專利名稱：脂肪生成抑制因子的衍生物、其制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及脂肪生成抑制因子(AGIF)的新衍生物，其制備方法及其用途，它還涉及某些已知AGIF衍生物的用途。
AGIF是一種已顯示出能夠抑制原-脂細胞分化成脂細胞的蛋白質。該蛋白質有時亦稱為白細胞介素11(IL-11)，它已被人們從基質細胞系KM-102中分離出來，該細胞系是由人體骨髓中獲得的[序列識別號為NO.4，Kawashima等人，FEBSLet-ters，283(1991)199-202和Ohsumi等人，FEBSLetters，288(1991)13-16]。所分離出的蛋白質已經顯示出能夠抑制原脂細胞系H-1/A分化成脂細胞，所述細胞系H-1/A是由鼠骨髓獲得的。
在本發明的最早優選權日以后公開的PCTWO92/13955中描述在硫氧還蛋白和IL-11中缺失N-末端脯氨酸殘基的IL-11衍生物之間的一種融合蛋白，該文獻既沒有討論AGIF衍生物本身，也沒有討論該化合物的活性。
眾所周知所有造血細胞(即與血液形成有關的細胞)，如紅細胞、中性白細胞、單核細胞、嗜曙紅細胞、嗜堿細胞、血小板以及淋巴細胞均是通過分化(也叫造血)而由骨髓中的母細胞形成的。這些母細胞通常作為多能性干細胞為人們所知。人們已經知道多能性干細胞的造血及增殖受多種造血因子以及與骨髓基質細胞的細胞間相互作用的調節。這類造血因子的例子有菌落刺激因子，如粒細胞一巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)和粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)。正如Dexter和Spooncer在Ann.Rev.CellBiol.，3(1987)423-441中所述，造血通常發生在“造血微觀環境”中。
已經知道原脂細胞在造血微觀環境中具有支持作用，但當這些細胞分化成脂細胞時，該支持作用就會喪失[HiroakiKo-dama“SOSHIKIBAIYO(TissueCulture)”，12(1986)191-195]。這一點已通過鼠原脂細胞系PA6而獲得了證明。該細胞系能支持造血，但該支持作用隨著PA6細胞分化成脂細胞而下降(Kodama等人，J.Cell.Physiol.，118(1984)233-240]。
人們還知道將PA6細胞和鼠骨髓細胞，即多能性干細胞一起培養會導致形成胚細胞菌落、巨核細胞菌落和巨噬細胞菌落[HiroakiKodama，“JIKKENIGAKU(ExperimentalMedicine)”，5(1987)826-830]。由于人們已從人體骨髓細胞中分離出了AG-IF，故人們相信該蛋白質直接作用在骨髓原脂細胞上，從而抑制它們的分化，由此可以使該原脂細胞支持該多能性骨髓干細胞的造血。
實驗已進一步表明由骨髓中得到的這種原脂細胞系H-1/A產生了一種菌落刺激因子(CSF)，這是一種已知的造血因子。由該原脂細胞產生的CSF的數量隨這些細胞分化成脂細胞而下降[Nakamura等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，179(1985)283-287]。
因此，人們提出通過抑制原脂細胞分化成脂細胞，AGIF可以由該原脂細胞大量產生CSF，從而促進多能性干細胞的造血[Ohsumi等人，FEBSLetters，288(1991)13-16]。
干細胞造血的增加有效地導致了血液中細胞成分的產量的增加。因此，人們都希望脂細胞生成抑制因子在治療血細胞數量減少癥中將具有實用價值，而不管其出自何種理由。這種病癥的例子包括血細胞減少癥(即血液或其它組織中由任何疾病引起的細胞成分的降低)和貧血。此外，抑制細胞生成將導致脂細胞或脂肪細胞數量的下降，由此人們提出脂細胞生成抑制因子在治療象肥胖癥那樣的病癥方面將具有價值。
考慮到通過抑制原脂細胞分化成脂細胞而獲得的好處，人們需要進一步的這類脂細胞生成抑制因子。
因此，本發明的一個目的是提供一種脂細胞分化抑制因子。
尤其是，本發明的一個目的是提供具有成熟AGIF活性的多肽。
本發明提供了作為新化合物的人體多肽，它選自由缺失2-9個N-末端氨基酸的人體脂細胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
本發明還提供了一種藥物組合物，它可用于治療或預防血細胞減少癥，或用于治療或預防病態肥胖癥，該組合物包括有效量的抗血細胞減少癥或抗病態肥胖癥的化合物，同時混合以藥物可接受的載體或稀釋液，其中所述的抗血細胞減少癥或抗病態肥胖癥的化合物是一種人體多肽，它選自由缺失1-9個N-末端氨基酸的人體脂細胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
本發明還提供了在哺乳動物(可以是人)中治療或預防血細胞減少癥，或用于治療或預防病態肥胖癥的方法，該方法包括向所述的哺乳動物施用有效量的抗血細胞減少癥或抗病態肥胖癥的化合物，其中所述的抗血細胞減少癥可抗病態肥胖癥的化合物是一種人體多肽，它選自由缺失1-9個N末端氨基酸的人體脂細胞生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
本發明還提供了編碼這些多肽的核苷酸序列，含有這些核苷酸序列的載體和用這些核苷酸序列或載體轉化的宿主細胞，以及提供了制備這些多肽的方法，這些方案將在下文中作進一步描述。
必要時可參照附圖對本發明作進一步描述，其中

圖1表示對成熟AGIF用胰蛋白酶進行有限消化而獲得的Wertern印跡分析結果。
圖2表示用胰蛋白酶處理的COS-1細胞的培養物上清液的生物活性。
圖3代表含有編碼成熟AGIF的cDNA的質粒M13mp19(20-2)μ的制備過程圖(序別識別號為No.9，No.10，No13)。
圖4代表在M13mp19(20-2)μ的StuI限制性位點附近的堿基序列[序別識別號為NO.12，No13]。
圖5是含有AGIF△Pro的序列的表達質粒PMAL-C-20-2△Pro的圖[序列識別號NO.14，No.15]。
圖6表示包含在M13mp19(20-2)和M13mp19(20-2)△Pro中的DNA序列的比較[序列識別為NO.18，No.19]。
在圖1中，線1代表未處理的COS-1細胞的培養上清液，線2代表用胰蛋白酶處理的COS-1細胞的培養上清液，線3代表反應用胰蛋白酶抑制因子終止而后用胰蛋白酶進行處理的COS-1細胞的培養上清液。分子量大小標志表示在右側。
在圖2中，實心條
代表用陰性對照質粒(pCDL-SRα296)轉染的COS-1細胞的培養上清液，帶點條
代表將胰蛋白酶抑制因子加入到用pCDL-SRα轉染的COS-1細胞的培養上清液中的，陰影條
代表用pSR-α-20-2轉染的COS-1細胞的培養上清液，對角線條
代表將胰蛋白酶抑制因子加入用pSR-α-20-2轉染的COS-1細胞的培養上清液中的培養上清液。空白條
代表在用胰蛋白酶處理用pSRα-20-2轉染的COS-1細胞的培養上清液之后再加入胰蛋白酶抑制因子的培養上清液。
用百分比表示脂蛋白脂酶(LPL)活性，將通過加Dulbecco改性Eagle培養基(無試樣)得到的值作為100%活性。
本發明的多肽優選地選自由含有下列序列中的氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽[序列識別號為No.2]Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21-20-15-10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-515Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr101520Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu253035Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His4045Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala505560
Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg657075Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg808590Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95100105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120125130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135140145Gly Gly Ile Arg Ala ALa His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150155160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165170175Thr Arg Leu178
其等價物、突變體及變異體、其前體及其衍生物組成的組。
如上所述，本發明提供了AGIF衍生物，每一種衍生物均缺失成熟AGIF的N末端中的特定氨基酸。由上述序列可以看出本發明提供了含有由上述序列中氨基酸3-178、4-178、5-178、6-178、7-178、8-178、9-178和10-178組成的序列的AGIF衍生物，以及其等價物，突變體、衍生物、變異體及其前體。
因此，本發明的多肽(以其活性形式)由169-176個氨基酸殘基組成。當采用在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行測試時，本發明的多肽具有約22，000到23，000道爾頓的分子量。
如上所述，本發明提供了AGIF衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體。
功能上等價的衍生物和等價物用在本文是指本發明的任何一種AGIF衍生物，其中有一個或多個序列氨基酸已被修飾(或人為的或天然的)，這些修飾過的多肽至少仍保留了未修飾過的衍生物的生物活性的基本部分。下文將詳細描述本發明的多肽的生物活性。簡而言之，該生物活性包括下列中的一種或多種抑制脂細胞的脂蛋白脂酶活性的能力，用原脂細胞誘發產生菌落刺激因子的能力，用B細胞促進抗體形成的能力，促進巨核細胞菌落及血小板形成的能力以及降低造血干細胞的GO相的能力。
總而言之，可以理解的是任何一種給定蛋白質的活性將取決于該分子的某些保存區域，而其它區域與它們的特定序列幾乎沒有關系，并且實質上或完全多余。因此，本發明還包括在仍具有基本AGIF型活性的AGIF衍生物的序列上的任何一種變異體或突變體。這些變異體或突變體例如包括缺失、附加、插入、倒位、重復和類型取代(如通常將一種親水殘基取代成另一種，除了當該殘基是強親水的或疏水的)。通常，小變化對活性幾乎沒有影響，除非它們是該分子的本質部分，這些小變化可能是遺傳操作的付產物。這些小變化的例子包括如果需要產生額外的限制性位點。
應該明白可以以任何合適的形式對本發明的多肽的編碼序列進行修飾，只要對所產生的多肽的活性無付作用即可。可以進行點突變的其它變化，例如通過加入或缺失限制性位點而協助遺傳操作，或采用別的手段來改善或修飾該分子。
舉例來說，人們已經知道，在許多多肽中，半胱氨酸殘基可以被轉變成絲氨酸殘基，這不會使活性明顯喪失。這一點已經在白細胞介素2(IL-2)上得到證實，參見，Wang等人的Sci-ence224(1984)1431-1433。
本發明的AGIF衍生物的變異體包括天然發生的AGIF衍生物，它們具有缺失了2-9個N末端氨基酸的殘基原成熟AG-IF的序列，但它們在較大量的范圍內以需要的方式變化。等位變化和來自其它菌種但具有類似活性類型及具有相似序列的那些肽亦屬于該定義內。
本發明的AGIF衍生物的前體包括，如具有N-末端取代基的那些，以及融合蛋白。這些N-末端取代為優選地應選擇成在到達體內靶位點上之前或到達時可以裂解，降解或用其它方法除去。在施用前或施用后，這些取代基可以自發地在一切環境中分解或裂解，例如由于PH或離子濃度等條件的變化，它們也可以通過如酶的作用而被主動裂解。
適合的N-末端取代基包括前導序列和組，如酯，以及甲酰甲硫氨酸殘基的甲硫氨酸。
