用于含角蛋白的組織的包含溶菌酶水解物的組合物的制作方法
【專利摘要】含有Trp的肽，優選地來自雞蛋水解物，可增加血液血清中的Cys水平。這導致增加的角蛋白產生，并且提升含角蛋白的組織的生長、外觀和/或體積，所述含角蛋白的組織包括皮膚、毛發和/或指/趾甲。
【專利說明】用于含角蛋白的組織的包含溶菌酶水解物的組合物
[0001] 本發明涉及含氨基酸色氨酸（"Trp"）的肽口部制劑用于有益于皮膚組織、毛發和 指/趾甲的產生和維持的用途。所述肽通過增加血液中不同的氨基酸，半胱氨酸（"Cys"）以 及半胱氨酸和谷胱甘肽的濃度來發揮作用。Cys為角蛋白的合成所需，角蛋白是皮膚、毛發 和指/趾甲的合成中的關鍵成分。本發明還涉及肽用于增加血清中的谷胱甘肽的用途。本發 明還涉及提供皮膚有益量的、毛發有益量的和/或指/趾甲有益量的含有Trp的肽的營養補 充劑、食品及其它制劑。
[0002] 發明背景
[0003] 角蛋白是纖維結構蛋白的家族，并且是構成皮膚及毛發和指/趾甲外層的關鍵結 構物質。角蛋白蛋白含大量半胱氨酸(Cys)(約14%)。由于角化細胞不斷脫落和替換，機體 具有大量的生物可利用的Cys對于蛋白質合成而言是重要的。
[0004] Cys被認為是非必需氨基酸，但在一些情況下，例如對于嬰兒、老年人和患有某些 代謝疾病或吸收不良綜合征的個體而言，可認為是必需的。Cys在許多高蛋白質食品包括肉 中容易地可用，但這對于不食用肉的那些個體可能成為問題。在一些地區，可將其作為食品 添加劑(E編號為E920)添加。然而，這樣的添加劑一般不受消費者歡迎，而且許多管理機構 限制或者不允許向食品中添加氨基酸。
[0005] TO2008/052995(DSM IP ASSETS BV，其通過引用并入本文）中描述了雞蛋的被水 解的溶菌酶，其具有大于0.15的Trp/大分子中性氨基酸（"LNAA"）比例，其中LNAA為血漿中 苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的總和。被水解的肽中有許多是含有T r p的二肽或三 肽。該溶菌酶水解物的市售產品形式在DSM Nutritional Products的"LumiVida"下可得。 所述溶菌酶水解物已示出對諸多方面(包括改善情緒和認知)是有益的。
[0006] 使攝入的Cys更為生物可用來有益于含角蛋白的組織，例如皮膚、指/趾甲和毛發 是需要的。
【附圖說明】
[0007] 圖1是示出消耗lumiVida后相對于未處理的溶菌酶攝入的個體dAUC值的圖。對角 線上的點對應于兩者相等的值。對角線上方的點表示與未處理的溶菌酶相比對lumiVida? 具有較高的響應的個體。總而言之，補充lumiVida之后的dAUC顯著高于未處理的溶菌酶攝 入后的dAUC(Wilcoxon檢驗，p = 0 · 0067) 〇
[0008] 圖2是示出消耗lumiVida(被水解的溶菌酶(菱形））、未處理的溶菌酶（正方形）和 未處理的溶菌酶與被水解的溶菌酶的混合物(三角形）之后血漿Trp/LNAA比例的動力學的 圖。繪出了誤差線(標準誤差）。所有的三種處理具有相似的Trp含量。
[0009] 圖3是示出消耗lumiVida(被水解的溶菌酶(菱形））或未處理的溶菌酶(正方形)之 后血漿半胱氨酸值的動力學的圖。繪出了誤差線(標準誤差）。
[0010] 圖4是示出消耗lumiVida(被水解的溶菌酶(菱形））或未處理的溶菌酶(正方形)之 后血漿胱氨酸值的動力學的圖。繪出了誤差線(標準誤差）。
[0011] 圖5示出消耗lumiVida(被水解的溶菌酶(菱形））或未處理的溶菌酶(正方形)之后 血漿谷胱甘肽值的動力學的圖。繪出了誤差線(標準誤差）。
[0012] 圖6是LUMIVIDA的數據表。
[0013] 圖7A和7B是每個個體攝入LumiVida(7A)或未處理的溶菌酶(7B)之后Trp/LNAA比 例變化的時間曲線。在兩幅圖中，個體以相同風格繪出。
