分離脂肪組織活細胞方法、醫藥組合物及其用途、細胞庫的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種分離脂肪組織活細胞方法、醫藥組合物及其用途、細胞庫，尤其是 指一種利用一切割裝置將脂肪組織快速均質切碎，以利進一步自脂肪組織中分離出活細 胞，以提高自每單位重量的脂肪組織獲得活細胞數，且不降低細胞存活率。
【背景技術】
[0002] 按，間葉干細胞的來源可自人體許多不同組織分離出來，例如由手術直接切除或 經由抽脂手術取得的脂肪組織即為一干細胞豐富的來源，可分離出脂肪干細胞（Adipose tissue-derived stem cells, ADSCs)，其具有的優點有：取得方式侵入性低，對人體傷害 小、且一次取得的量較多、可于體外增生培養等；加上脂肪干細胞亦擁有可分化成硬骨、軟 骨、肌肉以及脂肪細胞的潛力（Zuk et al.，2002)，因此，脂肪干細胞被認為是最具研究發 展潛力的干細胞之一。
[0003] 現今對于手術直接切除而得的塊狀脂肪組織切碎處理方式尚未有一套合適的自 動化系統來搭配使用，而一般切碎處理方式有如中國臺灣專利201331366號一種「體外 無血清成體干細胞放大培養技術」，其方法中揭示經手術切脂取得脂肪組織塊，并進一步 利用手術刀具切碎該脂肪組織后與膠原蛋白酶酵素作用，再經分離可得基質血管層細胞 (Stromal vascular fraction, SVF)，為基質細胞、血液細胞、血管內皮細胞與脂肪干細胞 等共同組合而成。惟，其利用手術刀具切碎脂肪組織的步驟，需要耗費較多時間才得以將脂 肪組織盡可能的切碎，以獲取較多的基質血管層細胞；而操作切碎步驟的時間越長，對前述 基質血管層細胞的存活率影響就越大，以至所獲取的脂肪間質干細胞其存活率相對較低。 此外，操作人員于操作不同來源檢體時較容易因重復使用手術刀具而產生檢體交叉污染的 風險。
[0004] 另如中國臺灣專利201235471號「包含眼窩脂肪衍生的干細胞（0 F S C)的細胞 群及彼等的分離與應用」，其方法中揭示由眼眶內腔直接移除的眼窩組織中收集而得，或由 眼瞼內翻、眼瞼外翻、眼瞼下垂或眼袋的瞼造型手術所收集而得的眼窩脂肪，可簡易的使用 剪刀或鑷子支解該眼窩脂肪組織再與膠原蛋白酶酵素作用，再進行過濾、離心分離以獲得 細胞沉淀物，并將該細胞沉淀物進行細胞培養以獲得具有群落形成能力的細胞。惟，該案 所揭示的方法同樣存在有使用剪刀或鑷子支解該眼窩脂肪組織，需要耗費較多時間才得以 將脂肪組織盡可能的切碎，以獲取較多的細胞沉淀物；且相對地，其操作切碎步驟的時間越 長，對前述細胞沉淀物中細胞的存活率的影響就越大。
[0005] 綜合上述，為了解決上述現有利用手術刀具進行脂肪組織切碎作業所帶來的缺 失，亟需要一可快速切碎脂肪組織以分離活細胞的方法，在不降低細胞存活率前提下，以進 一步提高自每單位重量的脂肪組織取得活細胞數目。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種分離脂肪組織活細胞方法、醫藥組合物及其用途、細 胞庫，以期達到提高自每單位重量的脂肪組織取得活細胞數且不降低細胞存活率的目的。
[0007] 為了達成上述目的，本發明的解決方案是： 一種分離脂肪組織活細胞方法，其包括有下列步驟： 步驟a提供一脂肪組織； 步驟b將該脂肪組織置于一切割裝置的封閉容器中； 步驟c使該切割裝置對該封閉容器施予一作用力，令該封閉容器中的一預設切削刀具 對該脂肪組織執行快速均質切碎，獲得一均質化脂肪組織； 步驟d于前述已切碎的該均質化脂肪組織中加入一試劑，進行水解反應； 步驟e將前述經水解反應處理過的該均質化脂肪組織進行過濾、離心分離；及 步驟f將離心分離后的上清液移除，以獲取一細胞沉淀物。
[0008] 于上述步驟a前可包含一以磷酸緩沖溶液清洗前述脂肪組織的步驟。
[0009] 上述步驟a中所述的脂肪組織是來自哺乳類動物外科手術切除而得來的塊狀脂 肪組織。
[0010] 上述哺乳類動物是人類。
[0011] 上述步驟b中所述的切割裝置是一拋棄式的均質機。
[0012] 上述拋棄式的均質機包含有一拋棄式封閉容器及一動力單元，且該拋棄式封閉容 器內具有一切削刀具。
[0013] 上述步驟c均質切碎條件為于15毫升體積的拋棄式封閉容器內置入1公克至6 公克脂肪組織，進行快速均質切碎。
[0014] 上述步驟c均質切碎較佳條件為于15毫升體積的拋棄式封閉容器內置入3公克 脂肪組織，進行快速均質切碎。