取代基如前異序列，以及融合蛋白通常是用來獲得AGIF衍生物的任何表達系統的付產物。這類前導序列或融合蛋白一般將在表達系統中裂解，但也可在體內，如在靶位點處裂解。這類序列在AGIF衍生物的活性方面沒有什么特殊的作用，但可以有利地參與該多肽的表達。
在本發明中，當采用前導序列時，適宜的做法是采用天然產生的前導序列，如上述序列中氨基酸-21-0所描述的(序列識別號為NO.2)但也可以采用任何適合的序列，特別是那些為給定的表達系統而特別制成的序列。
本發明的AGIF衍生物可以按需要以融合蛋白的形式制成，而且通常是將其作為該多肽表達的一種助劑。這種融合蛋白一般是在表達系統中裂解(或自發地或在加入如一種合適的酶之后)，從而導致產生了AGIF衍生物，融合伙伴的選擇不是本發明必需的，但卻依賴于表達系統的選擇。因此，為了在某種原核生物細胞，如下面將要舉例說明的大腸桿菌(E.Coli)中進行表達，合適的做法是采用麥芽糖結合蛋白，或其衍生物作為本發明的AGIF衍生物的融合伙伴。
優選的本發明的多肽如下列序列所示(序列識別號為No.7)
Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165Leu169
以及其等價物、突變體、變異體及其衍生物，以及其前體(定義如前)。
本發明還提供了編碼全部或部分本發明的AGIF衍生物的核苷酸序列。這種序列可以是DNA也可以是RNA，它們利用本領域的標準技術制成，例如通過下文給出的多肽序列的逆向操作;通過用磷酸三酯法進行化學合成(Hunkapiller等人，Nature310(1984)105-111);或通過利用酶逆轉酶，從由表達成熟AGIF的細胞制得的RNA模板合成cDNA，而后利用有義和無義鏈(用該cDNA序列制得)通過聚合酶鏈反應(PCR)進行cDNA選擇及放大。成熟AGFI的cDNA序列已指述于文獻[Kawashima等人，FEBSLetters283(1991)199-202]中。熟悉本領域的人均能將該公開的cDNA序列用于制備在聚合酶鏈反應中要用的寡核苷酸引物，從而獲得適用于本發明的序列。
應該明白由于遺傳密碼的退化，任何一種給定的逆相處理過的序列均不一定會與任何給定的由相同肽逆相處理得到的互補序列良好地雜交。這是一個在熟悉本領域的人的思考中很普遍的因素。任何一種給定的序列的退化其范圍經常大到使它很難合成那怕是很短的互補寡核苷酸序列，從而將其作為天然存在的寡核苷酸序列的探針。
密碼的退化情況是這樣的，舉例來說，通常氨基酸中可能有四個或四個以上可能的密碼子。因此，可以看出，對任何一種給定的肽來說，可能的編碼序列的數量會以該肽中殘基的數量指數形式增長。因此，應該明白，對于本發明的AGIF衍生物來說，可能的編碼序列的數量是極大的，而且幾乎不可能在這些序列之間進行選擇。但是，需要考慮的影響編碼序列選擇，如表達系統及該系統密碼子使用頻率的選擇的一些因素。再一個就是需要根據所用的表達系統使該序列的G+C含量平衡。
在構建核苷酸序列時密碼子的選擇可以有一定程度的隨意性，合適的密碼子可以通過標準方法來選擇，如Grantham等人在NucleieAcidsRes.9(1981)γ43-γ47中所述。例如需要考慮特定宿主中密碼子的使用頻率。
優選的編碼序列選自由下列序列中的核苷酸87-614到核苷酸108-614及其突變體、變異體和互補序列組成的組(序列識別號為NO.1)CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC CTGMet Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu-21-20-15GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC CCT GGG50Val Val Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly-10-51CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC98Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala51015GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG146Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala202530GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA194Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro3540GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC242Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala455055
ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG290Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val606570CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC338Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His758085GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACCVal Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr9095100CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG386Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg105110CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG434Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu115120125CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC482Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro130135140CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC530Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile145150155CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA578Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly160165170CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG CCCAAAGCCA624Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu175
CCACCGTCCT TCCAAAGCCA GATCTTATTT ATTTATTTAT TTCAGTACTG684GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCCGCC ATTATCTCCC CCTAGTTAGAGACAGTCCTT CCGTGAGGCC TGGGGGACAT CTGTGCCTTA TTTATACTTA744TTTATTTCAG GAGCAGGGGT GGGAGGCAGG TGGACTCCTG GGTCCCCGAG804GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC GGATTCTTGG GTCTCCAAGA AGTCTGTCCA864CAGACTTCTG CCCTGGCTCT TCCCCATCTA GGCCTGGGCA GGAACATATA924TTATTTATTT AAGCAATTAC TTTTCATGTT GGGGTGGGGA CGGAGGGGAA984AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACAGAGAACAGGGA ATTAAATGTG TCATACATAT C10441065及其突變體、變異體及互補序列組成的組。
因此，本發明包括下列核苷酸序列，它包括上述序列中的核苷酸87-614，90-614，93-614，96-614，99-614，102-614，105-614和108-614。
上面所用的術語“突變體”和“變異體”其涵義與在肽序列mutatismutandis中所用的相同。利用標準技術，例如位點特異性突變可以改變所選擇的編碼序列中的核苷酸。由Mark等人在P.N.A.S.81(1984)5662-5666中所述的這項技術涉及采用由編碼所述改變的合成寡核苷酸組成的引物。
應當明白，盡管肽序列的突變體或變異體始終會在編碼核苷酸序列反映出來，但反之則不一定為真。因此，有可能的是該核苷酸序列受到相當大的改變(例如如前所述在遺傳密碼的退化方面)，但決不影響肽序列。已經知道，真核生物的基因通常顯示了例如如干擾素基因所述的多型[Nishi等人J.Biochem.97(1985)153-159]。根據產生RNA的細胞類型，也可以存在多型。這類突變體及變異體屬于本發明的范圍。
本發明還提供了與前面所示序列(序列識別號為No.1)進行雜交的核苷酸序列，并且優選地這類序列應顯示出與上述序列具有50%以上，優選70%，最好80%同源。
優選地，本發明的核苷酸序列是DNA序列，這種序列可以單獨使用，如用作探針，但通常優選的是它們形成表達系統的一部分。因此，優選地，該DNA序列形成適用于表達系統的載體的一部分。
本發明所用的載體的一般性能并不是本發明所必需的，通常對于本領域的專業人員來說適合的載體、表達載體及構建載體是顯而易見的。
合適的表達載體可以以噬菌體或質粒為基礎，這兩種載體通常對宿主具有特異性，盡管經常可以將這些載體處理而用于其它宿主。其它合適的載體包括Cosmid和反轉錄病毒，以及任何其它的載體，它們可以也可以不對給定的系統具有特異性。控制序列，例如識別物、啟動子、操縱子、誘發物、終止子以及其它在調節或表達中必需的和/或有用的序列對于本領域的專業人員來說是顯而易見的，而且與天然的AGIF序列或所用的載體有關，或者由任何別的合適的源獲得。可以將該載體以任何合適的方式修飾或處理。
編碼本發明AGIF衍生物的特別優選的核苷酸序列如下所示(序列識別號為No.7)GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTCVal Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA48Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG96Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA144Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC192Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570
CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA240Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC288Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC336Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCGLeu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC384Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA432Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG480Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165CTG507Leu169