[0014] 圖8A和8B是每個個體攝入LumiVida(8A，8C)或未處理的溶菌酶(8B，8D)之后胱氨 酸或半胱氨酸血漿濃度變化的時間曲線。在兩幅圖中，個體以相同風格繪出。
[0015] 圖9A和9B是每個個體攝入lumiVida(9A)或未處理的溶菌酶(9B)之后谷胱甘肽濃 度血漿變化的時間曲線。在兩幅圖中，個體以相同風格繪出。
[0016] 圖10A和10B針對半胱氨酸（半胱氨酸，10A)和胱氨酸（胱氨酸，10B)濃度示出 lumiVida相對于未處理的溶菌酶的個體dAUC值(基線校正值）。對角線上的點對應于兩者相 等的值。對角線上方的點表示與未處理的溶菌酶相比對lumiVida?具有較高響應的個體。總 而言之，lumiVida的dAUC并不顯著高于未處理的溶菌酶dAUC。
[0017] 圖11A和11B針對谷胱甘肽濃度（左圖，11A)和Trp/LNAA比例（右圖，11B)示出 lumiVida相對于未處理的溶菌酶的個體dAUC值(基線校正值）。對角線上的點對應于兩者相 等的值。對角線上方的點表示與未處理的溶菌酶相比對lumiVida?具有較高響應的個體。總 而言之，lumiVida的谷胱甘肽dAUC并不顯著高于未處理的溶菌酶dAUC。然而，lumiVida的 Trp/LNAA比例的dAUC顯著高于未處理的溶菌酶。
[0018] 圖12A和12B針對半胱氨酸（12A)和胱氨酸（12B)濃度示出lumiVida相對于未處理 的溶菌酶的個體AUC值(未校正）。對角線上的點對應于兩者相等的值。對角線上方的點表示 與未處理的溶菌酶相比對lumiVida?具有較高響應的個體。總而言之，lumiVida的AUC并不 顯著高于未處理的溶菌酶AUC，然而，在Wilcoxon檢驗中，胱氨酸AUC幾乎具有顯著性。
[0019] 圖13A和B針對谷胱甘肽濃度和Trp/LANN比例示出lumiVida(13A)相對于未處理的 溶菌酶（13B)的個體AUC值(未校正）。對角線上的點對應于兩者相等的值。對角線上方的點 表示與未處理的溶菌酶相比對lumiVida?具有較高響應的個體。總而言之，lumiVida的AUC 并不顯著高于未處理的溶菌酶AUC。
[0020] 圖14A和B針對半胱氨酸（14A)和胱氨酸（14B)濃度示出lumiVida相對于未處理的 溶菌酶的個體Cmax值。對角線上的點對應于兩者相等的值。對角線上方的點表示與未處理的 溶菌酶相比對1 umi Vi da?具有較高響應的個體。總而言之，1 umi V i da的兩個Cmax顯著高于未 處理的溶菌酶Cmax。
[0021] 圖15A和B針對谷胱甘肽（左圖；15A)和Trp/LNAA比例（右圖；15B)示出lumi Vi da相 對于未處理的溶菌酶的個體Cmax值。對角線上的點對應于兩者相等的值。對角線上方的點表 示與未處理的溶菌酶相比對lumiVida?具有較高響應的個體。總而言之，lumiVida的兩個 Cmax值顯著高于未處理的溶菌酶Cmax。

【發明內容】

[0022]根據本發明已發現，包含含有Trp的肽的雞蛋溶菌酶水解物具有增加半胱氨酸生 物利用度的有益特性。使用雞蛋的未處理的溶菌酶未觀察到該效果。因此，本發明涉及增加 血液血清中的Cys量的方法，所述方法包括施用包含含有Trp的肽的雞蛋溶菌酶水解物。隨 著血液中Cys水平的增加，實現了許多后續優點，并且這些優點也構成本發明的一些實施方 案。
[0023]本發明的另一發現是雞蛋溶菌酶水解物還可增加谷胱甘肽（"Glu"）水平。因此，本 發明的另一實施方案是雞蛋溶菌酶用于增加至少一種組織中的谷胱甘肽水平的用途。 [0024]在優選的實施方案中，含有Trp的肽為二肽和/或三肽，例如在來自DSM Nutritional Products，瑞士的市售溶菌酶水解物例如LUMIVIDA 5;中發現的那些。 [0025] 增加血液中的Cys水平
