最新鑒定出的用于誘導幼年哺乳動物口服耐受性的肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及最新鑒定出的肽，所述肽能夠誘導對牛乳、尤其是對β?乳球蛋白的耐受性。所述肽可施用于哺乳動物，尤其是對牛乳蛋白有變態反應風險的幼小嬰兒，以誘導對牛乳的口服耐受性；所述肽也可施用于對牛乳有變態反應的兒童或成人，以允許發生對變應原性乳蛋白、尤其是β?乳球蛋白的“脫敏”。所述肽也可用于誘導對山羊和水牛乳蛋白、尤其是β?乳球蛋白的耐受性。所述肽能夠調節哺乳動物對變應原的免疫應答。
【專利說明】
最新鑒定出的用于誘導幼年哺乳動物口服耐受性的肽
技術領域
[0001] 本發明涉及最新鑒定出的β-乳球蛋白肽，這些肽具備低變應原性，但仍保留誘導 對天然蛋白的耐受性的能力。可將這些肽施用于所有嬰兒，尤其是有牛乳蛋白（具體為β-乳 球蛋白）變態反應風險的嬰兒。這些肽能夠調節嬰兒對變應原的免疫應答。
【背景技術】
[0002] 牛乳變態反應(CMA)累及所有嬰兒的大約2.5%，被認為是該年齡組最為常見的食 物變態反應[Sicherer SH et al.(2010)，Food allergy, Sampson HA，J.Allergy Clin. Immunol · (125) (Sicherer SH等人，2010年，"食物變態反應"，Sampson HA，《變態反應 與臨床免疫學雜志》，第125卷）]。大約85%的兒童對牛乳的變態反應隨著成長而逐漸消失， 在2至3歲之前不再出現。因此，CMA對其他年齡組的影響不太普遍。
[0003] 對牛乳和適宜滿足嬰兒需求的含牛乳配方食品的變態反應是由于這樣的事實：牛 乳的蛋白質不同于母乳的蛋白質，因而可構成變應原。
[0004] 除母乳喂養外，預防CMA的主要建議是使用部分水解的低變應原性配方食品，推薦 給特應性父母所生的"高風險"無癥狀嬰兒服用這種配方食品。
[0005] 與用于嬰兒的標準牛乳配方食品相比，低變應原性配方食品中的牛乳蛋白已被水 解，潛在變應原性降低。現已證實這種方法能有效地預防配方食品中存在的天然(全長)蛋 白（盡管含量比非水解配方食品中的低得多）的致敏作用。
[0006] 水解產物可被表征為"部分水解的"或"充分水解的"，具體取決于水解反應進行的 程度。世界變態反應組織(WA0)有關CMA的指南中所稱"充分水解產物"，目前還沒有約定的 法律/臨床定義，但已達成共識的是正如WA0所稱，現已證實經水解的配方食品是可用于罹 患CMA的嬰兒、也被廣泛用于這類嬰兒的蛋白質來源。在本發明中，部分水解產物的定義是： 其中60 %的蛋白質/肽群體的分子量小于1000道爾頓的水解產物;充分水解產物的定義是： 其中至少95%的蛋白質/肽群體的分子量小于1000道爾頓的水解產物。這些定義目前用于 本行業。
[0007] 目前市面上有許多基于酪蛋白或乳清、還具備低變應原性的部分或充分水解配方 食品，例如雀巢公司(Nestle)出品的NAN-HA?(亦稱BEBA-HA?)、Alfare?、Alt6ra?，以及輝 瑞公司(Pf i zer)出品的S26-HA?。
[0008] 對于已表現CMA癥狀的嬰兒而言，非變應原性代乳配方食品例如基于游離氨基酸 的配方食品（例如，雀巢公司（Nestle)出品的Vivonex?)或基于大豆的配方食品（例如紐約 輝瑞公司（Pf izer，New York)出品的S-26Soy?、NURS0Y?，以及雀巢公司（Nes11 ?)出品的 HESTLf: K GoodStart? ALSOY?)可為牛乳標準配方食品或低變應原性配方食品的合適 替代品。
[0009] 因此，截至目前在向發生牛乳變態反應的兒童提供營養方面的主要關注點，一直 是尋找不會誘發變態反應的制品，也就是提供非變應原性配方。向嬰兒施用非變應原性配 方食品（包含游離氨基酸、基于大豆的乳品或充分水解的牛乳蛋白）的缺點之一是，雖然此 類配方使對牛乳有變態反應的嬰兒得以避免變態反應，但它們無法使這些兒童產生對牛乳 蛋白變應原的口服耐受性，所以這些兒童日后無法繼續飲用未改變的乳制品。
[0010] 口服耐受性是指事先經口服途徑施用抗原，而特異性抑制細胞和/或體液對抗原 的免疫反應。這是出生后前幾個月免疫系統發育的重要組成部分，可使嬰兒在吃東西時不 出現不良反應。若未能建立口服耐受性，便引起變態反應。口服耐受性的產生與正常的免疫 系統教育(減弱對食物抗原的反應)有關。
[0011]現已鑒定出了影響口服耐受性的誘導和維持的若干因素，這些因素包括食物蛋白 質的結構、抗原施用的劑量和頻率，以及宿主的免疫狀態。
[0012] 據信，可特別存在于部分水解嬰兒配方食品中的一些肽能夠與免疫系統相互作 用，因而誘導口服耐受性。
[0013] 已經發現，部分水解的乳配方不僅具有降低的變應原性，還可誘導對乳蛋白的免 疫耐受性(EP 0827 679)。
[0014]因此，歐洲專利申請EP 2 332 428公開了一種配方，其包含能夠誘導口服耐受性 的含牛乳肽的水解產物。所討論的肽被鑒定為源自牛酪蛋白。
[0015] W0 00/42863描述了鑒定β-乳球蛋白（主要牛乳變應原之一）的多種致耐受性肽的 方法，這些致耐受性肽能夠誘導口服耐受性，證據是與未接觸所討論的肽的小鼠相比，先前 接觸過所討論的肽的小鼠對該天然蛋白的免疫應答(IgE)減弱。在該專利申請中，作者提到 了EP 0 629 350,其中公開了非變應原性乳清蛋白水解產物的用途，據稱非變應原性乳清 蛋白水解產物能夠誘導牛乳蛋白耐受性。W0 00/42863的作者指出，盡管EP 0 629 350中表 明了基本上不含變應原性蛋白的乳清蛋白水解產物可用于在有牛乳變態反應風險的兒童 體內誘導牛乳蛋白耐受性，但他們在分析其他非變應原性乳清蛋白水解產物后發現，非變 應原性不一定體現為誘導牛乳蛋白耐受性的能力。他們還表示，甚至一些表現出最高程度 非變應原性的配方，也被發現不適于誘導牛乳蛋白耐受性。
[0016] 此外，已知的是，充分水解的配方食品失去了誘導長期口服耐受性的能力，也就是 說，水解以某種方式充分修飾了蛋白的性質，導致該蛋白不再被免疫系統識別。這造成關鍵 有益效果損失。
[0017] 因此，需要進一步鑒定可影響口服耐受性的誘導的因素。非常希望提供低變應原 性或非變應原性組合物，這些組合物可用作母乳的補充或替代品，還能夠誘導嬰兒的口服 耐受性。
[0018] 需要提供可緩解(尤其是嬰兒的)變態反應發展的合成營養液。需要誘導對多種變 應原(包括乳變應原和乳蛋白）的耐受性。
[0019] 還需要設計和制備營養干預(尤其是利用合成成分或成分的組合），這些營養干預 可在生命早期施用于嬰兒，降低以后生活中呈現或發生變態反應或變態反應發展的可能性 或嚴重程度。