及其突變體、變異體及互補序列，例如如上文所定義的。
本發明還提供了制備前述多肽的方法，該方法包括制備一種表達載體，該載體含有編碼前面所述AGIF衍生物的DNA序列，用所述的載體轉染一種合適的宿主細胞，在能使所棕AGIF衍生物發生表達的條件下培養所述宿主細胞，任選地用一種能夠在特定位點裂解所表達的AGIF衍生物的酶處理該培養物，并由該培養物中分離出所表達的AGIF衍生物。該方法可以以工業規模制備所述的AGIF衍生物。達到高產量及高純度。
一般說來，有許多種方法可用來制備本發明的肽及核苷酸序列。
在一種方案中，可以以常規方式制備天然存在的肽，并將其消化從而從N-末端中除去希望數量的氨基酸。通過改變該核苷酸序列可以使這類消化過程更易進行，從而在所編碼的肽中提供一種位點，如熱-或冷-易變位點，例如，或一種可識別的殘基或序列，在那里化學裂解，或酶裂解可以進行。對于熟悉本領域的人來說適合的肽酶是已知的，而胰蛋白酶的使用是適宜的。
制備本發明的多肽的一種合適的方法是利用在文獻[Kawashima等人，FEBSLetters283(1991)199-202]中所述的方法制備編碼成熟AGIF的DNA。然后對該DNA進行技術處理，如體外誘變，從而獲得編碼所需多肽的DNA序列，所述的多肽與成熟AGIF等價但缺失2-9個N末端氨基酸殘基。然后，將所產生的序列直接表達，或可替換地與第二種DNA序列融合，由此在表達后即可獲得一種融合蛋白。然后以標準方式，如利用一種合適的酶，將該融合蛋白消化，從而獲得所需的多肽。用來與本發明的AGIF衍生物形成融合蛋白的配偶體包括，如任何一種在C末端處含有特異性酶的識別序列的多肽。一種合適的配偶體包括麥芽糖結合蛋白或其衍生物。在麥芽糖結合蛋白和本發明的AGIF衍生物形成融合蛋白后并且加入血液凝固因子Xa之后，該融合蛋白發生裂解，結果產生了所需的AG-IF衍生物。
可以將編碼本發明的AGIF衍生物的DNA導入一種合適的載體中，然后可以用這類載體轉化原核生物或真核生物的宿主細胞。利用構建載體及在宿主細胞中表達蛋白質領域內的標準技術，可將編碼AGIF衍生物的DNA表達在宿主細胞中。
適用于制備本發明的AGIF衍生物的培養物可以是任何活細胞培養物，它可以由原核生物表達系統變化到真核生物表達系統。
優選的原核生物宿主包括，如大腸桿菌及枯草桿菌。為了將所需的基因表達在這些宿主細胞中，應該用含有要表達的DNA序列的載體，如一種質粒載體來轉化宿主細胞。該載體通常含有一種復制子及調節序列，所述的復制子是一種復制源，它由與該宿主匹配的菌種產生。更為合適的是該載體含有對所轉化的細胞的表達特性或表型具有選擇性的序列。
載體和/或宿主細胞的選擇并不是本發明所必需的，如前所述，這種選擇取決于多種因素。通常我們發現當采用大腸桿菌作宿主細胞時，公眾可得到的K12菌株是適用的，而公眾可得到的質粒PBR322和PUC是適用的載體。
如前所述，當表達一種蛋白質，如本發明的AGIF衍生物時，常常必須或至少需要包括各種控制序列。當采用大腸桿菌作宿主細胞時，合適的啟動子包括色氨酸(trp)啟動子，乳糖(lac)啟動子，色氨酸-乳糖(tac)啟動子，脂蛋白(lpp)啟動子，來自噬菌體λP1啟動子，以及多肽鏈延伸因子Tu(tufB)啟動子。任何一種這類啟動子均可用來制備本發明的AGIF衍生物。
當采用枯草桿菌作宿主細胞時，通常我們優選采用公眾可得到的菌株207-25。適用于這類宿主細胞的載體是PTUB228，參見Ohmura等人，J.Biochem.95(1984)87-93。常常將枯草桿菌的λ-淀粉酶基因中的調節序列用作為該載體中的啟動子。如果需要在該細胞外進行表達，即如果將多肽分泌在該細胞之外，則可以采用標準技術將編碼α-淀粉酶的信號序列的DNA序列連接到該AGIF衍生物的編碼序列中。
可以用來表達本發明的多肽的真核生物細胞包括脊椎動物、昆蟲、酵母等的細胞。如前面所述，細胞的選擇不是本發明所必需的。但是，通常，由猴子產生的COS細胞[Gluzman，Cell23(1981)175-182]以及中國倉鼠卵細胞(CHO)的二氫葉酸還原酶缺失菌株[Urlaub和Chasin，P.N.A.S.USA，77(1980)4216-4220]最常用來在脊椎細胞中表達蛋白質。我們已經發現這些細胞特別適用于本發明的情況。
為了在脊椎動物細胞中進行表達，通常需要在該表達載體中包括標準的調節序列，例如位于要表達的基因的上游的啟動子序列，RNA裂解位點、聚腺苷化位點，轉錄終止序列等。如果有必要，該載體還可以具有復制源。這類表達載體的一個典型例子是pSV2dhfr，它具有SV40的早期啟動子(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1(1981)854-864)。
酵母細胞也被典型地用作為真核微生物宿主。酵母屬，如釀酒酵母是特別有用的表達宿主。人們已經知道了多種適用于在酶母細胞中表達蛋白質的載體。優選地，這類載體是包括調節序列。對于本發明，優選地選用醇脫氫酶基因的啟動子[Benntzen和Hall.J.BiolChem.257(1982)3018-3025]或酸性磷酸酶基因的啟動子[Miyanohara等人，P.N.A.S.USA，80(9183)1-5]。
在本發明的方法中，特別優選的是在COS細胞中表達多肽。含有要表達的DNA序列的載體典型地含有SV40復制源(它使該載體自動復制在COS細胞中)以及一種轉錄啟動子、一種轉錄終止信號和一個RNA裂解位點。這類序列在本領域內是標準的，對于熟悉本領域的人來說合適的序列應是明顯的。
通過本領域內的標準技術可以將該表達載體引入該宿主細胞中。因此，舉例來說，采用Luthman和Magnusson在NucleicAcidsRes.11(1983)1295-1308中所述的二乙基氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)法，Graham和VanderEd在Virology，52(1973)456-457中所述的磷酸鈣-DNA共沉析法，或Neumann等人在DMBO.J.，1(1982)841-845中所述的電穿刺或電穿孔法可以將表達載體引入COS細胞中。為了將表達載體引入CHO細胞中，從而使所轉化的細胞能穩定地產生AGIF衍生物，合適的技術包括與該表達載體一起共轉染一種載體，后者能表達用作G418抗性標志物的新基因，如pRSVneO[Sambrook等人，“MolecularCloning-Alaboratorymanual”，ColdSpringHarborLaboratory，NY(1989)]或pSV2-neo(Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1(1982)327-341]，而后選擇G418抗性菌落。
根據所選擇的宿主細胞，可以將所表達的AGIF衍生物保留在該細胞內，或分泌在該細胞之外而進入培養基中。培養基的選擇和培養條件不是本發明所必需的。但它們取決于所選用的宿主細胞。合適的培養基是本領域所熟知的，且對熟悉本領域的人來說是顯而易見的。在本發明中，通過我們發現當培養基是已按需要加入了血清成分，如胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基或Dulbecco改性Eagle培養基(DMEM)時，所需的多肽可以充分表達在COS細胞中。
采用多種已知的分離方法中的一種或其結合利用如該蛋白質的物理及化學特性，可以將本發明的多肽從該細胞或培養基中分離并提純出來。這些方法的特別例子包括通過普通蛋白質沉析劑進行進行處理、超濾、各種色譜，如分子篩色譜(凝膠過濾)，吸附色譜，離子交換色譜，親和色譜，以及高效液相色譜(HPLC)，滲析或這些方法中任意一種的結合，或其它方法。
生物活性本發明進一步提供了前面所述的AGIF衍生物作為藥物的用途。此外，本發明還提供了已知AGIF衍生物的藥物用途，該衍生物是缺失N-末端氨基酸的成熟AGIF。
因此，本發明還為人體多肽提供了藥物用途，該多肽選自由缺失1-9個N末端氨基酸的人體脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
更進一步地說，本發明為人體多肽提供了藥物用途，該多肽選自由含有下列序列(序列識別號為No.2)中氨基酸2-178到氨基酸10-178的多肽。
Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21-20-15-10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-515
Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr101520Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu253035Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His4045Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala505560Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg657075Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg808590Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95100105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120125130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135140145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150155160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165170175Thr Arg Leu178
及其等價物，突變體及變異體，其前體及其衍生物(定義如前)組成的組。
優選的用途前面所述用途的多肽具有下列序列之一序列識別號為NO.8Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1510Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala152025Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu303540Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly455055Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp606570Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala7580Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr859095Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100105110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115120125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130135140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155160165Leu169