[0026] 本發明的一個實施方案是溶菌酶水解物用于增加機體中的半胱氨酸的量的用途。 胱氨酸是通過經二硫鍵共價連接的兩個半胱氨酸(Cys)分子的氧化形成的氨基酸。人毛發 和皮膚包含按質量計約10%至14%的半胱氨酸。胱氨酸可以快速轉化為Cys。因為胱氨酸到 Cys的（以及逆向的）反應容易，所以胱氨酸的營養益處與Cys相同。此外，胱氨酸充當胱氨 酸-谷氨酸反向轉運體的底物。對Cys和谷氨酸具有高度特異性的該轉運系統用于增加細胞 內的胱氨酸濃度。胱氨酸的陰離子形式迅速還原成Cys。Cys前藥(例如乙酰基半胱氨酸)增 加谷氨酸至胞外空間的釋放。
[0027] 因此，本發明的另一方面是向期望增加至少一種組織中的胱氨酸濃度或獲得本文 所公開的增加半胱氨酸的益處中至少之一的人施用溶菌酶水解物。
[0028]因此，本發明的溶菌酶水解物，通過增加 L-半胱氨酸水平，具有在機體各處的其他 效應。例如，可以幫助減輕變態反應、痤瘡、皮膚曬傷、慢性支氣管炎和肺氣腫的效應。對于 導致產生痰的變態反應，半胱氨酸的存在可斷開致使粘液中的膠原聚集的鍵，分泌物更易 流動并因而更易于排出。
[0029] 本發明的溶菌酶水解物有助于防止皮膚被陽光曬傷。半胱氨酸有助于形成維持 P53活性的酶。p53路徑啟動導致潛在癌細胞經歷凋亡的一系列事件。半胱氨酸對于半胱氨 酸蛋白酶的形成也是重要的，其分解死細胞。
[0030] 本發明的溶菌酶水解物還可用于治療或緩解痤瘡，優選地與維生素 B5(泛酸）一 起。半胱氨酸有助于機體吸收維生素 B5。
[0031] 因此，本發明的另一方面是向期望增加其毛發和/或皮膚中的胱氨酸濃度或獲得 增加胱氨酸的前述益處的人施用溶菌酶水解物。
[0032] 角蛋白產生
[0033] 因為Cys是蛋白質角蛋白的制備中的關鍵氨基酸，本發明的另一方面是通過向人 提供角蛋白增加有效量的包含含有Trp的二肽和三肽的雞蛋溶菌酶水解物來提升角蛋白產 生的方法，所述人期望提升他/她的毛發、皮膚、表皮、指/趾甲或其它含角蛋白的組織的外 觀，或由于缺少足夠角蛋白（例如由于編碼角蛋白的基因突變)遭受不利的健康狀況。本發 明的另一實施方案是雞蛋溶菌酶水解物用于提升角蛋白的制備從而提升皮膚、毛發、表皮、 指/趾甲或其它含角蛋白的組織的外觀的用途。本發明的另一實施方案是雞蛋水解物用于 制造用于在經歷角蛋白缺乏的人中提升角蛋白制備的藥物或營養物的用途，所述角蛋白缺 乏例如在皮膚脆性障礙或多發性皮脂囊腫(一種良性的、常染色體顯性先天病癥，其在人體 導致多個囊腫）中。
[0034] 提升含角蛋白結構的外觀
[0035] 本發明的另一方面是提升毛發、皮膚、表皮和/或指/趾甲的外觀的方法，所述方法 包括向期望提升他/她的毛發、皮膚、表皮和/或指/趾甲外觀的人提供毛發、皮膚、表皮和/ 或指/趾甲提升有效量的包含含有Trp的二肽和三肽的雞蛋溶菌酶水解物。
[0036]本發明還涉及用于期望提升他/她的毛發、皮膚、表皮或指/趾甲外觀的人的包含 含有Trp的二肽和三肽的雞蛋溶菌酶水解物的用途。其還涉及包含含有Trp的二肽和三肽的 雞蛋溶菌酶水解物用于增加角蛋白的產生的用途。本發明還涉及雞蛋溶菌酶水解物在制備 增加血液血清中的Cys量、提升角蛋白生物合成或提升毛發、皮膚或指/趾甲外觀的藥物、營 養物、食品或食品補充劑中的非治療用途。
[0037] 增加谷胱甘肽
[0038] 本發明的另一方面是上述溶菌酶水解物用于增加谷胱甘肽濃度的用途。其還涉及 通過攝入前述雞蛋溶菌酶水解物增加血液中的谷胱甘肽水平。L-半胱氨酸是機體最重要的 抗氧化劑之一谷胱甘肽的基本構建單元。谷胱甘肽有許多功能，包括保護DNA免受氧化損 傷、解毒重金屬、心血管系統支持(尤其是關節硬化）、多種癌癥和免疫系統支持。其還通過 供應充分的維生素 C和維生素 E發揮作用，因為其行使抗氧化功能。
[0039] 因而，增加的谷胱甘肽利用度意味著各種人群可受益于使用溶菌酶水解物，包括：
[0040] 希望改善肌肉質量(muscle mass)的那些一例如健身者及其他健身愛好者以及經 歷肌肉萎縮(例如肌肉衰減綜合征)的那些人。肌肉萎縮常常伴隨著其中患者因延長的時間 (即超過約2周)不動而失去肌肉質量的其他病癥/疾病。