[0020] 一般嬰兒群體以及體質易發生變態反應或發生過已公布變態反應的嬰兒亞群都 有該需求。
[0021] 普遍需要緩解變態反應或變態反應癥狀，還需要開發誘導(尤其是兒童和嬰兒)對 常見變應原例如乳變應原的耐受性的方法。

【發明內容】

[0022] 本發明提供了最新鑒定出的β-乳球蛋白（BLG)的肽，即SEQ ID No.l至SEQ ID No.5,這些肽用于在有蛋白變態反應風險的個體以及已發生變態反應的個體中誘導對乳蛋 白的耐受性。最新鑒定出的肽SEQ ID No. 1-5被HLA-DR(人白細胞抗原-DR)所識別并結合于 其上。因此，這些肽每一者都包含HLA表位，該HLA表位有利于被免疫細胞識別，還有利于誘 導哺乳動物對乳蛋白（尤其是乳球蛋白（BLG))的口服耐受性。乳蛋白可來自奶牛、綿羊、 山羊或水牛。
[0023] 因此，本發明涉及肽或肽的組合，所述肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度并 包含選自SEQ ID No.1-5的序列，用于誘導哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水牛或山羊的乳蛋 白的口服耐受性。人類嬰兒尤其受到關注。
[0024] 為增強致耐受性效應，可將具有五至十二個氨基酸的長度并包含表1中的序列a、b 和c之一的一種或多種肽，與上一段落中所述的基于SEQ ID No.1-5的肽或肽的組合聯合施 用。
[0025] 這些肽可按其純形式施用;稀釋于合適的液體中施用；或按藥物組合物、營養組合 物或營養補充劑的形式施用。
[0026] 根據本發明的一個實施方案，這些肽為如下形式：（i)水解含BLG的蛋白類物質所 得的分離的肽級分，和/或（i i)以合成方式制備的肽。
[0027] 這些肽的主要優點是，可誘導哺乳動物對奶牛、綿羊、水牛或山羊乳蛋白（尤其是 乳球蛋白）的口服耐受性。這些哺乳動物可為幼年哺乳動物，特別是人類嬰兒，他們要么 因父母至少一方或至少一個同胞對牛乳有變態反應，而有發展牛乳變態反應的"高風險"， 要么沒有"高風險"。因此，本發明的肽有益于幼年哺乳動物的一般群體。可受益于施用本發 明的肽的另一組，是已對牛乳有變態反應的成年哺乳動物。因此，有變態反應的成年哺乳動 物在接觸本發明的致耐受性肽之后，可對天然變應原"脫敏"。所以可將這些肽中的一種或 多種(兩種、三種、四種或所有五種)施用于哺乳動物，以誘導對乳蛋白（尤其是BLG)的口服 耐受性。
[0028] 可將這些肽施用于寵物，例如狗和貓。
[0029] 這些肽與之前從BLG鑒定出的肽(參見表1中的肽a、b、c)(參見W0 0042863)相比占 有優勢。接觸BLG后，與之前鑒定出的肽a、b和c(參見圖1)相比，肽2-5更大程度下調了IgE的 表達(參見圖1)。
[0030]在一個優選的實施方案中，所述肽或肽的組合為肽級分的形式，其包含肽SEQ ID No. 1至SEQ ID No.5中的至少一種。可將所述肽或肽的組合以0.4_50ymol/kg體重/天、優選 0.9-40ymol/kg體重/天的劑量施用于幼年哺乳動物或成年哺乳動物。可每天施用一次、每 隔一天施用一次、每隔兩天施用一次，或每周施用一次并至少持續兩周，優選至少持續一個 月，更優選至少持續三個月。可持續施用更長時間，例如最多三年。
[0031 ]對未接觸過BLG的受試者來說，"一次"施用便可有效誘導對BLG的口服耐受性。 [0032] 這些肽可按組合物的形式施用，該組合物為干品時，每克包含25至250yg肽，優選 50至150yg肽。可將這些肽加入基礎組合物中，該基礎組合物為1段嬰兒配方食品（starter infant formula)或較大嬰兒配方食品（follow-up infant formula)或成長乳（growing up milk)。所述基礎組合物可為"非變應原性"或低變應原性組合物。
[0033] 這些肽可按組合物的形式施用，所述組合物包含另外的成分或益生元，優選地選 自菊粉、低聚果糖(F0S)、短鏈低聚果糖(短鏈F0S)、低聚半乳糖(G0S)、低聚木糖(X0S)、神經 節苷脂、部分水解的瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混合物。
[0034] 這些肽可按組合物的形式施用，所述組合物包含另外的成分或益生菌，優選地選 自副干酷乳桿菌(Lactobacillus paracasei )、乳桿菌(Lactobacillus)GG、鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)以及短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)。
【附圖說明】
[0035]圖1:強飼天然β-乳球蛋白（nBLG)或合成肽、接著以實驗方式致敏的小鼠體內的β- 乳球蛋白（BLG)特異性體液免疫應答。
[0036]給小鼠強飼nBLG或合成肽，接著以實驗方式用nBLG致敏小鼠。定量測定第30天采 集的單獨血清中的BLG特異性IgE(A)抗體濃度。使用Kruskall-Wallis和Dunn多重比較事后 檢驗，結果顯示了指定組之間的統計顯著性(*P〈〇. 05，#0.01〈p〈0.001，*#p〈0.001)。
【具體實施方式】
[0037]在本發明中，術語"耐受性"應被理解為特異性免疫無應答性的狀態。免疫應答的 體液(抗體)途徑和細胞介導(淋巴細胞等)途徑都可受到耐受性誘導的抑制。口服耐受性受 破壞被認為是食物變態反應的根本原因。
[0038]術語"變應原"應被理解為能夠引發哺乳動物、尤其是"高風險"幼年哺乳動物(包 括嬰兒或乳嬰）的變態反應的蛋白或巨肽。如果父母至少一方或至少一個同胞為特應性體 質，則幼小嬰兒被認為有蛋白變態反應的"高風險"。
[0039] 術語"致耐受性肽"應被理解為這樣的蛋白片段，其對應于天然蛋白的一部分，大 小為200至6000Da(3至50個氨基酸），優選為500至3000Da，更優選為500至1400Da，并能夠誘 導對天然蛋白的特異性口服耐受性。
[0040] 術語"非變應原性"基礎組合物應被理解為氮源包含均衡的氨基酸組成的組合物。 "非變應原性"對于乳蛋白而言，被定義為單獨乳清蛋白不超過lppm的殘余變應原性，以及 總酪蛋白不超過10ppm的殘余變應原性。
[0041] 術語"致敏"意指變應原特異性IgGl和/或IgE抗體的誘導/發展。