或序列識別號為NO.6Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg1510Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu152025Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe303540Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu455055Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly606570Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg7580His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys859095Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100105110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala115120125Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala130135140Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala145150Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg155160165Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu170175
及其等價物，突變體和變異體，其前體及其衍生物(如前面所述)。
本發明的AGIF衍生物，特別是前面所舉例說明的那些衍生物具有多種活性。這些活性總結如下1、抑制脂細胞的脂蛋白脂酶活性。
2、利用原脂細胞誘發產生菌落刺激因子(CSF)。
3、利用B細胞促進抗體形成。
4、促進巨核細胞菌落的形成。
5、促進血小球的生成。
6、降低造血干細胞GO相的能力。
考慮到上述活性，本發明的AGIF衍生物作為治療試劑可能具有巨大價值。特別是，它們在治療血細胞減少癥，如血小板減少癥及白血球減少癥方面“在提高免疫系統的功能方面，在防止或減輕病態肥胖方面，在治療和診斷各種貧血癥，如再生障礙性貧血，及其它血液疾病方面以及在治療及診斷由病毒、細胞和寄生蟲引起的感染方面均可能具有價值。還可以推測使用本發明的AGIF衍生物可以允許在血液成分傳輸中保留。
用于本文時，“血細胞減少癥”應包括由任何疾病引起的血液或其它組織中細胞成分的減少，所述疾病如上毒素或輻射引起的血小板減少癥，頑固的各類血細胞減少癥，白血球減少癥，骨髓移植后的細胞減少癥或化療后由制癌試劑等引起的細胞減少癥，以及由偶爾發生在這些條件下的免疫疾病引起的細胞成分的減少。
本文中所用的“AGIF活性”包括在前面列出的1-6條中的一種或多種活性。
在后面的實例中將描述本發明的AGIF衍生物的活性，該衍生物是與成熟AGIF等價的多肽但其中缺失1-9個N末端氨基酸。
本發明的多肽是由體內天然存在的化合物產生的，因此它們具有較低的毒性。當對雄性成年鼠(鼠的體重約為20g)施用菌株DDY時以及在觀察5天后，本發明的多肽在劑量為500mg/kg體重，或更低時沒有表現出明顯的毒性。
在該活性方面，本發明的AGIF衍生物適合用作治療血細胞減少癥及病態肥胖癥的治療試劑，該AGIF衍生物是與成熟AGIF等價的但其中缺失1-9個N-末端氨基酸的多肽。
本發明的AGIF衍生物可以單獨使用也可以與其他治療藥物結合使用，該AGIF衍生物是與成熟AGIF等價但其中缺失1-9個N末端氨基酸的多肽。
當將本發明的AGIF衍生物用于治療病態肥胖癥時，可以單獨使用該組合物，也可以將其與其它合適的防肥胖藥物一起結合使用，該防肥胖藥物例如包括食欲抑制劑、腸胃外吸收抑制劑、消化酶抑制劑、新陳代謝加速荷爾蒙，脂合成抑制劑和胰島素分泌抑制劑。此外，還可以將該組合物與節食和/或鍛煉治療結合起來使用。在這種情況下，該組合物能提高用其它防肥胖藥物進行治療的活性或效果，以及提高用非藥物類防肥胖治療的效果。
當將本發明的AGIF衍生物用于治療血細胞減少癥時，則可以將該化合物制備成含有其它合適的造血因子或與該造血因子結合在一起使用，所述的造血因子的例子包括IL-1到IL-10，白血病抑制因子(LIF)，干細胞因子，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，巨核細胞菌落刺激因子(Meg-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)干擾素(IFN)以及促紅細胞生成素(EPO)。結合施用(以單獨組合物的形式或以結合組合物的形式)將會由于本發明的多肽而提高造血因子的活性。
本發明的多肽可以通過任何一種具有這類活性的化合物常用的途徑而給藥，并且可以與用于此目的的常規的添加劑或輔助劑一起配制成混合物。例如，口服給藥時，可以將它們制成片劑，膠囊、顆粒、粉末或糖漿;而非腸胃給藥時，則可以將它們制成注射液，靜脈滴注輸液或栓劑。
利用任何一種常用的手段，采用添加劑，如載體，粘結劑，崩解劑，潤滑劑，穩定劑和矯味劑可以制得這些藥物制劑。
當用于通過注射或靜脈內滴注輸入而給藥時，該藥物制劑應是腸胃外可接受的水溶液，即不含任何熱源的溶液的形式。利用任何一種常規手段同時考慮一些因素，如PH，等滲性及穩定性就可以制成這類溶液，而且這些屬于熟悉本領域的人員的知識范圍。
盡管所用劑量將隨患者的年齡、性別、體重、飲食、癥狀及感染程度，以及給藥周期及其它臨床作用因素而變化，但對于成年患者，合適的劑量是0.01-1000mg/kg體重·每天，可以一次給藥也可以分幾次給藥。對于腸胃外給藥，合適的日劑量在0.01-100mg/kg體重之間，可以通過皮下注射，肌肉內注射或靜脈內注射。
參照下列非限制性實施例，本發明將獲得進一步的描述，在這些例子中，實例A到D描述了多種確定本發明多肽的活性的方法，實例1到4描述了制備本發明多肽的方法。
在下列實例中，由美國細胞典型培養物保藏中心(ATCC)購買3T3-L1細胞，該細胞由鼠胚胎成纖維細胞形成并由Green和Kehinde描述于Cell，1(1974)113-116中。在下列實例中形成33T3-L1細胞培養物的參照物，在潮濕的含有10%(v/v)CO2和90%(v/v)空氣的氣體混合物中將這些細胞在37℃下培養。在培養基A中將這些細胞進行傳代培養。
培養基ADulbecco改性Eagle培養基(DMEM)，含有4.5g/l葡萄糖，(由Gibco制造);
10%(v/v)固定的胎牛血清(FBS)(由Hyclone制造);以及10mMN-2-羥乙基哌嗪-N′-乙烷磺酸(HEPES)(PH7.2，由Sigma制造)。
根據Rubin等人在J.Biol.Chem.，253(1978)7570-7578中所述的方法，將3T3-L1細胞誘導分化成脂細胞。
例A抑制3T3-L1細胞轉化成脂細胞通過將細胞懸浮于上述培養基A中培養3T3-L1細胞，其密度為1.0×104細胞/ml。將0.5ml這種培養基用移液管移入48孔多叢盤(由Costar制造)上的每只孔中，培養細胞直到它們達到融合狀態，即大約3天。然后用新鮮的培養基A替代該培養基，并將細胞再培養2天。結束時，將該培養基用等量的培養基B替代，培養基B是一種誘發脂肪生成分化的培養基。
培養基BDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
10mMHEMES(PH7.2);
3%(v/v)固定的FBS;
5μg/ml牛胰島素(由Sigma制造);
8μg/mld-生物素(由Sigma制造);
4μg/ml泛酸(由Sigma制造);
1.0μM地塞米松(由Sigma制造);
0.5mM異丁基甲基磺嘌呤(由Aldrich制造)。
在加入培養基B的同時將要測試的樣品物質加入孔中。每只孔中加入少量試樣，該量低于所用培養基B量的十分之一。
加入培養基B和試樣之后，將細胞進一步培養，每兩天用新鮮培養基B取代培養基B。在每次取代培養基時也加入新鮮的試樣。在第一次加入培養基B和試樣后4到7天，同等量的培養基C取代培養基，培養基C用于維持脂細胞。
培養基CDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
5%(v/v)固定的FBS;
10mMHEPES(PH7.2)以及100ng/ml牛胰島素。
將細胞在培養基C中培養2天，而后用5%(v/v)甲醛將其固定。根據Mitomo和Takayama在[“RINSHOKENSAKOZA(ClinicalTestingSeminar)”，Vol.12，“Pathology”(1982)，IshiyakuPublishing]中所述的方法，分別用紅色O油和蘇木精將富集在細胞中的脂質小滴及細胞核染色。特別是，在進行紅色O油染色時，首先將固定的細胞用蒸餾水沖洗，再用異丙醇在水中的60%溶液進行沖洗，而后，用0.3%紅色O油在60%異丙醇的溶液中將該細胞染色10分鐘。結束時，用該異丙醇溶液再次沖洗該細胞，并用蒸餾水沖洗。
對染色的細胞進行并顯微照相，并對染色細胞計數。對含有紅色脂肪粒的細胞以及含有染色核的細胞均進行計數。然后用下列式計算脂肪生成分化比率。
脂肪生成分化比率(%)＝100× (含有脂肪小滴的細胞數)/(具核的細胞數)例B抑制脂蛋白脂酶活性利用已知的方法可以測得試樣抑制脂蛋白脂酶(LPL)活性的能力。在下文中，制備該細胞并按照Beutler等人在J.Im-munol.，135(1985)3972-3977中所述的方法進行測試。簡而言之，按下列所述進行。
利用在前面例A中所述的方法，制備分化的3T3-L1脂細胞。但只采用培養基B，即在該階段不向分化細胞中加入試樣，在培養基B中生長后，用新鮮的培養基C取代該培養基，培養基C的組成如前面例A中所示。在該階段還加入要測試的試樣，其加入量約為培養基體積的八十分之一，將該細胞培養18小時(見圖2)。結束時，除去培養基并用PBS(-)緩沖液(沒有Mg2+和Ca2+的磷酸鹽緩沖液，由Nissui Seiyaku制造)沖洗該細胞兩次。然后向每只孔中加入300μl培養基D。
培養基DDMEM，含有4.5g/l葡萄糖;
5%(v/v)固定的FBS;
10mMHEMES(PH7.2);
100ng/ml牛胰島素;以及10U/ml肝素鈉(由NovoIndustries制造)。
將細胞培養1小時，而后收集100μl培養物上清液，并用來測量活性。每份試樣測定三次，通過將三次測量值平均得到最后的結果。
利用Nilsson-Ehle和Schoty在J.LipidRes.，17(1976)536-541中所述的方法測定脂蛋白酸酶活性。該方法概述如下。將100μl按前面所述制得的培養物上清液與等體積的具有下列成分的基質溶液混合。
13mM甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(51.8KBeq/微摩爾，由Amersham制造);
1.3mg/mlL-α-二硬脂酰卵磷酯(由Sigma制造);
20mg/ml牛血清白蛋白(由Sigma制造);
135mMTris-鹽酸(Tris-HCl，PH8.1，由Sigma制造);
16.5%(v/v)甘油;以及16.5%(v/v)固定的FBS。
通過用三油酸甘油脂(由Sigma制造)稀釋甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(370GBeq/mmol)(由Amersham制造)、而后用硅膠柱色譜法進行純化制得13mM甘油-三[9，10(n)-3H]油酸(51.8KBeq/μmol)。
將該混合物在37℃下反應120分鐘。結束時，通過加入1.05ml0.1M碳酸鉀-硼酸緩沖液(PH10.5)和3.25ml甲醇、氯仿與庚烷體積比為141∶125∶100的混合物使反應終止。劇烈攪拌后，將反應混合物以3000×g的速度離心15分鐘。而后用液體閃爍計數器測量水-甲醇層中的3H數。將1個單位脂蛋白脂酶活性定義為在1分鐘內產生1μmol脂肪的活性量。
例C血小板數量的增加在3.75ml含有0.1%(w/v)牛血清白蛋白的PBS(一)緩沖液中溶解按例3和例4所述制得的750μgAGIF△Pro。
購買7周齡的雄Sprague-Dawley鼠(NipponSLCCo.Ltd)，在用于本實驗前將其維持一周，并隨機分為兩組，每組5只鼠。其中一組用AGIF△Pro進行處理，另一組則作為對照組。在處理組中的鼠每公斤體重皮下接受100μgAGIF△Pro。根據各個鼠的體重調節AGIF△Pro溶液的濃度，從而使所施用的溶液的體積保持在1ml。對照組中的鼠僅施用1ml載體緩沖液。兩個組中的鼠每天處理一次，周期為5天，每次處理前對它們各自稱重。
在處理周期結束時，對血液取樣，并測定血小板數。在最后一次施用后24小時，用乙醚將鼠麻醉，并采用含有0.5ml3.8%檸檬酸三鈉·2H2O溶液的注射器通過心臟穿刺收集4.5ml血液。利用Coulter計數器(型號T5/40，由Coulter Electric Inc.制造)直接測定各種試樣中的血小板數，白細胞數及紅細胞數。其結果表示如下處理組血小板數＝1，123，000±66，500對照組血小板數＝893，000±23，700該數以每立方毫米試樣平均值±標準誤差給出。