[0041 ]希望改善消化的那些人，因為已知谷胱甘肽保護胃黏膜。
[0042] 試劑盒
[0043] 本發明的另一方面是營銷溶菌酶水解物的方法，所述方法包括提供試劑盒，所述 試劑盒包含：
[0044] a)多劑量的溶菌酶水解物;和
[0045] b)告知消費者所述溶菌酶水解物的健康益處的信息，所述健康益處選自包含以下 的組：
[0046] 對毛發的益處、對皮膚的益處、對指/趾甲的益處、對痤瘡的益處、對慢性支氣管炎 和/或肺氣腫的益處、對解毒重金屬的益處、對關節硬化的益處、對維生素 A或C缺乏的益處 和對肌肉質量的益處。
[0047] c)任選的其它信息，其選自包含以下的組：
[0048] 在b)中未提及的給藥方案、有效期限和額外益處。
[0049] 劑量
[0050] 劑量
[0051] 用于增加血液中半胱氨酸、半胱氨酸和/或谷胱甘肽的劑量應為成人至少0.5克水 解物/天，并且可延伸至大劑量，例如超過10克/天。優選的量為〇. 5克至約7.5克水解物/天， 優選約1克至約6克/天。
[0052]每天消耗該蛋白質水解物一次或兩次以獲得急性效應。在另一優選實施方案中， 所述蛋白質水解物以至少6小時的給藥間隔、優選不超過18小時的給藥間隔每天消耗兩次。 在更優選的實施方案中，所述劑量以約12小時的間隔消耗，例如早晨和傍晚。如果需要的 話，每天還可以消耗額外的劑量，例如2至8克含有Trp的蛋白質水解物/天，并且這些劑量可 以被認為具有其它益處。另外的劑量為至多6克/天。另外的劑量為至多8克/天。另外的劑量 為低于6克/天，但至少1克/天。還包括1至3克/天的劑量。大于10克的含有Trp的蛋白質水解 物/天的劑量也是有效的，但不是優選的因為可能存在品嘗問題。
[0053]在另一實施方案中，該劑型還可在延長的時間段每天多次施用，使得人接受10至 100mg Trp每天，優選25至70mg Trp每天。在一個優選實施方案中，人接受1克水解物/天，其 含有總計62至64mg Trp。在另一優選實施方案中，人接受0.5克Trp-水解物/天，其含有總計 20至26mg Trp。在另一實施方案中，人接受多個這些劑量，使得每天的Trp總量為25至 1 OOOmg，優選 50 至800mg，更優選 60 至600mg。
[0054]除了日常美容護理之外，還應為毛發和指/趾甲提供正確的營養物以保持強韌和 健康。健康的毛發自然地有光澤且強韌。毛囊和毛球中的營養物對于健康毛發的產生和生 長以及對強韌的毛發結構、光澤度、顏色和彈性是必要的。健康毛發生長需要廣泛多種的微 量營養素和維生素。毛發反映機體和營養物缺乏的總體情況。
[0055] 強韌的指/趾甲也需要適當的微量營養素。軟或脆的手指甲可在機體出現癥狀之 前披露營養物缺乏。指/趾甲由蛋白質、角蛋白構成，并且持續生長，因此從內部持續供應正 確的成分支持指/趾甲結構并促進有吸引力的、強韌的指/趾甲的生長。
[0056] 美麗的毛發自然地飽滿、強韌且有光澤。毛發健康依賴于血液供應、循環、激素、應 激水平和營養。強韌的毛發紋理需要必要營養物以支持發根細胞的生長并使毛發充滿活力 和生命力。構成毛發的物質一例如維生素及其他微量營養素一支持這樣的生物過程，所述 生物過程提供強韌毛發紋理和毛發的光澤、堅度和彈性的維持。
[0057] 角蛋白是皮膚、毛發和指/趾甲的主要結構成分。角蛋白絲大量存在于表皮角質層 的角質細胞中；這些為經歷角質化的細胞。此外，角蛋白絲一般存在于上皮細胞中。角蛋白， 也描述為細胞角蛋白，是I型和II型中間絲的聚合物。角蛋白分子通過分子內氫鍵和分子間 氫鍵保持在一起。此外，角蛋白具有大量的含硫氨基酸半胱氨酸，所述半胱氨酸為通過持久 的、熱穩定鍵賦予額外強度和硬度的二硫鍵所需。與哺乳動物手指甲中的角蛋白相比，更具 柔性和彈性的毛發角蛋白具有較少的鏈間二硫鍵。