[0042] 本發明涉及多種最新鑒定出的肽，以及使用這些肽誘導幼年哺乳動物的一般群體 (包括被認為有發展CMA的"高風險"的群體和沒有發展CMA的"高風險"的群體）以及對牛乳 有變態反應的成年哺乳動物產生對牛乳蛋白（尤其是對乳球蛋白）的口服耐受性。最新鑒 定出的肽也可誘導對來自綿羊、山羊或水牛的BLG的口服耐受性，因為這些肽也存在于綿羊 乳、山羊乳和水牛乳中。
[0043]本發明的肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度，并包含選自SEQ ID No.1-5(參 見表1)的序列。所述肽因而具有特定長度(5至12個氨基酸）。
[0044]短于五聚物(長度為五個氨基酸）的肽可能無法提供致耐受性效應，而長于12聚物 的肽被認為具有增大的變應原性風險。
[0045]因此，所述肽可為包含選自SEQ ID No.1-5的序列中任一者的5聚物、6聚物、7聚 物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。因此，所述肽可為任一種這樣的肽:其為包含序 列IIAEK(SEQ ID No.l)、IVTQTM(SEQ ID No.l)、KGLDIQK(SEQ ID No.2)、DAQSAPLR(SEQ ID No.3)、VEELKPTPE(SEQ ID No.4)或IIAEK(SEQ ID No.5)的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚 物、10聚物、11聚物或12聚物。
[0046]相似地，在與基于序列SEQ ID No. 1-5的上述肽一起施用時可提供增強效果的肽 是任一種這樣的肽:其為5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物，并包 含選自表1中的a、b和c的序列中任一者。
[0047] 因此，本發明的肽誘導哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐 受性。
[0048] 肽的制備和表征
[0049] 根據本發明的一個實施方案，可采用技術人員已知的標準方法，以合成方式制備 分離的肽。另選地，根據本發明的另一個實施方案，這些肽可從天然來源例如乳(如牛乳)或 乳級分濃縮、提取和/或分離，所述天然來源優選地經過改性、處理，以便例如產生或濃縮這 些肽。可采用本領域已知的方法生成其中乳蛋白已由酶或其他方式水解的乳水解產物。從 乳水解產物中提取、分離和鑒定包含本發明肽的肽級分的方法也是技術人員已知的。本發 明的肽可通過這些方法生成。
[0050] 例如，本發明的肽可使用US 5039532A中公開的方法制備。酶水解過程包含一個分 為兩步的水解反應，在該水解反應的兩個步驟之間有一個熱變性步驟，用于確保最終水解 產物基本上不含完整的變應原性蛋白。例如，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可用于這些方法，這 兩種酶可以是提取豬膜臟制備的制品、或利用重組DNA技術在細菌中制備的制品。
[0051] 例如，可使用包含乳清蛋白的任一種乳清原料進行酶水解。該原料可以是來自奶 酪制作過程的乳清，特別是甜乳清(例如用凝乳酶凝固酪蛋白得到的甜乳清）、用酸凝固酪 蛋白得到的酸乳清、或酸化發酵劑，甚至是在酸和凝乳酶共同作用下凝固得到的混合乳清。 該原料可以是通過離子交換和/或通過電滲析脫除了礦質的乳清。該乳清可以是最多只含 一點乳糖的乳清蛋白濃縮物，其是例如通過超濾、任選地之后進行滲析而獲得的。該原料甚 至可為上述原料與乳糖的組合。該原料可為真正的水溶液或膠態水溶液的形式，或者粉末 的形式。若為粉末的形式，則粉末溶解于優選被脫除了礦質的水中，以形成水溶液。
[0052] 使用在堿性和中性范圍內有活性的混合或純化的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶或胰酶），按已知的方式對該原料進行酶水解。該初步水解可使用少量酶(例如 占水解所用總量的10%)進行相對短的時間，優選5至35分鐘，例如10分鐘。這能節省酶的用 量。在這種情況下，水解僅部分完成。該水解過程可在反應器內進行，或另選地在管內進行。 [0053]如果待水解的底物在熱處理期間可能趨于凝固，則可將螯合劑(例如檸檬酸鈣或 檸檬酸鎂)加入該底物，如例如美國專利No. 4,748,034中指出的那樣。在6至8的pH值下，80 °(：至100°(：熱處理水解產物3至10分鐘。熱處理時間和溫度無疑是相關的，溫度下限對應時 間上限，反之亦然。現已證實，在工業熱交換器中使用大約90°C的溫度和5分鐘左右的停留 時間，便足以使微量蛋白質變性。實際上已發現，這些蛋白質變性后更易接受后續的酶降解 處理。宜提及的是，熱處理使酶失活。
[0054] 然后將水解產物冷卻到40°C至60°C，優選冷卻到大約55°C，55°C是保證水解活性 的最適溫度。優選的是，通過添加堿的水溶液，將pH值調節至大約7.5。第二次水解的條件可 能有變。例如，可在恒溫控制的釜式反應器中以分批方式不連續地進行。添加蛋白水解酶 (選自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶，或者胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶的混合物）水溶液之 后，水解60至180分鐘。
[0055]否則，第二次水解可在構成紊流狀態反應器的管中連續進行1至60分鐘，優選2至 20分鐘。采用這種變型時，在管中反應要獲得待水解產物的生產量所要求的一段時間，具體 時間量取決于管的長度。因此，必須將酶連續栗送到駐留管的入口。所得的高紊流狀態導致 酶與底物迅速而劇烈地接觸。不論選用何種模式(分批或連續)執行第二次水解，都對水解 產物進行熱處理，使酶失活。該熱處理包括將水解產物預熱到75°C或75°C以上，接著在該溫 度下(優選在75°C至85°C下)保持約5分鐘以促進酶自身消化，有利的是在該處理之后滅菌， 優選以注入蒸汽方式或在熱交換器中，在超高溫度下（例如125°C至135°C下）滅菌2至3分 鐘。然后，可例如通過噴霧干燥法或冷凍干燥法干燥水解產物，以用于不同應用，或者甚至 可對水解產物進行后續處理。在后一種情況下，酶可在后續處理期間失活。
[0056] 肽的鑒定和表征