利用Dunnett等人在Biometrics，September(1964)482-489中所述的多重比較方法，將由處理組及對照組獲得的數進行比較。由比較的結果可以確定處理組、即接受AGIF△Pro的組中的血小板數明顯大于對照組中的(可能低于5%)。
兩個組中鼠的紅細胞和白細胞數無明顯差別。此外，在試驗期間每個組中鼠的體重增加速度相似。
在正常鼠中，AGIF△Pro也顯示出能增加血小板數。
進一步地，在10天時間內向經過制癌劑Carboplatin處理的鼠施用200μg/kgAGIF△Pro將加快因用Carboplatin處理而引起的血小板減少癥的恢復。
例D采用在前面例C中所述的方法，對按照例2所述制得的AGIF衍生物、即缺失成熟蛋白質中的9個N-末端氨基酸的衍生物進行測試。該衍生物同樣顯示出增加血小板數的能力。
例1AGIF的表達(a)AGIF表達載體的構建按照Kawashima等人在FEBS Letters，283(1991)，199-202中所述的方法制備質粒pcD-20-2。根據該方法，由聚(A)+RNA(由基質細胞系KM-102分離得到)在表達載體pcD中制備cDNA庫。該基質細胞系KM-102是由人骨髓得到的。用對AGIF具有選擇性的寡核苷酸對該庫進行篩選，并選出合適的克隆。在對這些克隆作進一步試驗之后(如利用前面例A中所述的測試方法)，從能夠引導具有AGIF-型活性的蛋白在COS-1細胞(一種公共可得到的細胞系，來自猴細胞)中的表達的克隆中選擇出質粒，并記為pcD-20-2。利用本領域的標準技術由pcD-20-2克隆中提取出編碼AGIF的cDNA。采用Ohusmi等人在FEBS Letters，288(1991)13-16中所述的技術，將該cDNA引入高表達載體pcDL-SRα296(由Takebe等人描述于Mol.Cell.Biol.，8(1988)466-472中)中。將所產生的載體表示為pSR α-20-2，它引導該AGIF多肽在細胞(如COS-1細胞)中的高水平表達。
(b)AGIF在COS-1細胞中的表達將在上面步驟(a)中制得的質粒pSRα-20-2轉染到COS-1細胞中。利用由ShimadzuSeisakushoLtd.得到的基因導入單元GTE-1，通過電穿孔進行轉染。制備COS-1細胞，用于通過將該細胞生長于燒瓶中(細胞生長于含有10%胎牛血清的Dulbecco改性Eagle培養基中，3天，37℃下)，直到該培養物達到半融合狀態而進行轉染。通過用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA)進行處理由燒瓶中收集細胞，此后用磷酸鹽緩沖的鹽水(一)[PBS(一)](由Nissui Seiyaku制造)將收集起來的細胞沖洗兩次。而后將沖洗過的細胞懸浮于PBS(一)緩沖液中，濃度為1×108細胞/ml。制備質粒DNA(即按前面步驟(a)中所述制得的pSRα-20-2質粒)，用于通過按照氯化鈰法進行處理而轉染，此后通過加入PBS(一)緩沖液將含有處理過的質粒的溶液調到200μg/ml。
為了轉染，將20μl按前面所述制成的COS-1細胞懸浮液與20μl按前面所述制成的質粒溶液混合，然后將該混合物放在FCT-13電穿孔裝置(由Shimadzu Seisakusho Ltd.制造)的室中，該裝置中的電極距離為2mm。向該裝置施加兩批600V/50微秒脈沖，兩批脈沖間的間隔為1秒。然后將該電穿孔裝置的室中的混合物加至含有10%v/v胎牛血清的20ml Dulbecco改性Eagle培養基溶液中，而后將所產生的混合物轉移到Petri盤(直徑150mm)中。將它在含有5%CO2(體積)的空氣中培養過夜，同時保持溫度在37℃。結束時，通過抽吸除去培養物上清液，用無血清Dulbecco改性Eagle培養基沖洗細胞及Petri盤，然后向沖洗過的細胞中加入20ml Dulbecco改性Eagle培養基，在相同條件下將該細胞再培養3天。
在此過程結束時，從該培養物中除去培養物上清液，并用Western印跡分析法進行測試以證實AGIF(序列識別號為No.4)的存在。在該Western印跡分析中采用了抗體AGIFp15，其制備方法如Ohsumi等人在FEBSLetters288(1991)13-16中所述。
例2制備具有AGIF活性的多肽將0.5μg胰蛋白酶(由Sigma制備)加入到500μlCOS-1細胞培養物上清液中，該上清液含有按例1中(b)步驟制得的AGIF，并將所得到的混合物在37℃下培養20分鐘。在此過程結束時，將0.5μg利馬豆胰蛋白酶抑制因子(由Sigma制備)加入到該混合物中以使該胰蛋白酶失活，然后用Western印跡法分析該溶液，該Western印跡分析的結果示于圖1中。如圖1所示，成熟形式的AGIF經過在還原條件下進行十二烷基硫酸鈉聚丙烷酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定其表現分子量為23，000道爾頓。在用胰蛋白酶處理該成熟AGIF之后，經過在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析確認形成了分子量約為22，000道爾頓的多肽。利用密度計(CS-930，由ShimadzuSeisakushoLtd.制造)對由胰蛋白酶引起的成熟AGIF的消化過程進行分析，結果表明大約有60%的成熟形式的AGIF被胰蛋白酶消化成一種多肽，經過在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳確定該多肽的分子量大約為22，000道爾頓。
已經知道胰蛋白酶典型地具有基質特異性，即它能“識別”某些氨基酸。尤其是，胰蛋白酶僅切斷多肽中位于精氨酸或賴氨酸氨基酸的羧基側的肽鍵，因此，可以推測較低分子量的成熟AGIF衍生物是由于胰蛋白酶使位于精氨酸殘基(位于成熟AGIF的N-末端的位置9)和在該N-末端的位置10處的氨基酸殘基之間的鍵發生水解而產生的。
為了證實該理論，制備成熟AGIF的變異體，其中位于N-末端的位置9處的精氨酸殘基被取代成另一種氨基酸(但不是賴氨酸)，例如取代成天冬氨酸。利用一種體外誘變系統(由Amersham制造)制備該突變體。制成后，在與上述相同的條件下用胰蛋白酶處理該突變體，在用該酶進行處理之后，該多肽的分子量沒有減少，也就是說沒有消化，這證明該AGIF衍生物，即經過在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳確認具有大約22，000道爾頓分子量的多肽(由于用胰蛋白酶處理成熟的AGIF而形成)確實是由纈氨酸作為其N-末端氨基酸，即距離成熟形式的AGIF的N末端的第10個氨基酸。
在如上所述用胰蛋白酶處理通過用pSRα-20-2轉染COS-1細胞而獲得的培養物上清液之后，通過加入利馬豆胰蛋白酶抑制因子(由Sigma制備)至最終濃度為1μg/ml而使胰蛋白酶失活(如圖1中所示)，該溶液中含有約60%分子量約為22，000道爾頓的多肽(經過在還原條件下的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測定)。
利用前面例B中所述的技術測定該溶液抑制脂蛋白脂酶(LPL)的活性的能力。該測試結果示于圖2中。由這些測試結果，可以證實用胰蛋白酶處理過的蛋白質溶液其抑制LPL活性的能力與成熟AGIF的等同。除了該活性以外，還證實(用前面所述的技術)用胰蛋白酶處理過的蛋白質溶液能抑制鼠胚胎成纖維3T3-L細胞轉化成脂細胞，并且抑制鼠骨髓原脂細胞系H-1/A分化成脂細胞，這一點可以采用Nakamura等人在Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，179(1985)283-287中所述的方法證明。
采用分級分子量大約為10，000道爾頓的超濾膜(CentriconC-10，由Amicon制造)將如上所述制得的用胰蛋白酶處理過的蛋白質溶液分成兩部分，即一部分含有分子量低于10，000道爾頓的多肽(能滲透過膜的部分)以及另一部分含有分子量大于10，000道爾頓的多肽(不能滲透過膜的那部分)。對所獲得的兩部分進行測試，以確定它們抑制3T3-L1脂細胞中LPL活性的能力，這些測試的結果表明AGIF型活性僅存在于不滲透過膜的部分，即所含蛋白質的分子量大于10，000道爾頓的那部分。這說明AGIF型活性存在于分子量大約為22，000道爾頓的多肽中，該多肽是通過用胰蛋白酶處理成熟的AGIF而形成的，它還說明該活性不存在于含有通過胰蛋白酶處理從成熟AGIF的N-末端除去的9個氨基酸的肽中。
例3在大腸桿菌中表達具有AGIF活性的多肽下列實施例說明了與成熟AGIF相應但無N末端氨基酸的AGIF衍生物的制備及表達。
用限制性酶BamHI消化載體M13mp19RFlDNA(由Toy-obo制備)，該DNA是一種雙鏈DNA，而后用堿性磷酸酶處理消化過的DNA，從而除去末端磷酸根基團。
用限制性酶BamHⅠ和BglⅡ消化在前面例1中制得的質粒pSRα-20-2。該消化過程產生三個片段，從中分離出含有AGIF cDNA、大約750堿基對的片段并進行提純。然后用T4DNA接合酶將含有AGIF cDNA的片段與消化過的M13 mp19質粒連接起來。將所產生的DNA用來轉化大腸桿菌的DH5αF1菌株(由GIBCO/BRL Life Technologies Inc.購買)，從而制得重組噬菌體菌斑。從所產生的菌斑中隨意選出12個克隆，而后對每一個克隆，采用常規技術分離出單鏈DNA和雙鏈RF(復制形式)DNA，并將其提純，用限制性酶SmaⅠ消化由12個克隆中每一個得到的RFDNA，從中選出其SmaⅠ消化液中含有大約750堿基對，即含有AGIFcDNA的片段的克隆，將其記為M13mp19(20-2)。
采用體外誘變系統(由Amersham制造)，并按照制造商推薦的方式合成一種寡核苷酸，其DNA序列如下5′-CCAGATACAGCTGTCAGGCCTGGGCCACCACCT-3′(序列識號為No.13)。將該寡核苷酸退火成克隆M13mp19(20-2)(制備如前)的單鏈DNA，從而制得突變噬菌體克隆，記為M13mp19(20-2)μ(圖3)。這種方法可以將限制性酶StuⅠ的限制性位點(位點AGGCCT)引入到該DNA中，而且可以由該突變克隆的RFDNA制得編碼成熟AGIF的DNA。(序列識別號為NO.3)。該StuⅠ位點在成熟AGIF多肽的編碼序列的起始處導入。
利用T4DNA接合酶，將通過用限制性酶StuⅠ和HindⅢ消化大腸桿菌表達載體pMAL-C(由NewEngland Biolabs制備)而形成直鏈的DNA與含有通過用StuⅠ和HindⅢ消化M13mp19(20-2)μ(制備如前)的雙鏈RFDNA而制得的AGIFcDNA的片段連接在一起。選擇載體pMAL-C是因為它含有編碼麥芽糖結合蛋白(MBP)的結構基因(malE)(在該啟動子的下游)。用該DNA將大腸桿菌菌株TB1轉化以獲得氨芐青霉素抗性菌落，該菌落能夠在含有氨芐青霉素(100μg/ml)的L-瓊脂培養基中生長。
L瓊脂在蒸餾水中1%細菌用胰化胨;
0.5%酵母提取物;
1%NaCl;以及1.5%細菌用瓊脂。
從所產生的菌落中隨機選出12種菌落，并從中選出經限制性酶排序證明含有AGIFcDNA的質粒克隆，將其記為pMAL-C-20-2μ(圖5)(序列識別號為No.14，No.15)。
而后，合成兩種互補的寡核苷酸。這些寡核苷酸由編碼成熟AGIF的核苷酸序列(其中不包括編碼成熟AGIF的N-末端脯氨酸殘基的三個堿基)以及編碼由血液凝集因子Xa識別的一種氨基酸序列的核苷酸序列組成。然后將這些寡核苷酸退火，從而制得一種接頭DNA，該DNA的一端具有BamHI限制性位點而另一端則具有XhoI限制性位點(圖5)。將該合成DNA接頭與載體DNA連接，該載體DNA通過用BamHI和XhoI消化質粒pMAL-C-20-2μ(制備如前所述)而獲得。將所得到的載體用來轉化大腸桿菌的TB1菌株。從所產生的氨芐青霉素抗性菌落中選出含有靶接頭的克隆，并將包含在該選出的克隆中的質粒命名為pMAL-C-20-2△Pro(圖5)。
將含有pMAL-C-20-2△Pro的TB1菌株接種到50ml培養基E中。
培養基E在蒸餾水中1%細菌用胰化胨;
0.5%酵母提取物;
0.5%NaCl，以及0.2%葡萄糖。
將接種了的培養基在30℃下培養過夜，同時攪拌。結束時，將10ml培養液接種到1升新鮮的培養基E中，并在30℃下再邊攪拌邊培養。當該培養液在600nm的吸收度達到0.5時，加入異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至終濃度為0.3mM，而后在30℃將該接種后的培養基培養過夜。
