。在稀釋到促白細胞生成素的濃度為0.5mg/ml，通過離子交換樹脂純化，收集單取代、雙取代的成分。SDS-PAGE顯示其中沒有游離的促白細胞生成素。
實施例7本實施例說明代表性非胃腸道給藥的藥物組合劑型的制備過程，所述藥物組合劑型為實施例5的本發明結合物。
成分實施例5的藥物結合物 2g0.9％鹽水溶液 至100mL將本發明的藥物結合物溶解于0.9％鹽水溶液，得到100mL的靜脈注射用溶液，將其通過0.2μ的膜過濾材料過濾，在無菌條件下包裝。
權利要求
1.如下通式的化合物 或B′-(CH2)l-O-PEG-O-(CH2)l-B(II)其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4-18的整數；并且A為C1-12的烷氧基、環烷氧基或烷氧芳基，或一個酯基；B和B’相同或不同，分別為選自羧基、酯基、酰氯、酰肼、馬來酰亞胺和吡啶并二硫化物之一的官能團。
2.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(I)的化合物，并且，所述的A是甲氧基、乙氧基、異丙氧基、環丁氧基、環己氧基或芐氧基。
3.如權利要求2所述的化合物，其中，所述的A為甲氧基，B為羧基。
4.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(I)的化合物，并且，A為選自N-羥基琥珀酰胺酯或1-羥基苯并三唑酯的酯基，B不同與A。
5.如權利要求1所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(II)的化合物，所述的B和B’相同。
6.如權利要求5所述的化合物，其中，所述的化合物是通式(II)的化合物，所述的B和B’都為羧基。
7.如權利要求1所述的化合物，其中，聚乙二醇的分子量為150～60,000，并且，所述的聚乙二醇可是直鏈、支鏈、星形或者樹形結構。
8.如權利要求1所述的化合物，其中，l等于5或6。
9.一種制備權利要求3所述的化合物的方法，該方法包括采用PEG和溴代氰化物反應，然后水解氰基得到相應的酸性基團的步驟。
10.如權利要求1-8之一的化合物與藥物按如下所示結構式的藥物結合物 或 其中X與X’相同或不同，為O、NH或S；Drug為藥物分子。
11.權利要求10所述的藥物結合物，其中，所述的藥物分子選自于以下類別中的一種蛋白質、酶、多肽、核苷、糖類、有機酸、甙類、黃酮類、醌類、萜類、苯丙素酚類、甾體及其甙類、生物堿、心血管藥、抗腫瘤藥、抗傳染藥、抗真菌藥、抗焦慮藥、胃腸藥、中樞神經系統用藥、止疼藥、促孕藥、避孕藥、類脂。
12.權利要求11所述的藥物結合物，其中，所述的蛋白質選自促白細胞生成素，促紅細胞生成素、白介素、干擾素、水蛭素、抗體中的一種。
13.權利要求11所述的藥物結合物，其中，所述的抗腫瘤藥選自紫杉醇、喜樹堿、依托泊苷以及它們的衍生物。
全文摘要
本發明涉及一種對水解穩定的如下通式(I)或(II)的通過醚鍵連接的聚乙二醇－脂肪酸衍生物，其中，PEG是聚乙二醇聚合物；l是4－18的整數；并且，A為C
文檔編號C08G65/00GK1511861SQ0215876
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月26日 優先權日2002年12月26日
發明者嵇世山, 朱德權 申請人:北京鍵凱科技有限公司