[0057]在實施例1中詳述的一組實驗中，本發明人鑒定出了負責誘導對乳蛋白（尤其是 BLG)的口服耐受性的BLG肽序列。在第一步中，使用基于細胞的測定法，將雀巢公司(Nestl ?)出品的部分水解嬰兒配方食品NAN HA?(另稱作BEBE HA?)與表達主要組織相容性復合 體(MHC) II類受體HLA-DR的人類細胞一起溫育。作為誘導口服耐受性的第一步，HLA受體將 肽序列呈遞給T細胞，從而誘導耐受性。因此，耐受性的產生很大程度上取決于MHC對肽序列 的識別。
[0058] MHC的肽結合區域識別由平均十個氨基酸、最少五個氨基酸構成的肽序列或肽裝 配物。實際上，這些五肽可包含在更長的肽序列(甚至蛋白質）中，因為這些肽序列在胃腸道 中會被消化，而得到這種5至18個氨基酸的較小肽尺寸。這部分解釋了游離氨基酸、二肽、三 肽和四肽所構成的充分水解產物無法誘導口服耐受性的原因。
[0059]因此在本發明中，在存在NAN-HA?配方食品（經證實對細胞無毒）的情況下培養表 達HLA-DR的人類細胞，利用免疫沉淀法分離結合于HLA受體的肽，然后通過質譜和氨基酸測 序進行鑒定。
[0060] 最新鑒定出的肽來自BLG，列于表1中。
[0061]
[0062] 還通過該方法鑒定出了肽a 即IDALNENK、肽b 即VLDTDY和肽c 即EVDDEALEK。這些肽 之前在W0 20042863中被鑒定為口服耐受性的誘導物。這些肽在后一文獻中被鑒定為較長 肽序列的一部分。因此，這些已知的肽充當本實驗中的陽性對照。
[0063] 證實這些肽在體內具有致耐受性
[0064] 利用BLG致敏實驗小鼠模型，進一步評估了這些肽序列在體內誘導口服耐受性的 能力(參見實施例2和圖1)。
[0065] 該動物模型之前已用于展示天然BLG在強飼后誘導耐受性的功效[Patient，Ket et al.,(2011).Oral tolerance and Treg cells are induced in BALB/c mice after gavage with bovineP-lactoglobulin.Allergy ,66(10)，1312_1321(Patient，Ket等人， 2011年，"強飼牛β-乳球蛋白后在BALB/c小鼠中誘導口服耐受性和Treg細胞"，《變態反應》， 第66卷，第10期，第1312-1321頁）]。有趣的是，在后一文章中，已展示經過胰蛋白酶水解的 BLG不會誘導口服耐受性。
[0066] 小鼠模型用于測量全長天然BLG以及與牛BLG的序列（84-106)和（25-107)對應的 兩種BLG合成肽誘導口服耐受性的水平。在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天和第10天采用 強飼法，給小鼠喂食天然BLG或者合成肽(84-106)或(25-107)。然后在第14天通過腹膜內施 用天然BLG，使這些小鼠致敏。在第30天與第33天之間測量血清IgE水平。
[0067] 從圖1可以看出，強飼天然BLG有效誘導了耐受性，從而防止在用BLG致敏后進一步 誘導BLG特異性IgE生成。肽(25-107)包含本發明的序列2、3、4、5,以及之前已知的肽a，其與 對照(PBS)相比導致血清IgE水平下降（ρ = 0·04)。肽(84-106)包含序列5、a、b和c，其與PBS 相比，展示出導致IgE水平下降的趨勢。
[0068] 本發明人推斷，與來源于序列(84-106)的肽(a、b和c)相比，來源于序列（25-107) 的肽1-5在該小鼠模型中誘導口服耐受性方面更為有效。這些較長的肽序列（25-107)和 (84-106) -旦被強飼給小鼠，就自然而然地被胰酶和蛋白酶加工，從而產生較小的肽，包括 含有序列SEQ ID如.1-5及序列&、13和(3的肽。
[0069] 該實驗展示，最新鑒定出的肽1-5被HLA-DR識別并結合于其上。然后這些肽可被呈 遞給T細胞。該過程允許誘導對包含這些序列的變應原性蛋白（即BLG)的口服耐受性。現已 基于誘導口服耐受性的能力，篩選了根據本發明的肽或肽1-5的組合。
[0070] 根據本發明的一個實施方案，為誘導口服耐受性而施用的肽或肽的組合選自序列 SEQ ID No.1-5。
[0071] 據推測，與選自表1中的已知肽a、b和c的一種或多種肽聯合施用時，肽所產生的致 耐受性效應得到加強。與肽組a、b、c或1-5單獨服用時所誘導的效應相比較，預期該組合在 誘導對BLG的口服耐受性方面提供增強的效應。
[0072]因此，根據本發明的一個實施方案，將選自SEQ ID No. 1-5的肽或肽組合與肽a、b 和c聯合施用。
[0073]序列SEQ ID No. 1-5已被鑒定為在如下物種的BLG中是高度保守的（序列同一性為 100%):奶牛、水牛、家山羊、綿羊和摩弗倫羊。因此，據信包含這些序列的這些乳源中的任 一種都可誘導對牛乳的口服耐受性，反之亦然。所以本發明人推測，本發明人鑒定出的肽可 誘導對來自這些源中任一源的BLG的口服耐受性。在許多國家，山羊乳和綿羊乳被用來替代 牛乳，或用來補充牛乳。市面上已有使用山羊乳乳清作為蛋白質來源的嬰兒配方食品。因 此，將本發明的成果應用于來自除奶牛之外物種的乳可能很有價值。
[0074]根據本發明的一個實施方案，以足以誘導對牛BLG的口服耐受性（優選誘導對牛 BLG的完全口服耐受性）的量施用所述肽或肽的組合。BLG也可來自綿羊或山羊。完全口服耐 受性指的是，在用牛乳(特別是牛BLG)進行DBPCFC(雙盲安慰劑對照食物激發試驗）后未觀 察到變態反應。
[0075]根據本發明的一個實施方案，這些肽的含量可為總蛋白的0.01 %至5%，優選 0.1% 至 0.5%〇
[0076]根據本發明的一個實施方案，這些肽的組合包含一種或兩種或三種或四種或更多 種肽。
[0077] 所述肽或肽的組合可被單獨地（以其純的形式，或稀釋于例如水或母乳中）或作為 組合物直接經口施用于幼年哺乳動物，所述組合物為嬰兒乳品配方食品或食物補充劑(例 如人乳強化劑）。所述肽或肽的組合也可在營養性喂養期間所用的任何乳載體、非乳基嬰兒 配方食品、嬰孩米粉或酸奶、嬰孩餐奶酪布丁、乳制品或果汁飲料、冰沙、小吃、餅干或其他 烘焙食品中施用。所述肽或肽的組合可被以飲料、食物或食物補充劑的形式施用于成人。所 述肽或肽的組合也可以在寵物食物和飲料(例如任何干燥食物或粗磨食物、濕潤食物或罐 裝食物、或者補充劑）中施用。
[0078] 合成肽和/或由人工方法濃縮的肽可為人造嬰兒配方食品、人造水解嬰兒配方食 品（部分或充分水解)或一般性人造營養組合物的一部分。此類組合物可為本發明的實施方 案。
[0079] 此類組合物可按指示的劑量用作營養液或藥物，以誘導尤其是對乳蛋白的口服耐 受性。可將此類組合物施用于嬰兒，或呈現變態反應癥狀或變態反應易感性的嬰兒亞群。這 樣誘導口服耐受性，可在中期（治療期間或在治療后1、6、12或18個月內）緩解變態反應。另 選地或此外，所誘導的口服耐受性在以后生活中（例如，治療后24、36、48、72個月），尤其是 在免疫系統已成熟后，可能有積極的效果。