[0058]人毛發具有約14%的半胱氨酸。毛發及其他α_角蛋白包含α_螺旋盤繞的蛋白質單 鏈(具有常規鏈間Η-鍵合），所述蛋白質單鏈隨后進一步旋轉成可進一步盤繞的超螺旋繩狀 物。含硫氨基酸半胱氨酸天然存在于食品中，并且還可通過機體由氨基酸甲硫氨酸制備。
[0059] 在半胱氨酸的產生中，甲硫氨酸轉化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，其繼而轉化為高半 胱氨酸。然后高半胱氨酸與絲氨酸反應形成半胱氨酸。
[0060] 推薦的每日攝入量(DRI)*
[0061] 年齡為1歲或更大的所有個體消耗25毫克半胱氨酸加甲硫氨酸(組合)/1克食品蛋 白質
[0062]對每個年齡和性別組的推薦，假設RDA水平蛋白質攝入和50%的含硫氨基酸需要 由半胱氨酸提供：
[0063] 1至3歲兒童：163mg半胱氨酸
[0064] 4至8歲兒童：238mg半胱氨酸
[0065] 9至13歲男性:425mg半胱氨酸
[0066] 14至18歲男性:650mg半胱氨酸
[0067] 19歲及更大男性:700mg半胱氨酸
[0068] 9至13歲女性:425mg半胱氨酸
[0069] 14歲及更大女性:575mg半胱氨酸
[0070 ]孕期或哺乳期女性:888mg半胱氨酸
[0071] 本發明的蛋白質水解物可代替多種天然來源的半胱氨酸，包括這些：
[0072]
本發明的蛋溶菌酶水解物中的生物活性肽遞送高生物利用度的氨基酸以滋養皮 膚、毛發和指/趾甲。本發明的蛋溶菌酶水解物中的高含量半胱氨酸(6.2%)為角蛋白遞送 構建單元，所述角蛋白為皮膚、毛發和指/趾甲的關鍵結構組分。因此，本發明的蛋溶菌酶水 解物可用作有價值的飲食來源以滿足推薦的每日攝入量。其對顯著缺乏半胱氨酸來源的節 食者和素食者尤其有價值。
[0074] 2g本發明的蛋溶菌酶水解物提供13%的半胱氨酸DRI。
[0075]本發明來自蛋溶菌酶水解物的半胱氨酸是生物可利用的。消費者尤其是素食者需 要半胱氨酸補充劑：
[0076] "我是素食者，不食用動物產品。因為我需要每日控制我的飲食來保持苗條，我總 是在尋找幫助我獲得足夠營養物以維持我的皮膚健康、我的毛發有光澤的產品。"
[0077]因此，本發明的另一實施方案是溶菌酶水解物用于攝入以蛋為基礎的產品的素食 者獲得本文公開的多種益處的用途，所述益處例如增加半胱氨酸和谷胱甘肽水平和提升皮 膚、指/趾甲和/或毛發的外觀。本發明的另一方面是補充需要提升半胱氨酸的攝入蛋的素 食者的飲食的方法，所述方法包括施用蛋溶菌酶水解物。
[0078]示出以下非限制性實例以進一步說明本發明。
[0079] 實施例1 [0080] 臨床試驗 [0081 ] 基本原理：
[0082] lumiVida?是溶菌酶的水解形式，來自雞蛋的蛋白質。已表明lumiVida?具有情緒 改善特性，這是由于如下事實，其富含色氨酸(Trp)，色氨酸是作為血清素合成底物的氨基 酸。在目前的研究中，我們希望在4小時的餐后時間就人的Trp血漿水平(及來自大分子中性 氨基酸LNAA類別的其他成員)對未處理的溶菌酶和被水解的溶菌酶進行比較。此外，對消耗 lumiVida?或未處理的溶菌酶的對象經相同時間段的氨基酸半胱氨酸、二氨基酸胱氨酸(通 過導致二硫鍵的兩個半胱氨酸的氧化形成）以及含有半胱氨酸的三肽谷胱甘肽進行研究。 [0083]目的：
[0084] 一評估單個處理之后血漿Trp/LNAA比例的時間動力學
[0085] (1)lumiVida?，（2)未處理的溶菌酶或（3)lumiVida?和未處理的溶菌酶的30/70 摩爾百分比Trp混合物。
[0086] 一評估消耗lumiVida?或未處理的溶菌酶后半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的血漿 動力學。
[0087]研究設計：
[0088]該研究根據隨機、雙盲、交叉設計進行。
[0089] 研究群體：
[0090] 15位兩種性別的年齡在18至70歲之間的健康志愿者
