脂肪酸和衍生物的生產的制作方法
【專利說明】脂肪酸和衍生物的生產 發明領域
[0001] 本發明涉及通過生物技術方式的脂肪酸生產。具體地，本發明涉及從可再生資源 的具有多于5個碳原子的脂肪酸的生物技術生產。
【背景技術】
[0002] 脂肪酸和/或甘油三酯在多種工業中具有各種用途。在食品工業中，例如，脂肪酸 和/或脂肪三酯可以用于動物飼料以及用于補充營養。脂肪酸和/或甘油三酯也可以用于 化妝品和藥學領域中。這些應用可需要游離脂肪酸或甘油三酯。這些脂肪酸和/或甘油三 酯的天然資源相當有限。
[0003] 例如，各種多不飽和脂肪酸（PUFA)和含PUFA的甘油三酯主要得自于微生物，例 如被孢霉（ifortiereWa)和裂殖壺菌或產油植物，例如大豆或油菜，藻 類，例如隱甲藻（Ctjt? Mecoi/ifliiMDr)、褐指藻?χ/ω?)等，其中它們通常以其甘 油三酯的形式獲得。游離PUFA通常通過水解從甘油三酯制備。然而，長鏈多不飽和脂肪酸 不能從天然油料作物植物有效地分離。
[0004] 傳統上，工業規模生產的脂肪酸和/或甘油三酯起始于石油化學品衍生的材料。 這通常起始于對環境有害的汽油或石油的裂化。此外，由于這些起始材料的價格將與石油 的價格關聯，且預期石油價格在未來提高，脂肪酸和/或甘油三酯的價格也會相對于石油 價格的提尚而提尚。
[0005] 因此，期望找到不同于以純石油為基礎的更為可持續的新材料，作為用于脂肪酸 和/或甘油三酯生產的起始材料，其對環境產生的破壞也更少。
[0006] 過去已經描述了朝向脂肪酸生產的一系列生物技術途徑。然而，由于產率低、純度 不足以及需要多步純化程序，它們都不適合用于從可再生能源商業大規模地生產脂肪酸。 具體地，供給至生物技術上有用的生物體的碳底物實際上只有小部分被轉化成所需的產 品，而大部分被初級代謝反應消耗。
[0007] 與生物技術途徑相關的另一個問題是獲得產品的混合物并且因此組成難以控制 的事實。更具體地，雖然可生產一系列的脂肪酸，但單一加合物的生產會是理想的。由于混 合物包含在化學結構方面高度相關的化合物，以有效且直接的方式純化或至少富集單一組 分通常超出技術可行性的范圍。
[0008] 因此，本領域需要從可再生能源生產脂肪酸的更有效的方式。

【發明內容】

[0009] 根據本發明的任何方面的方法嘗試解決上述問題。具體地，根據本發明的任 何方面的方法可以能夠使用至少一種遺傳修飾的氫氧化細菌（hydrogen oxidising bacteria)，以通過首先將碳源轉化成酰基CoA，并且隨后將酰基CoA轉化成丙二酰CoA，并 且隨后最后將丙二酰CoA轉化成至少一種具有多于5個碳原子的脂肪酸的方式，將碳源轉 化成至少一種脂肪酸和/或其衍生物。根據本發明的任何方面的方法允許在不存在富含能 量的有機化合物的情況下，生產脂肪酸及其衍生物。此外，根據本發明的任何方面的方法提 供朝向脂肪酸及其衍生物的生產的有效生物技術途徑。在根據本發明的任何方面的方法 中，所得的脂肪酸及其衍生物中的更多的碳原子源自于二氧化碳分子，即與本領域中已知 的其他方法相比，使用根據本發明的任何方面的方法，源自二氧化碳而不是源自任何其他 有機分子（例如醇類或碳水化合物）的碳原子的比例更高。
[0010] 根據本發明的一個方面，提供了從包含氏、〇)2和/或0 2的氣體生產至少一種脂肪 酸和/或其衍生物的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供在含水培養基中的遺傳修飾的氫氧化細菌；和 (b) 使所述含水培養基接觸以20-70 :10-45 :5-35的重量比包含氏、0)2和/或02的氣 體； 其中，所述脂肪酸包含至少5個碳原子，并且 其中，所述氫氧化細菌相對于野生型細菌是遺傳修飾的，以提高酶表達并提高酶 E2的表達，所述酶E i能夠催化乙酰CoA經丙二酰CoA至酰基ACP的轉化，所述酶E 2能夠催 化酰基ACP至脂肪酸的轉化。