[0080] 劑量
[00811根據本發明的一個實施方案，這些肽的劑量在0.4至50ymol/kg體重/天的范圍內， 優選在0.9至40ymol/kg體重/天的范圍內。例如，如果這些肽作為粉末狀嬰兒配方食品的一 部分施用，則這些肽在該配方食品中的濃度可為50至150yg/g粉末。供嬰兒食用的嬰兒配方 食品的典型劑量是:對五個月大的嬰孩來說，每天三瓶，每瓶七勺粉末;對六個月大或六個 月以上的嬰孩來說，每天兩瓶，每瓶七勺粉末。所述劑量以下列嬰孩平均體重為基礎:六個 月大時，約8千克;十二個月大時，約9.5千克。
[0082] 施用時間
[0083] 本發明的肽的施用時間可為連續的或不連續的。要獲得更持久的效果，優選連續 施用。然而，據推測，不連續模式(例如，在每月某一周內每日施用，或者每施用一周(每日施 用)停用一周)可為幼年哺乳動物或成年哺乳動物帶來積極效果。
[0084] 根據本發明的一個實施方案，對尚未接觸BLG的幼年哺乳動物（"初治受試者"）來 說，據推測，本發明的肽或肽組合的"一次劑量"可足以誘導對BLG的口服耐受性。更一般地 說，建議采用更長的持續時間，例如，在一至三周內每天施用。
[0085]在已接觸BLG的幼年哺乳動物中，優選地采用更長的施用時間。一般來講，雖然預 計采用相對較短的施用持續時間（例如，在一至四周內每天施用）就能得到積極效果，但據 信更長的持續時間能使效果增強(例如，對人類來說三至六個月的持續時間，以及對其他哺 乳動物來說相對應的時間）。
[0086] 對于已對BLG有變態反應的成年哺乳動物而言，可能需要至少一個月的施用時間 才能實現"脫敏"。
[0087] 優選地，施用方式為每日服用（每日服用一次或兩次）或每周服用（每周服用四次 或三次或兩次或一次）。
[0088] 與其他化合物一起施用
[0089] 這些肽可單獨地施用（以其純形式施用，或稀釋于例如水或乳(包括人乳）中），或 與其他化合物(諸如膳食補充劑、營養補充劑、藥物、載體、調味劑、易消化或不易消化的成 分)混合施用。
[0090] 這些肽可例如作為組合物的一部分施用給幼小嬰兒，該組合物為人乳強化劑或其 他營養補充劑。如果要將這些肽施用給成人，則這些肽可作為食物、飲料或膳食補充劑的一 部分施用。這些肽也可在藥物組合物中施用給所有受試者(幼年哺乳動物或成年哺乳動物 等)。
[0091] 根據本發明的一個實施方案，這些肽可加入到或包含在基礎組合物中，該基礎組 合物為用于哺乳動物、特別是人類和寵物的低變應原性組合物。因此，其中添加有或可含有 這些肽的基礎配方食品可為低變應原性(HA)配方食品或非變應原性配方食品，在低變應原 性(HA)配方食品中，乳蛋白被部分水解，而在非變應原性配方食品中，乳蛋白被充分水解， 或被替換為游離氨基酸或牛乳替代品諸如基于大豆的乳品。這種基礎配方食品可例如為用 于具有特定生理/病理狀態的兒童的嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品或營養組合物。
[0092] 在一個實施方案中，基礎配方食品是元素性嬰兒配方食品，并且該基礎配方食品 不包含肽或蛋白質，而僅包含氨基酸。在一個實施方案中，基礎配方食品的蛋白質部分地或 完全地來源于已去除cGMP的甜乳清。在這方面可參見EP880902,其中的一種工藝允許去除 牛乳清中幾乎所有酪蛋白糖巨肽(富含蘇氨酸且色氨酸含量很低的級分），從而提高α-乳白 蛋白比例(色氨酸非常豐富的級分）。通過將該改性甜乳清級分與脫脂乳相結合，同時加入 一些游離L-組氨酸和L-精氨酸（以便達到EC指令所要求的這些氨基酸的最小量），使得根據 本發明的配方具有更接近人乳的氨基酸分布，其特征具體地講在于具有相當的色氨酸和蘇 氨酸水平，從而允許將其蛋白質含量調整為人乳的蛋白質含量。
[0093] 當與上述優化的蛋白質分布一起施用時，應當理解，這些肽可與優化的蛋白質協 同地作用，從而不僅實現口服耐受性的誘導，同時還提供優化的蛋白質營養價值(這可通過 以最適定量方式滿足蛋白質需求來增強這些肽的效果）。
[0094] 當與元素性氨基酸一起施用時，應當理解，這些肽的效果不會因存在潛在變態反 應誘導性蛋白質而被隱匿或抑制。
[0095]可將這些肽例如作為嬰兒配方食品的一部分以每克粉末中50yg-150yg肽的濃度 施用。
[0096] 其中加有這些肽的基礎低變應原性組合物可包含作為氮源的肽或游離氨基酸，尤 其是來自奶牛或山羊或綿羊的乳蛋白，諸如乳清蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、牛血清白 蛋白、酪蛋白酸、酪蛋白酸鹽、或α、β、κ_酪蛋白。氮源可提供總能量的至少7%至25%。
[0097] 維生素和礦物質是典型膳食補充劑的示例。在一個優選的實施方案中，該組合物 與其他化合物一起施用，所述其他化合物能增強對幼年哺乳動物或有變態反應的成年哺乳 動物的免疫力的所述效果。此類化合物可以是協同地或單獨地影響嬰兒的免疫應答并且/ 或者增強這些肽的效果的其他活性化合物，諸如益生菌和益生元。
[0098] 已知的益生菌化合物的示例是芽孢桿菌屬（Bac i 1 1 u s )、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterum)、乳桿菌屬（Lactobacillus)、酵母屬（Saccharomyce)、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus)、屎腸球菌（E.Faecium)、大腸桿菌（E.Coli)Nissle。具體 地講，益生菌和非復制型益生菌，諸如乳桿菌屬、雙歧桿菌屬或它們的組合，例如副干酪乳 桿菌、乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、短雙岐桿菌或它們的組合，以及 這些細菌的應用。
[0099] 已知的益生元化合物的示例是選自如下物質的碳水化合物：菊粉、低聚果糖 (F0S)、短鏈低聚果糖(短鏈F0S)、低聚半乳糖(G0S)、低聚木糖(X0S)、神經節苷脂、部分水解 的瓜爾豆膠(PHGG)、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混合物。可存在其他碳水化合物，諸如與 第一碳水化合物協同作用的第二碳水化合物，其選自低聚木糖(X0S)膠、阿拉伯樹膠、淀粉、 部分水解的瓜爾豆膠或它們的混合物。所述一種或多種碳水化合物可以約lg至約20g存在， 或者以占組合物日劑量的1 %至80 %或20 %至60 %存在。另選地，碳水化合物以干燥組合物 的10%至80%存在。