[0091] 介入：
[0092]飲品包含
[0093] -6g lumiVida?,
[0094] 一 6g未處理的溶菌酶或
[0095] 一 30摩爾百分比lumiVida?形式的Trp和70摩爾百分比溶菌酶形式的Trp的組合。 [0096]主要研究端點：
[0097] 一消耗各研究化合物之后的Trp/LNAA時間曲線的Tmax
[0098] 一消耗lumiVida?、未處理的溶菌酶或組合之后血漿Trp的AUCo-24(辦中
[0099] 一消耗lumiVida?或未處理的溶菌酶之后半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的 AUC〇-24 辦中
[0100] 一消耗lumiVida?或未處理的溶菌酶之后半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的Cmax
[0101] 設計、群體和處理 [0102] 一設計
[0103] 該研究遵循隨機、雙盲、交叉設計。認為安慰劑無必要，因為在每個研究日獲取基 線(t = 0)測量結果。此外，主要的研究問題涉及不同活性處理的比較。
[0104] 一群體
[01 05 ] 15位給出手寫的知情同意書的年齡在18至70歲之間的健康男性或女性對象。
[0106] 一排除標準：
[0107] -孕期女性或未使用醫學上接受的避孕方法的有生育可能的性活躍女性；
[0108] -慢性疾病和當前疾病，由研究者判斷；
[0109] -精神疾病史；
[0110] 一使用"選擇性血清素再吸收抑制劑"（SSRI);
[0111] -使用靶向中樞神經系統的補充劑，例如含色氨酸、麻黃素或圣約翰草補充劑(st John's wart)的補充劑；
[0112] -蛋過敏
[0113] 一藥物濫用
[0114] -同時參與涉及研究的產品或營銷的產品的任何其它研究
[0115] -不耐受人工甜味劑
[0116] 一干擾胃腸功能的任何胃腸疾病(或胃腸疾病史），由研究者判斷 [0117] 一使用靶向胃腸道的藥物，例如解酸劑 [0118] -研究的產品：
[0119] 飲品包含6g lumiVida?或6g未處理的的溶菌酶或30摩爾百分比lumiVida?形式 的Trp和70摩爾百分比溶菌酶形式的Trp的組合。這三種不同情形在帶吸管的瓶中呈現為無 菌飲品。所有飲品含0. l〇g甜味劑(安賽蜜)并添加淡水(plain water)以達到300mL飲用體 積。
[0120] 溶菌酶:一種雞蛋來源的蛋白質。溶菌酶富含Trp。其天然存在于未以任何方式被 改變的食品蛋白質中。事實上，溶菌酶的氨基酸總含量使其在營養上是非常全面的蛋白質。
[0121] lumiVida?:被水解的溶菌酶。lumiVida?是水解形式的溶菌酶。在食品工業中常 常進行肽水解以減輕變應原性(例如，針對嬰兒食品配方）、改善應用性質（例如，與大多數 未處理的蛋白質不同，水解物在水中產生清夜)或促進消化(例如，用于運動營養）。該水解 涉及用食品級酶進行酶促處理。就其本身而論，在美國，水解物具有GRAS身份(一般認為安 全，Generally Recognised As Safe)，而在歐盟食品立法下不認為是新型食品。產品數據 表附于圖6。
[0122] 研究規程
[0123] 該研究根據隨機、雙盲、交叉設計進行。處理之間的清除期為至少3天。不需要安慰 劑，因為在消耗每種產品之前獲得基線值，并且預期血漿氨基酸水平不經歷安慰劑效應。所 述研究由四次訪問組成。在簽署知情同意書后的首次訪問時，檢查資格標準，并預約早晨實 驗期。
[0124] 在三次早晨實驗期期間，對象在禁食至少8小時后于8am與9am之間訪問場所。將用 于抽血的柔性插管插入對象的非慣用前臂。然后，他們攝入實驗飲品之一。在攝入之前及在 攝入之后t = 15、30、60、90、120、180、210和240分鐘，取血樣以測量不同蛋白質來源對血漿 Trp/LNAA比例及對一些其他氨基酸濃度的影響。在這240分鐘內不允許攝入除水之外的任 何食品或飲品。