在該培養結束時，通過離心收集細菌并將其懸浮于50ml緩沖液A中。
緩沖液A在蒸餾水中10mMTris(羥甲基)氨甲烷-HCl;(Tris-HCl)0.2MNaCl;
1mM疊氮化鈉;
10mM2-疏基乙醇;
1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，PH7.4。
對所得到的是浮液進行2分鐘超聲處理，使細菌破碎，而后以9000×g、在4℃下離心30鐘而將破碎細菌分離，收集上清液并用4倍體積的緩沖液A將其稀釋，而后用孔徑為0.22μm的MilexGV過濾器(由millipore制造)將稀釋的上清液過濾，收集過濾后的溶并將其加到柱床體積為10ml的直鏈淀粉樹脂柱中，用大約80ml的緩沖液A沖洗該柱。用含有10mM麥芽糖的緩沖液A從該柱將融合蛋白洗脫，該蛋白由麥芽糖結合蛋白和缺失N-末端脯氨酸的AGIF(AGIF△Pro)組成，大約回收到2μl峰值餾分。
向20μl原始餾分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(含有約90μg蛋白質)(制備如前述)中加入1個單位(1μg)的血液凝位因子Xa，將該混合物放置使之在室溫下消化2-24小時，反應之后，直還原條件下用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。開始時，可以看到一條對應于分子量約為62，000道爾頓的多肽的帶以及另一條對應于分子量約為23，000道爾頓的多肽的帶，前者推論為是MBP-AGIF△Pro融合蛋白，后者則推論為是AGIF△Pro。在整個消化反應過程，62，000道爾頓帶的強度在下降，而23，000道爾頓帶的強度在上升，對23，000道爾頓帶的多肽進行West-ern印跡分析法結果表明該帶與AGIFp15抗體起反應。
將40單位(40μg)的血液凝集因子Xa加入到800μl原始餾分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(含有約3.6mg蛋白)(制備如前所述)中，將混合物在室溫下放置過夜。結束時，利用三氯乙酸(TCA)沉析處理，將反應混合物濃縮，此后在還原條件下，利用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳。電泳之后，將該蛋白質帶由聚丙烯酰胺凝膠上轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(商標名1mmobilon，由Millipore制備)上，此時采用一種在轉移緩沖液
中的凝膠膜轉移裝置[KS-8441，由Marisol制造)，在4℃下以0.8mA/cm2進行15小時。轉移之后，一邊攪拌，一邊在含有25mM NaCl的10mM硼酸鈉緩沖液中將該膜沖洗5分鐘，然后在純化水中沖洗5分鐘。而后將其干燥。將已轉移了大約23，000道爾頓分子量帶的膜部分切割下來，利用氣相蛋白質序列分析儀(型號475A，由Applied Biosystems制造，測定由N-末端到第9個氨基酸殘基的序列。將由每個反應循環獲得的乙內酰苯硫脲(PTH)-氨基酸分離，并用逆相高效液相色譜(HPLC)進行識別(所用的色譜裝置是型號120A，由Applied Biosystems制造)。以該方式測定的氨基酸序列如下所示。
Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Xaa-Val-(其中Xaa代表末識別的氨基酸殘基，序列識別號為No.11)。
根據該結果，可以證實所分離的蛋白質是AGIF△Pro，其中缺失成熟AGIF的N-末端處的脯氨酸殘基。
在進行生物試驗之前，用血流凝集因子Xa在原始部分的MBP-AGIF△Pro融合蛋白(按前面所述方法制備)上進行消化反應。通過將原始試樣提純將由該消化過程形成的AGIF△Pro分離，所用的技術包括凝膠過濾柱色譜和CMToyopearlPack650M(由Tosoh制造)柱色譜的結合。當在還原條件下、利用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳時，試樣中的蛋白質遷移到大約23，000道爾頓分子量相當的位置。然后測定以這種方式制得的AGIF△Pro的生物活性，用Western印跡分析證實該蛋白質與抗體AGIFp15起反應，還證實以這種方式提純的蛋白質還具有抑制原脂細胞分化成鼠3T3-L1細胞中的脂細胞的能力。另外，出乎意外地該蛋白質還抑制已經分化成脂細胞的3T3-L1細胞的脂蛋白脂酶(LPL)活性。此外，這種脂蛋白脂酶(LPL)抑制的特異活性基本上等同于在PCT公開，WO92/08735中所述的已知成熟AGIF的活性。
例4在COS-1細胞中表達具有AGIF活性的多肽下列例子描述了與成熟AGIF相應但無N-末端氨基酸的AGIF衍生物的制備及表達。
按照與例3中所述的相似的方法，但采用具有下列序列的記號為Pro-DEL1的合成寡核苷酸序列(序列識別號為No.16)。
5′-GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC-3′和單鏈載體M13mp19(20-2-DNA(如例3中所述地制備)制備突變噬菌體克隆，記為M13mp19(20-2)△Pro。該方法可以將限制性酶ApaI的限制位點(位點GGGCCC)導入該DNA中，而且可以由該突變克隆的RFDNA制得編碼AGIF△Pro的DNA。ApaⅠ位點在該AGIF△Pro多肽的編碼序列的起始處引入。利用限制性排序從該突變克隆中選出存在于PRO-DEL1序列中的ApaⅠ位點，核苷酸序列分析結果表明該M13mp19(20-2)△Pro含有編碼AGIF△Pro，即無N-末端脯氨酸殘基的成熟AGIF的DNA(圖6)。
通過用限制性酶BalⅠ使質粒pSRα-20-2，成熟AGIF的一種COS-1細胞表達質粒(其制備如例1中所述)發生裂解，由此制得長度大約為4.5Kb但缺失190堿基對片段(包括成熟AGIF的N-末端區域)的線性載體DNA。類似地，用BalⅠ消化M13mp19(20-2)△Pro的雙鏈RFDNA(制備如前所述)。通過對該克隆載體進行BalⅠ消化而除去187堿基對片段，包括AGIF△Pro的N-末端區域，并將該片段連接到如前所述制成的線性載體中。將所得到的DNA導入大腸桿菌DH5α中，從中選出能夠生長在含有氨芐青霉素(濃率為100μg/ml)的L…瓊級板上的氨芐青霉素抗性菌落。隨機選擇20個克隆，從這20個克隆中提取出各自的質粒并進行提純。通過分析每種質粒DNA的ApaⅠ位點，選出含有該187堿基對BalⅠ片段(該片段以與AGIFcDNA相同的取向連接于質粒pSRα-20-2中)的克隆。結果獲得一種克隆，將包含在該克隆中的質粒記為pSRα-(20-2)△Pro。
按前面所述制得的pSRα-(20-2)△Pro是AGIF△Pro的一種表達質粒，利用與例1中所述的相似的技術將該質粒轉染到COS-1細胞中，制備AGIF△Pro并將它釋放到培養基中。用這種方式制備一升用pSRα-(20-2)△Pro轉染的COS-1細胞的無血清的培養上清液。在用20倍體積的滲析緩沖液(10mM硼酸-NaOH(PH9.0)以及13mMKC1)在4℃下將該培養上清液滲析15小時之后，用FastProteinLiquidChromatography(FPLC)系統(由Pharmacia制造)進行弱陽離子交換色譜。這譜條件如下柱CM-ToyopearlPack650M(2.2×20cm，由Tosoh制造)洗脫緩沖液溶液A10mM硼酸-NaOH(PH9.0)，13mMKCl溶液B含有300mMNaCl的溶液A流速3ml/分鐘餾分體積3ml/管濃度梯度線性濃度梯度，由100%溶液A到100%溶液B(50分鐘)。
利用已知的抗體AGIFp15通過Western印跡法識別由該色譜法獲得并含有AGIF△Pro的餾分。將由該方法證明含有絕大多數AGIF△Pro的二份連續餾分合并在一起，用三氯乙酸沉析法將其濃縮，并通過在還原條件下采用含有12.5%(w/v)丙烯酰胺的凝膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳對其進行分析。在電泳完成之后，將由該聚丙烯酰胺凝膠得到的蛋白帶吸引到聚偏二氟乙烯膜(ProBlott，由AppliedBiosystems制造)上，在4℃下以18v/cm進行2.5小時，利用在轉移緩沖液
中的凝膠膜吸引器(KS-8441，由Marisol制造)進行吸引。在攪拌的同時，先用含有25mMNaCl的10mM硼酸鈉緩沖液(PH8.0)將吸引過的膜沖洗5分鐘，再用蒸餾水沖洗5分鐘，而后將膜用空氣干燥，然后從該膜中切出已轉移了AGIF△Pro的膜部分(即與大約23，000道爾頓的分子量相當的部分)，采用氣相蛋白質序列分析儀(型號475A，由AppliedBiosytams制造)測定該蛋白質的6個N-末端氨基酸的序列。
將在該蛋白質序列分析儀的反應循環中獲得的乙內酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸)分離，并通過采用型號120A系統(由AppliedBiosysytems制造)進行逆相高效液相色譜(HPLC)將其識別。由該方法確定的氨基酸序列如下所示Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-(序列識別號為No.17)該序列與成熟AGIF中氨基酸2-7的序列相同。由此可以證實所分離出的蛋白質是缺失N-末端脯氨酸殘基的成熟AGIF。
采用類似于Ohsumi等人在FEBSLetters288(1991)13-16中所述的成熟AGIF提純方法，從用pSRα-(20-2)△Pro轉染的COS-1細胞的無血清條件培養基中純化AGIF△Pro。對以該方式制得的產物進行測試，結果證實該蛋白質能夠抑制在已分化成脂細胞的3T3-細胞中的脂蛋白脂酶的活性。在該測試中蛋白質的特異活性基本上與在PCT公開WO92/08735中所述的相同測試中的成熟AGIF的相同。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱SANKYOCOMPANY，LIMITED(B)街道2-58，HIROMACHI1-CHOME
(C)城市SHINAGAWA-KU，東京(E)國別日本(F)郵編140(G)電話03(3492)3131(H)電傳03(3492)3754(ⅱ)發明名稱脂肪生成抑制因子衍生物，其制備方法及其用途(ⅲ)序列號19(ⅳ)計算機閱讀形式(A)介質類型軟磁盤(B)計算機IBMPC兼容(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25(EPO)(ⅵ)優先申請日(A)申請號JP04/097567(B)申請日17-APR-1992(ⅵ)優先申請日(A)申請號JP05/014056(B)申請日29-JAN-1993(2)有關序列識別號為No.1(SEQIDNo.1)的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1065堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型
(ⅱ)分子類型cDNA到mRNA(ⅲ)前提無(ⅲ)反義無(ⅸ)性能(A)名稱/鏈CDS(B)位置18..614(ⅸ)性能(A)名稱/鍵mat肽(B)位置18..614(ⅸ)性能(A)名稱/鍵Sig肽(B)位置18..80(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶1
(2)有關SEQIDNO∶2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度199氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶2
(2)有關SEQIDNO∶3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度534堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA到mRNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅸ)性能(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..534(D)其它信息(x)序列描述SEQIDNO∶3