[0100] 在一個實施方案中，根據W02007/090894(-般教導內容，特別是實施例1)，基礎配 方食品或最終營養組合物包含低聚糖的混合物。其可特別地與G0S聯合使用。基礎配方食品 可提供低聚糖混合物，該低聚糖混合物包含5重量％_7〇重量％的選自6&1嫩(^1，36&101， 4Glc和Gaim，6GalNAcal，3Gaim，4Glc的至少一種N-乙酰化低聚糖、20重量％-90重量％的 選自6&101，6631、63101，663101，461〇63101，663101，661。、63101，363101，361。、63101， 3Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，6Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，3Gaim，4Glc Gaim，3Gaim， 6Gaim，4Glc和Gaim，3Gaim，3Gaim，4Glc的至少一種中性低聚糖，以及5重量％-50重 量％的選自NeuAca2，3Gaim，4Glc和NeuAca2，6Gaim，4Glc的至少一種唾液酸化低聚糖。 [0101 ]在一個實施方案中，基礎配方食品的混合物或最終營養組合物的混合物包含10重 量％-70重量％的指定N-乙酰化低聚糖、20重量％_80重量％的指定中性低聚糖以及10重 量％-50重量％的指定唾液酸化低聚糖。更優選地，該混合物包含15重量％-40重量％的^ 乙酰化低聚糖、40重量％ -60重量％的其他中性低聚糖以及15重量％ -30重量％的唾液酸化 低聚糖。特別優選的混合物包含30重量％的^乙酰化低聚糖、50重量％的中性低聚糖以及 20重量％的唾液酸化低聚糖。
[0102] 另選地，該混合物可適宜地包含5重量％_20重量％的指定N-乙酰化低聚糖、60重 量％-90重量％的指定中性低聚糖以及5重量％-30重量％的指定唾液酸化低聚糖。
[0103] 本發明的低聚糖混合物可由一種或多種動物乳制備。所述乳可得自任何哺乳動 物，特別是得自奶牛、山羊、水牛、馬、大象、駱駝或綿羊。
[0104] 另選地，低聚糖混合物可通過購買并混合單獨的組分來制備。例如，合成的低聚半 乳糖諸如Gaim，6Gaim，4Glc Gaim，6Gaim，6Glc、Gaim，3Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim， 6Gaim，4Glc、Gaim，6Gaim，3Gaim，4Glc和Gaim，3Gaim，6Gaim，4Glc以及它們的混合 物可以商標Vivind?和Elix'Or?商購獲得。低聚糖的其他供應商為Dextra實驗室(Dextra Laboratories)、西格瑪奧德里奇化學有限責任公司（Sigma-Aldrich Chemie GmbH)和協和 發酵工業株式會社(1^0￥3他1^〇1((^7〇(：0.，1^(1)。另選地，可使用特定糖基轉移酶(例如 半乳糖基轉移酶)來生產中性低聚糖。
[0105] 可通過將氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶作用于N-乙酰基葡萄糖和/或N-乙 酰基半乳糖來制備N-乙酰化低聚糖。同樣地，N-乙酰基-半乳糖基轉移酶和/或N-乙酰基-半 乳糖基轉移酶也可用于此目的。N-乙酰化低聚糖還可通過發酵技術使用相應的酶(重組酶 或天然酶)和/或微生物發酵制得。在后一種情況下，微生物可表達其天然酶和底物，或者可 被工程改造成能夠產生相應的底物和酶。可使用單一微生物培養物或混合培養物。可以最 初具有任意聚合度(DP)的受體底物為起始物，逐步聚合(從DP=1開始)形成N-乙酰化低聚 糖。另一種選擇是將游離的己酮糖或與低聚糖(如，乳酮糖)結合的己酮糖(如，果糖)化學轉 化成N-乙酰己糖胺或包含N-乙酰己糖胺的低聚糖，如Wrodnigg，Μ· ; Stutz，A· E · (1999) Angew.Chem. Int .Ed. 38:827_828(Wrodnigg，Τ·Μ·、Stutz，Α·Ε·，1999年，《德國應用化學》， 第38卷，第827-828頁）中所述。
[0106] 可通過層析或過濾技術從天然來源例如動物乳中分離唾液酸化低聚糖，即3'唾液 酸化乳糖和6'唾液酸化乳糖。另選地，也可通過利用特異性唾液酸轉移酶的生物技術方法， 通過基于酶的發酵技術(重組酶或天然酶)或微生物發酵技術來制備唾液酸化低聚糖。在后 一種情況下，微生物可表達其天然酶和底物，或者可被工程改造成能夠產生相應的底物和 酶。可使用單一微生物培養物或混合培養物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受體底物為 起始物，逐步聚合(從DP = 1開始)形成唾液酸化低聚糖。
[0107] 在本發明的一個優選方面，將上述低聚糖混合物摻入食物產品中。在本發明的上 下文中，術語"食物產品"旨在涵蓋任何可食用的物質。因此，"食物產品"可為旨在供人類食 用的產品，特別是嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品、嬰孩食物諸如嬰兒米粉等等。具體地 講，可將本發明的低聚糖混合物摻入嬰兒配方食品、脫水奶粉或米粉混合物中。
[0108] 上述低聚糖以某種方式呈現出增強受試者免疫狀態(上調或下調）的有利效果，使 得受試者更易接收這些肽對口服耐受性的誘導。該增強效果可直接作用于免疫系統或炎癥 途徑，或可通過由低聚糖選擇性地促進的腸益生菌介導。
[0109] 該組合物中可包含一種或多種必需長鏈脂肪酸(LC-PUFA)。可添加的LC-PUFA的示 例為二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。可將LC-PUFA以一定濃度加入，使得它們占 該組合物中存在的脂肪酸的0.01 %以上。
[0110]如果需要，可在營養組合物中包含一種或多種食品級乳化劑;例如，二乙酰基酒石 酸單和雙甘油酯、卵磷脂及單和雙甘油酯，或它們的混合物。相似地，可包含合適的鹽和/或 穩定劑。可將調味劑加入該組合物中。 Com]這些肽可摻入到或存在于如下組合物中：該組合物為適用于未足月產下的嬰兒或 在出生時體重低的嬰兒的嬰兒"早產兒配方食品"、"1段嬰兒配方食品"或"較大嬰兒配方食 品"。在實施例3中給出了此類1段嬰兒配方食品的示例。