[0125] 血樣由CRO "Ampha BV"，Ni jmegen(Ampha BV，Toernooi veld 220，6525 EC Nijmegen)獲取。根據第C2529號分析方法(method of analysis No C2529)內部文件在DSM Food Special ties進行氨基酸測量。該方法描述了用于測定氨基酸的HPLC規程。試驗原則 基于氨基酸的手性分離。采用基于熒光的檢測。
[0126] 血漿測量
[0127] 對于血液中Trp和LNAA的測定：在鋰肝素血液試管中收集約5ml血液，震蕩并立即 置于冰上。然后離心該樣品并將750μ1血漿與5-SSA(4mg/100ml血漿)混合。將這些溶液以 13000RPM離心5分鐘，并向20μ1上清液中添加40μ1內標（160mga-氨基-己二酸在2升1.2mM HC1 中）。添加50μ1 硼酸鹽緩沖液(包含在Waters AccQ.ag kit art nr. 186003836中）、40μ1 0.4M NaOH和20μ1 試劑（包含在Waters AccQ.ag kit art nr. 186003836中），混合，并于55 °C加熱10分鐘。然后，將ΙμL注入柱，并按照Boogers等人，Journal of Chromatography A， 1189 (2008) 406- 409中所述進行分析。
[0128] 對于測定血液中的半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽：以14000RPM離心血液血漿樣品 10分鐘。將1〇μ1血液血漿上清液與90μ1 0.1 N HC1和?οομL標記的內標溶液(標記的半胱氨 酸（（1]-1303;15幻、(：11^〇見]\1-3871-?1〇、胱氨酸（3,3'-13〇、(：11^0^-52〇-〇)和谷胱甘肽 ((甘氨酸-13C2; 15Ν)、CIL、CLM-6245)的混合物)混合。混合之后，將2μ1注入柱。
[0129] 統計考慮
[0130] 描述統計學
[0131] 分析每個時間點的血漿樣品的Trp和LNAA (即，Va 1、11 e、Leu、Tyr和Phe的和)水平。 將所得Trp/LNAA比例針對介入產品消耗后的時間繪圖。對處理的Trp/LNAA時間曲線（Trp/ LNAA AUC)下方的所得面積之間的差異進行統計學檢驗。
[0132] 進一步分析每個時間點的血漿樣品的半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的水平。將這 些濃度針對消耗介入產品未處理的溶菌酶和lumi Vi da (但非混合物)后的時間繪圖。計算該 曲線下方的所得面積并與不同介入產品進行統計學比較。同樣計算Cmax并與不同介入產品 進行統計學比較。
[0133] 單變量統計學
[0134] 利用學生t-檢驗評估處理對UPAUC血漿Trp/LNAA-時間曲線的影響的顯著性。 利用Wilcoxon檢驗以顯著性閾值p〈0.05對半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽參數進行統計學評 估。
[0135] 莖里
[0136] TRP/LNAA 比例
[0137] 針對三種不同處理，血漿Trp/LNAA比例作為時間的變量描繪于圖2中。全部三種處 理產生Trp/LNAA比例的增加。在消耗溶菌酶水解物（lumiVida?)后觀察到了最快（15分鐘 內）和最陡的增加。未處理的溶菌酶產生慢得多的Trp/LNAA比例增加，而Trp/LNAA比例隨時 間的降低也慢得多。未處理的溶菌酶和被水解的溶菌酶的混合物產生中間結果。在"重復測 量"分析中，全部三種處理通過時間相互作用示出顯著不同的處理(P〈〇.001)，表明全部三 條曲線具有顯著不同的形狀。值得注意的是全部三種產品產生類似的AUC值，表明溶菌酶水 解物和未處理的水解酶二者以相似程度被帶入血液中（表1)。通過從原始AUC中減去基線 AUC(基線*240分鐘）來計算dAUC。與未處理的溶菌酶相比，lumiVida?具有顯著較高的dAUC (Wilcoxon檢驗，p值0.0067，圖1)。就原始AUC而言，lumiVida?與未處理的溶菌酶沒有顯著 性差異。