(2)有關SEQIDNO∶4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度178氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶4
(2)有關SEQIDNO∶5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度531堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA到mRNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅸ)性能(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..531(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶5
(2)有關SEQIDNO∶6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度177氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶6
(2)有關SEQIDNO∶7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度507堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA到mRNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅸ)性能(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..507(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶7
(2)有關SEQIDNO∶8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度169氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶8
(2)有關SEQIDNO∶9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅸ)性能(A)名稱/鍵CDS(B)位置1..33(D)其它信息(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶9CCA GAT ACA GCT GTC AGG CCT GGG CCA CCA CCTPro Asp Thr Ala Val Arg Pro Gly Pro Pro Pro1510
(2)有關SEQIDNO∶10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度11氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶10Pro Asp Thr Ala Val Arg Pro Gly Pro Pro Pro1510(2)有關SEQIDNO∶11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶11Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Xaa Val15(2)有關SEQIDNO∶12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸
(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶12CCAGATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCT(2)有關SEQIDNO∶13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶13CCAGATACAGCTGTCAGGCCTGGGCCACCACCT(2)有關SEQIDNO∶14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無
(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶14GATCCATCGAGGGTAGGGGGCCCCCACCTGGCCCCCC(2)有關SEQIDNO∶15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度37堿基對(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義有(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶15TCGAGGGGGGCCAGGTGGGGGCCCCCTACCCTCGATG(2)有關SEQIDNO∶16的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)鏈單(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶16GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC(2)有關SEQIDNO∶17的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度6氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈單(D)拓撲型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅴ)片段類型N-末端(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶17Gly Pro Pro Pro Gly Pro15(2)有關SEQIDNO∶18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶18GATACAGCTGTCGCCCCTGGGCCACCACCTGGC(2)有關SEQIDNO∶19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30堿基對
(B)類型核酸(C)鏈雙(D)拓撲型線型(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)前提無(ⅳ)反義無(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO∶19GATACAGCTGTCGCCGGGCCCCCACCTGGC
權利要求
1.一種多肽，它選自由缺失2-9個N末端氨基酸的人體脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
2.權利要求1所述的多肽，它選自由含有下列序列(序列識別號為No.2)中的氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等價物，突變體和變異體，其前體及其衍生物組成的組。
3.權利要求1所述的多肽，它具有下列序列(序列識別號為No.8)Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 140Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165Leu169其等價物、突變體和變異體，其前體及其衍生物。
4.權利要求1所述的多肽，其中該N末端氨基酸是甲硫氨酸，或N-甲酰甲硫氨酸。
5.權利要求1所述的多肽，其中該突變體是具有突變的肽，該突變由選自由缺失，添加、倒位、插入、序列中氨基酸的取代組成的組的任何一種突變或所述突變的任何一種組合，只要所述的突變不會對該多肽的生理活性產生不利影響即可。
6.權利要求1所述的多肽，其中該變異體包括等位變異體。
7.權利要求1所述的多肽，它是融合蛋白形式。
8.一種編碼一種多肽的核苷酸序列，該多肽選自由缺失2-9個N-末端氨基酸的人體脂肪形成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體組成的組。
9.權利要求8所述的核苷酸序列，它編碼一種選自由含有下列序列(序列識別號為No.2)中氨基酸3-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等價物、突變體及變異體，其前體及其衍生物組成的組中的多肽。
10.權利要求8所述的核苷酸序列，它包括選自由下列序列(序列識別號為No.1)中核苷酸87-614到核苷酸108-614組成的組中的核苷酸，其突變體、變異體及其互補序列CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC CTGMet Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu-21 -20 -15GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC CCT GGG50Val Val Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly-10 -5 1CCA CCA CCT GGC CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC98Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala5 10 15GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG146Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala20 25 30GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA194Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro35 40GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC242Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala45 50 55ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG290Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val60 65 70CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC338Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His75 80 85GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACCVal Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr90 95 100CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG386Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg105 110CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG434Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu115 120 125CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC482Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro130 135 140CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC530Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile145 