[0112] 實施例1:分離和鑒定能夠誘導對BLG的口服耐受性的肽
[0113] 細胞培養
[0114] 為了評估兩種不同人類單核細胞(U937和Thpl)中的MHC受體表達情況，在冰上用 APC綴合的抗HLA_DR(Santa Cruz Biotechnologies(圣克魯斯生物技術公司），clone L243)對細胞染色30分鐘，用補充有0.5%?05(411^1116(1，8丨〇(3〇1^6?丨（百康特公司））的冷1^3 lX(Sigma(西格瑪公司））洗滌兩次，然后在流動分析儀BD Fortessa(BD(碧迪公司））上進行 分析。
[0115] 為了評估MBA-HA嬰兒配方食品對U937和Thpl細胞系的毒性，將細胞與在完全 RPMI1640培養基中復原的各種濃度的BEBA-HA產品（在10mg至lng的范圍內）一起溫育。將細 胞以1 X 106個細胞/mL的濃度接種于24孔板中，在存在5%C02的情況下以37°C溫育24h。將細 胞離心沉降下來，并用補充有〇.5%FCS的PBS IX洗滌兩次，然后用PE膜聯蛋白V細胞凋亡檢 測試劑盒I(BD Pharmingen(碧迪醫藥公司））進行染色。最后，在BD Fortessa(BD(碧迪公 司））上通過流式細胞術對細胞進行分析。結果表明，在實驗所用的劑量下，BEBA-HA對細胞 是無毒的。
[0116] 將Thpl和U937細胞以1X106個細胞/mL的濃度接種于T175cm2(Falcon)中含L-谷氨 酰胺(Sigma(西格瑪公司））且補充有10%熱滅活?03(細;[1]16(1，13;[0001106口1:(百康特公司））和 青霉素/鏈霉素(Sigma(西格瑪公司））的20mL RPMI-1640培養基中，在存在5%C02的情況下 以37°C溫育24小時，所述培養基分別加有lyg/mL和100yg/mL的BEBA-HA(Nestl6(雀巢公 司），批號L02680742AP)。將細胞離心沉降下來，并收集用于進行MHC-肽復合體的免疫沉淀。
[0117] 蛋白質裂解物和免疫沉淀
[0118] 簡而言之，對于所測試的每種條件(對于兩種細胞系，均不在對照中加入BEBA-HA， 而在樣品中加入BEBA-HA)，均將2 X 107個細胞重懸于冰冷TBS中并洗滌三次。然后將細胞沉 淀物重懸于包含1 % CHAPS和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。在裂解后，收集上清液，并與抗 體-PAS微珠混合，該抗體-PAS微珠事先通過如下方式制備:將60μ1的PAS微珠與50yg對HLA- DR分子具有特異性的MHC II單克隆抗體(Clone L243) -起溫育。在4°C下伴隨輕柔振蕩過 夜溫育裂解物和Ab-微珠。在親和捕獲后，將微珠離心沉降下來，并棄去上清液。分別使用如 下條件進行若干次洗滌：lXlmL 1%CHAPS緩沖液，lXlmL 20mM Tris/50mM NaCl，lXlmL 20mM Tris pH 8.0。洗滌后，將200μ1的10%乙酸溶液加入微珠中，溫和地渦旋，然后在70°C 下溫育15min。將微珠在14000g下離心5min沉降下來。重復該步驟一次。將兩次的上清液合 并，然后使用10kDa截留分子量的超濾管(Amicon 1]11:瓜，]/[;[11丨口0代(密理博公司））進行過 濾。將滲余物(主要包含HLA-DR抗體和HLA-DR分子)和濾液(包含HLA-DR呈遞肽)保持在20 °C 下，以用于進一步的LC-MS/MS分析。
[0119] MS 分析
[0120]在MS分析之前，使用反相C18(The Nest group，USA(美國雀巢集團））或混合模式 0ASIS (Water s，USA (美國沃特世公司））脫鹽柱，按照制造商手冊中所述的方法，對HLA-DR肽 進行脫鹽。脫鹽后，使用與Orbitrap XL儀器連接的用于肽分離(2-35%乙腈/0.1%甲酸，在 30分鐘內）的內部Magic C18柱（150 X 0.075mm)，通過納米級LC-MSMS分析肽。使用每次全掃 描含量最高的五種離子的數據依賴性采集技術，選擇肽進行碎片化。開啟動態排除，排除持 續時間為30秒。使用碰撞誘導解離(CID)以35%碰撞能量進行碎片化。最后通過對牛乳數據 庫進行Sequest數據庫搜索，對肽進行鑒定，并且基于光譜質量和得分進行手動驗證。
[0121] 實施例2:強飼nBLG或合成肽、接著以實驗方式致敏的小鼠體內的BLG特異性體液 免疫應答
[0122] /Mj
[0123] 將無特定病原（SPF)的BALB/cJ小鼠（3至4周齡雌鼠 ，Centre d'Elevage Ren6 Janvier，Le Genest Saint-Isle,France(法國勒熱內斯圣伊斯爾的勒內·讓維耶畜牧中 心））圈養在過濾飼養籠中，處于正常SPF飼養條件下(高壓滅菌的墊料和無菌水），馴化兩周 后進行實驗。用適當飲食飼養這些小鼠，所述飲食去除了動物蛋白質，并且使用專門的夾心 免疫測定法未在其中檢出BLG。所有動物實驗根據歐共體動物管理規定進行，并且獲得了 French Veterinary Services(法國獸醫局）的授權91-368。所有實驗均由（Veterinary Inspection Department of Essonne, France(法國埃松省獸醫檢查部門））的協議 N〇.2009-DDSV_074(2009年 10 月 29 日）涵蓋。
[0124] 施用BLG和合成肽的效果
[0125] 給各組小鼠（每組6只或7只）施用4mg的天然牛BLG，或等量（即，0.22μπι〇1)的分離 的合成BLG肽。施用與牛BLG序列編號84-106(Mff 2731Da)對應的0.6mg的合成肽(84-106)或 者與牛BLG序列編號25-107(MW 9440Da)對應的2mg的合成肽(25-107)(n = 7/組）。九只對照 小鼠接受PBS。將合成肽(25-107)和(84-106)稀釋于PBS中。使用動物喂養針(Popper&sons， NY(紐約波普父子公司））以胃內強飼的方式在第1、2、3、8、9和10天進行施用。對照小鼠接受 PBS(陰性對照小鼠，n= 16)。然后在第14天通過腹膜內施用5yg吸附到明礬上的天然牛BLG (錯膠3 %，Superf os，Danemark(丹麥舒泊弗斯公司），lmg/小鼠），使所有小鼠致敏。
[0126] 通過如下方式評估小鼠致敏的效力：在第30-33天之間對處于淺麻醉（異氟烷， Baxter(百特公司））狀態的小鼠從眼窩后靜脈叢采集單獨血清樣品，對該樣品的BLG特異性 IgE抗體進行定量測量。非特異性結合是使用來自10只初次實驗的小鼠的單獨血清來確定， 并且根據用免疫血清測得的吸光度值來推斷的。