[0015] 上述動力單元的轉速為300每分鐘轉數至3000每分鐘轉數，而作用時間為3分鐘 至10分鐘。
[0016] 上述動力單元的較佳轉速為為600每分鐘轉數至1500每分鐘轉數。
[0017] 上述步驟d中所述的試劑是選自一胰蛋白酶、一中性蛋白酶、一膠酶、一玻尿酸 酶、一第一型膠原蛋白酶或一第四型膠原蛋白酶所構成群組之一或其組合。
[0018] 上述步驟d中所述的水解反應是全程置于一恒溫雜交反應烘箱中進行，且條件為 攝氏4度至45度、轉速為5每分鐘轉數至50每分鐘轉數，以及時間0. 5小時至24小時。
[0019] 上述較佳的條件為攝氏37度、轉速為15每分鐘轉數以及時間8小時。
[0020] 上述步驟e中所述離心的條件為400 X g、時間10分鐘。
[0021] 上述步驟e更包含將過濾掉脂肪組織碎渣后所得一過濾液移入一離心管的步驟， 以進行離心分離。
[0022] 上述步驟f中所述的細胞沉淀物是一基質血管層細胞。
[0023] 上述步驟f之后更包括一步驟g將磷酸緩沖溶液加入前述細胞沉淀物中，清洗前 述細胞沉淀物，再次離心以去除含有血水及前述試劑的上清液，獲得一清洗后的細胞沉淀 物。
[0024] 上述步驟g之后更包括一步驟h將前述清洗后的細胞沉淀物置入一培養基中培 養，以獲取一擴增的細胞。
[0025] 上述培養基包含：一基礎培養基、一血清添加物、一第二型纖維母細胞生長因子。
[0026] 上述血清添加物是一胎牛血清，且使用的體積百分濃度為百分之2至百分之10， 而該第二型纖維母細胞生長因子使用濃度為1毫微克/毫升至20毫微克/毫升。
[0027] 上述擴增的細胞是實質未分化的一脂肪間質干細胞。
[0028] 上述的脂肪間質干細胞是至少表現細胞表面抗原⑶90或⑶105或其組合，且不表 現⑶45的細胞群。
[0029] 上述的脂肪間質干細胞是應用于細胞治療的材料、再生醫學或細胞組織工程之一 或其組合。
[0030] 一種包含上述的分離脂肪組織活細胞方法所獲取前述實質未分化的脂肪間質干 細胞在制備細胞治療的醫藥組合物的用途，是應用于退化性疾病、修復組織損傷、器官再生 或組織再生之一或其組合。
[0031] 于上述步驟h之后包括一步驟i冷凍保存前述擴增的脂肪間質干細胞，用于更進 一步的應用。
[0032] -種細胞庫，其包含由上述步驟i所冷凍保存的擴增的脂肪間質干細胞。
[0033] 于上述步驟h之后包括一步驟i'執行誘導分化前述擴增的脂肪間質干細胞，以獲 取一自前述擴增的脂肪間質干細胞所分化的細胞。
[0034]自上述擴增的脂肪間質干細胞所分化的細胞，包括骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞 之一。
[0035] -種醫藥組合物，其包含上述分離脂肪組織活細胞方法所獲取自前述脂肪間質干 細胞所分化的細胞或前述實質未分化的脂肪間質干細胞之一或其組合。
[0036] 采用上述結構后，本發明的功效在于： 縮短切碎脂肪組織步驟所需時間：本發明借由利用前述切割裝置可較現有以手術刀具 執行切碎的方法更為縮短切碎脂肪組織步驟所需時間，且可降低操作人員間因技巧熟練差 異所造成的影響，從而減低脂肪組織中細胞因離開人體時間過長所造成的細胞死亡現象， 進而提高細胞存活率。
[0037] 提高活細胞收獲率：本發明借由利用前述切割裝置將脂肪組織均質切碎，以增加 脂肪組織與所添加的水解反應試劑的接觸面積增加，提高水解反應效果，以提高自每單位 重量的脂肪組織取得基質血管層細胞的數目，并提高前述基質血管層細胞于進一步培養 后，所得的脂肪間質干細胞數目，且不降低細胞存活率。
[0038] 降低檢體交叉污染：本發明是利用一拋棄式封閉容器以及一動力單元對所取得的 塊狀脂肪組織檢體進行快速均質切碎步驟，不同來源的檢體各置入一拋棄式封閉容器中， 可避免操作人員于操作不同來源檢體時因誤觸所造成的交叉污染現象。
[0039] 獲取具有分化潛能的脂肪間質干細胞：借由本發明方法所獲取的脂肪間質干細胞 系屬至少表現細胞表面抗原⑶90及⑶105,且不表現⑶45的細胞群，且具有分化為硬骨、軟 骨及脂肪的能力，使經本發明方法所獲取的脂肪間質干細胞為具有分化潛能的多潛能干細 胞的豐富來源。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發明的方法流程圖； 圖2A為本發明中其一捐贈者的不同脂肪組織公克數可得基質血管層細胞數目比較 圖； 圖2B為說明本發明中其一捐贈者的不同脂肪組織公克數所得基質血管層細胞的存活 率比較圖； 圖2C為本發明中其二捐贈者的不同脂肪組織公克數可得基質血管層細