[0011] 根據本發明的任何方面的遺傳修飾的氫氧化細菌是指可經過工程化以產生各種 脂肪酸及其衍生物的重組氫氧化細菌，所述脂肪酸衍生物包括但不限于短鏈醇類，例如乙 醇、丙醇、異丙醇和丁醇，脂肪醇、脂肪酯、烴類和蠟酯等。
[0012] 在一個實施例中，本公開提供了修飾氫氧化細菌，從而使其生產并且任選地釋放 從可再生碳源生成的脂肪酸和/或其衍生物的方法。此類氫氧化細菌是遺傳工程化的，例 如，通過引入編碼一種或多種蛋白的外源DNA序列，所述蛋白能夠代謝可再生碳源，以生產 并且在一些實例中分泌脂肪酸衍生物。隨后，所述經修飾的氫氧化細菌能夠用于發酵過程， 以使用可再生碳源（生物質）作為起始材料生產有用的脂肪酸和/或其衍生物。在一些實 例中，因為易于對其途徑進行工程化以控制生長、生產以及減少或消除降低生物合成途徑 效率的副反應，所以使用現有的在遺傳上易控制的氫氧化細菌。此外，此類修飾的氫氧化細 菌可用于消耗可再生碳源以產生燃料，所述燃料能夠直接作為生物燃料使用，而無需用于 貯存或運輸的專門方法。在其他實例中，對天然產生烴類的微生物進行工程化，以通過表達 提高脂肪酸生產的外源核酸序列而過量產生烴類。
[0013] 根據本發明的任何方面的方法可用于生產具有限定的碳鏈長度、分支和飽和水平 的脂肪酸和/或其衍生物。在具體實例中，同質產品的生產降低了與發酵和分離相關的整 體成本。具體地，所述脂肪酸包含至少5個碳原子。例如，所述脂肪酸可以是飽和或不飽和 的。所述脂肪酸可包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 個碳原子。在一 些實例中，所述脂肪酸包含多于20個碳原子。更具體地，所述脂肪酸和/或其衍生物可包 含長度為至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個碳的碳鏈。在一些實例 中，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的制成的脂肪酸和/或衍生物產品的包含長度 為至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34個碳的碳鏈。在另外其他的實例 中，至少60%、70%、80%、85%、90%或95%的脂肪酸和/或衍生物產品包含1、2、3、4或5個不 飽和點。具體地，根據本發明的任何方面的方法可導致脂肪酸的組合的生產。更具體地，結 果可包含生產至少2、3、4、5或6種脂肪酸的組合。
[0014] 根據本發明的任何方面，用于步驟（b)中的碳源可以是任何可再生的碳源。具體 地，所述碳源可包含H2、〇)2和/或0 2。更具體地，所述碳源包含氧氣，允許在有氧的條件下 生產脂肪酸。
[0015] 氫氣在引入步驟（b)中的Η2、〇)2和02氣體中的分壓可以是0· 1-100巴、0.2-10 巴，特別是0.5-4巴。二氧化碳在引入步驟（b)中的含氏、〇)2和0 2氣體中的分壓可以是 0. 03-100巴，特別是0. 05-1巴，更特別是0. 05-0. 3巴。氧在引入步驟（b)中的H2、0)2和 〇2氣體中的分壓可以是〇. 001-100巴，特別是〇. 04-1巴，更特別是0. 04-0. 5巴。具體地， 步驟（b)中的氏和/或C02的來源可以是合成氣。所述合成氣可以與氧組合使用，成為引 入步驟（b)中的氏、〇) 2和02氣體的來源。更具體地，根據本發明的任何方面，引入步驟（b) 中的H2、0) 2和0 2氣體可包含合成氣。