[0127] 使用非配對t檢驗及Welch校正進行統計分析，分析表明接受肽(25-107)的小鼠和 PBS組的BLG特異性IgE抗體濃度之間存在顯著性差異(p = 0.04)(參見圖1)。
[0128] 統計分析
[0129] 所有統計分析均使用適用于Windows的GraphPad Pr i sm版本4 · 00 (GraphPad Software，San Diego，CA，USA(美國加利福尼亞州圣地亞哥GraphPad軟件公司））進行。首先 使用Shapiro-Wilk正態性檢驗檢查正態分布，之后再用單因素方差分析和Tukey多重比較 事后檢驗進行統計顯著性的分析。當數據不呈正態分布時，使用Kruskal-Wallis檢驗，然后 使用Dunn多重比較檢驗(DMCT)，來進行非參數檢驗。當p〈0.05時，則視為各組之間存在顯著 差異。使用非配對t檢驗對兩個特定組進行比較，并且對對數轉換數據進行Welch校正，從而 獲得可比較的變異性。
[0130] 實施例3:
[0131] 下面給出了根據本發明使用的嬰兒配方食品的組成的實施例。該組成僅以舉例的 方式給出。
【主權項】
1. 用于誘導哺乳動物對來自奶牛、綿羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐受性的肽或所 述肽的組合，所述肽具有五至十二個氨基酸的氨基酸長度并且包含選自SEQ ID No.1-5的 序列。2. 根據權利要求1所述的肽或肽的組合，其中所述肽或肽的組合還與具有五至十二個 氨基酸的氨基酸長度并且包含選自a、b和c的序列的一種或多種肽相組合。3. 根據權利要求1或2所述的肽或肽的組合，其中所述哺乳動物為人類嬰兒。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的肽的組合，其中所述組合由兩種、或三種、或四 種、或更多種肽組成。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的肽或肽的組合，其中所述一種或多種肽來源于 乳，特別是來源于乳球蛋白。6. 根據權利要求1至5中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以如 下形式存在：（i)水解包含變應原性蛋白，特別是乳球蛋白的蛋白質類物質所得的分離的 肽級分，和/或（ii)合成制備的一種或多種肽。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中在事先、同時或后續用 β-乳球蛋白致敏時，所述肽或肽的組合下調哺乳動物中的IgE表達。9. 根據權利要求1至8中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以 0.4_50ymol/kg體重/天、優選地0.9_40ymol/kg體重/天的劑量施用。10. 根據權利要求1至9中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合每 天施用一次，或每隔一天施用一次，或每隔兩天施用一次，或每周施用一次，并持續至少一 周的時間，優選地至少一個月，更優選地至少三個月。11. 根據權利要求1至10中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合施 用于對牛乳有變態反應風險的嬰兒或兒童，或對牛乳有變態反應的成人。12. 根據權利要求1至11中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合施 用于伴侶動物。13. 根據權利要求1至12中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合以 其純形式施用，或稀釋于水或人乳中，或加入到或包含于作為營養補充劑、人乳強化劑或嬰 兒配方食品的組合物中施用。14. 根據權利要求13所述的肽或所述肽的組合，其中所述組合物為"非變應原性"或低 變應原性組合物。15. 根據權利要求14所述的肽或所述肽的組合，其中所述"非變應原性"或低變應原性 組合物為1段嬰兒配方食品（starter infant formula)、或較大嬰兒配方食品（follow-up infant formula)或成長乳（growing up milk) 〇16. 根據權利要求13至15中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述肽或肽的組合 在組合物中施用，所述組合物包含25-250yg肽/克干燥組合物，優選地50-150yg肽/克干燥 組合物。17. 根據權利要求13至16中任一項的所述肽或肽的組合，其中所述組合物包含另外的 成分或益生元，優選地選自菊粉、低聚果糖（F0S)、短鏈低聚果糖（短鏈F0S)、低聚半乳糖 (G0S)、低聚木糖(X0S)、神經節苷脂、部分水解的瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、大豆膠或它們的混 合物。18. 根據權利要求13至17中任一項所述的肽或所述肽的組合，其中所述組合物包含另 外的成分或益生菌，優選地選自副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei )、乳桿菌 (Lactobacillus)GG、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamno sus )、長雙歧桿菌 (Bif idobacterium longum)、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium 1 act is)以及短雙岐桿菌 (Bifidobacterium breve)〇19. 包含選自序列SEQ ID No.1-5的至少一種肽的組合物用于誘導哺乳動物對奶牛、水 牛或山羊乳蛋白的口服耐受性。20. 根據權利要求19所述的組合物，其中所述奶牛、水牛或山羊乳蛋白為β-乳球蛋白。
【文檔編號】A61K38/08GK105828830SQ201380081636
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2013年12月16日
【發明人】C·布蘭卡特, S·努特恩, A·潘喬德
【申請人】雀巢產品技術援助有限公司