150 155CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA578Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly160 165 170CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG CCCAAAGCCA624Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu175CCACCGTCCT TCCAAAGCCA GATCTTATTT ATTTATTTAT TTCAGTACTG684GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCCGCC ATTATCTCCC CCTAGTTAGAGACAGTCCTT CCGTGAGGCC TGGGGGACAT CTGTGCCTTA TTTATACTTA744TTTATTTCAG GAGCAGGGGT GGGAGGCAGG TGGACTCCTG GGTCCCCGAG804GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC GGATTCTTGG GTCTCCAAGA AGTCTGTCCA864CAGACTTCTG CCCTGGCTCT TCCCCATCTA GGCCTGGGCA GGAACATATA924TTATTTATTT AAGCAATTAC TTTTCATGTT GGGGTGGGGA CGGAGGGGAA984AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACAGAGAACAGGGA ATTAAATGTG TCATACATAT C1044 1065
11.權利要求8所述的核苷酸序列，它具有下列序列(序列識別號為No.7)GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG CTCVal Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA48Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25CAG CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG96Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA144Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55GCT CTA CAG CTC CCA GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC192Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA240Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG CCC GAG CTG GGC ACC288Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC336Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC CCGLeu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC384Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 140ATC AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA432Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150CTT GAC TGG GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG480Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165CTG507Leu169其突變體、變異體及其互補序列。
12.與權利要求8所述的序列互補的一種核苷酸序列。
13.權利要求8所述的核苷酸序列，其中其在功能上等價的衍生物由等位變異體組成。
14.權利要求8所述的核苷酸序列，其中該在功能上等價的衍生物包括具有選自下列組中的突變體的多肽，該組由缺失，附加，插入，倒位，序列中殘基的取代或其任何結合組成，只要這些突變不會對該人體脂肪生成抑制因子衍生物的功能活性產生不利影響即可。
15.權利要求8所述的核苷酸序列，它至少與其一種控制序列在功能相關。
16.權利要求8所述的核苷酸序列，它至少與一種選自下列組的序列在功能相關，該組由啟動子序列、操作子序列、終止序列、誘導序列，或其組合組成。
17.一種載體，它含有權利要求8到16的任何一個定義的核苷酸序列。
18.權利要求17所述的載體，它是pSRα-(20-2)△Pro。
19.權利要求17所述的載體，它是pSRα-20-2。
20.一種宿主細胞，它采用權利要求8-16中任一權利要求定義的核苷酸序列，或用權利要求17-19中任一權利要求定義的載體來進行轉化。
21.一種用于治療可預防血細胞減少癥，或病態肥胖癥的藥物組合物，該組合物包括有效量的防血細胞減少癥化合物，或防病態肥胖癥化合物，并混合了藥物可接受的稀釋劑或載體，其中所述的防血細胞減少癥化合物，或所述的防病態肥胖癥化合物選自缺失1-9個N-末端氨基酸的人體脂肪生成抑制因子衍生物，其在功能上等價的衍生物及其前體。
22.權利要求21所述的組合物，其中所述的防血細胞減少癥化合物，或所述的防病態肥胖癥化合物是一種多肽，該多肽選自由含有下列序列(序列識別號為No.2中氨基酸2-178到氨基酸10-178的多肽Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu-21 -20 -15 -10Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro-5 1 5Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr10 15 20Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu25 30 35Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala50 55 60Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg65 70 75Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg80 85 90Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu95 100 105Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu110 115Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro120 125 130Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp135 140 145Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys165 170 175Thr Arg Leu178其等價物、突變體及變異體，其前體及其衍生物組成的組。
23.權利要求22所述的組合物，其中所述的防血細胞減少癥化合物，或所述的防病態肥胖癥化合物是一種具有下列序列(序列識別號為No.8)的多肽Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu1 5 10Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala15 20 25Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu30 35 40Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly45 50 55Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp60 65 70Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala75 80Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr85 90 95Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu100 105 110Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro115 120 125Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly130 135 14060;Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr145 150Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg155 160 165Leu169其等價物、突變體及變異體，其前體及其衍生物。
24.權利要求22所述的組合物，其中所述的防血細胞減少癥化合物，或所述的防病態肥胖癥化合物是具有下列序列(序列識別號為No.6)的多肽Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg1 5 10Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu15 20 25Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe30 35 40Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu45 50 55Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly60 65 70Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg75 80His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys85 90 95Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100 105 110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala115 120 125Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala130 135 140Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala145 150Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg155 160 165Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu170 175其等價物、突變體及變異體，其前體及其衍生物。
全文摘要
本發明涉及脂肪生成抑制因子(AGIF)的衍生物，它等價于缺失2—9個N-末端氨基酸的成熟AGIF，還涉及編碼這類衍生物的核酸、含有這類核酸的載體及宿主細胞以及制備這種衍生物的方法。還要求了與缺失1—9個N-末端氨基酸的成熟AGIF等價的AGIF衍生物作為抗血細胞減少癥及病態肥胖癥治療藥物的用途。
文檔編號A61K38/00GK1082112SQ93105918
公開日1994年2月16日 申請日期1993年4月17日 優先權日1992年4月17日
發明者宮臺健司, 川島一郎, 大隅潤, 滝口洋, 伊藤泰博 申請人:三共株式會社