[0016] 例如，合成氣可以從煤氣化的副產物提供。因此，氫氧化細菌將作為廢產品的物質 轉化成有價值的原材料。
[0017] 可選地，可以通過廣泛可得的低成本農業原料的氣化提供合成氣，用于根據本發 明的任何方面的方法。由多種能夠轉化成合成氣的原材料的實例，幾乎所有形式的植物都 可以用于此目的。原材料的實例為多年生草例如芒草，玉米殘渣，加工廢物例如鋸末。通常， 主要經過熱解、部分氧化和/或蒸汽重整，可以在干燥生物質的氣化設備中獲得合成氣，且 主要產品為例如氏、〇) 2和02。通常對部分的產品氣體進行加工以優化產品產率并且避免焦 油的形成。可以使用石灰和/或白云石進行對合成氣中不期望的焦油和C0的裂化。這些 方法詳細描述于Reed, TB, 1981中。也可使用不同來源的混合物，用于合成氣的生成。
[0018] 具體地，步驟（b)中的合成氣中含有的碳包含氫氧化細菌在方法步驟（b)中可得 的所有碳源的至少50重量％或至少70重量％、90重量％的碳，其中煤物質的重量百分比涉 及碳原子。除了來自合成氣的C0 2之外的其他碳源可以是氫氧化細菌可得的，例如以含水 培養基中碳水化合物的形式。
[0019] 更多的0)2源，例如煙道氣、石油煉廠氣、酵母發酵或梭菌發酵的產物，來自含纖維 素材料的氣化或煤氣化的廢氣等，可作為〇) 2源用于引入步驟（b)的h2、〇)2和02氣體中。
[0020] 具體地，引入步驟（b)的氣體以分別為20-70 :10-45 :5-35的重量比包含H2、C02 和/或02。氏和0 2的比例可根據來源而改變。例如，Η 2與0 2的重量比可以是2:1、4:1、5:1 等。
[0021] 術語"氫氧化細菌"可以與術語"氫氧混合氣細菌（knallgas bacterium)"互 換使用，并且是指能夠氧化氫，使用氧作為終末電子受體，并且能夠在有氧條件下固定二 氧化碳的任何細菌。具體地，氫氧混合氣細菌可以選自甲烷桿菌（ifeiAMoAacieriy?)、 醋桿菌（JceioAacierii/a?)、脫硫弧菌（Zfesi/i/bKiArio)、脫硫單胞菌搬was)、 副球菌、無色桿菌（JcArcwoAacter)、產喊菌、假單胞菌 、諾卡氏菌（Abcart/ia)和貪銅菌（Cy/iria Kiofe)。更具體地，氫氧混合 氣細菌可以是貪銅菌菌株，甚至更具體地是鉤蟲貪銅菌H16 flecaior H16)。示例性的氫氧混合氣細菌可包括但不限于：敏捷食酸菌/aciJis)， 食酸菌屬種（Jcii/orarax 6·/λ )，真養產堿菌（WcaJi供ei/iTOjOAs)、產堿菌屬種 5/7.)、大豆慢生根瘤菌、慢生根瘤菌屬 種 6·/?.)、鉤蟲貪銅菌 DSM 仍￥ 於乃、 螺桿菌屬種（ZfeiioAac ier 5/7.)、氫桿菌屬種（辦ier 5/7.)、嗜熱氫桿菌 {Hydrogenobacter thermophilu^)、氧賽篆革觀舊{Hydrogenomonas eutrophd)、泛賽 氫單胞菌（辦、氫單胞菌屬種（辦57?·，）、易 捷氫單胞菌（辦、氫胞菌屬種（辦職）、海洋 氫弧菌（辦艦(菌株 MH-110)、氫弧菌屬種（辦 職）、氫氧微生物（(25〔滅^//^供/? 、氫嗜熱假單胞菌（/^^成，/?狀 如辦收)、氫假單胞菌rara)、假單胞菌屬種 (/^^成敵?/?狀57?·)、真養勞爾氏菌（7? A 仙iropAa)、勞爾氏菌屬種（7? A 57?.)、大豆根瘤菌 、根瘤菌屬種57?.)、不透明 紅球菌<9/哪狀)、紅球菌屬種職）、嗜酸紅假單胞菌 {Rhodopse