[0138] 表1
[0139]
[0140] ~示出了Trp/LNAA比例的基線校正AUC的平均值和標準差。
[0141] 其他氨基酸的參數
[0142] 圖3、圖4和圖5描繪了就lumiVida?和未處理的溶菌酶而言，半胱氨酸、胱氨酸和谷 胱甘肽隨時間進程的血漿水平。利用Wilcoxon檢驗以顯著性閾值p〈0.05來對參數進行統計 學評估。對于半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽，未處理的溶菌酶與lumiVida?處理之間的基線 值不具有顯著差異(下表2)。處理之間0至240分鐘曲線下方的面積不具有顯著性差異，但就 數值而言，lumiVida?的全部三個參數較高（下表2)。就全部三個參數而言，lumiVida?的 Cmax顯著高于溶菌酶(半胱氨酸p = 0.0039，胱氨酸p = 0.0034和谷胱甘肽p = 0.0053)(表2)。 lumi Vi da?的動力學特性增加比溶菌酶更迅速，導致較高的Cmax。原始數據總結于圖7至15 中。
[0143] 過塗
[0144] 在該研究中，我們提供了這樣的數據，攝入溶菌酶水解物lumiVida?比未處理的蛋 白質更有益于提高Trp/TNAA比例。我們可以證實，血液血漿中該比例的增加更大 (lumiVida?的Cmax值高于未處理的溶菌酶）。此外，與未處理的溶菌酶相比，攝入lumiVida? 之后的基線校正的AUC(其將基線的每日（個體)變化納入考慮)也更大。這些發現表明，來自 被水解的蛋白質lumiVida?的Trp可更迅速地被帶入血液系統并且比未處理的溶菌酶達到 更高的程度。因為lumiVida?和未處理的溶菌酶包含相同量的Trp，可預期血液系統中Trp的 暴露將相似。然而，因為我們的數據示出lumiVida?的dAUC高于未處理的溶菌酶，來自未處 理的溶菌酶的一些Trp將不會進入血液系統。因為需要更多時間來消化未處理的溶菌酶，被 水解的片段可能被腸細菌吸收，因此可能對于血液系統不再可用。lumiVida?與未處理的溶 菌酶的混合物具有中間響應。
[0145] 另一發現是攝入lumiVida?之后半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的Cmax血漿值顯著增 加。這些增加還反映上述報道的Trp/LNAA比例的顯著增加。在攝入lumiVida?和未處理的溶 菌酶后，這些氨基酸的血漿AUC非常相似，并且在統計學上不具有顯著性差異。這反映出與 攝入未處理的溶菌酶之后相比，攝入水解物lumiVida?之后氨基酸更迅速地進入血液。然 而，對于兩種化合物，暴露于血液的總氨基酸相似，因為AUC相似。假設效力取決于某些氨基 酸在血液中達到最小閾值水平來開始其效應，那么預期攝入lumiVida?比攝入未處理的溶 菌酶更有益。
[0146] 表2
[0147] 參數.（平均.值)： lumiVida 溶菌酶. 半胱氨酸 Cm;lx l.%(2Af SMl-Ψ 基線值 6S7J) 33(0.8) 33(0.7) AUC (SD) \<dT〇3(249.0) 999.1(244,4) N 15 14 脒氨酸 C腿（.SD； 61.0(?). /尸 50.4i6.7r- 基線值(??) 48.3f^J； 44.4(8.6) AUC (SD) mm.9(2019.2) 10726.1(1769.1) N 15 15 谷胱甘肽 Cm;,x(57)y \.W.6f \A(0.4f' 基線值(SO) 1.0(0.4) \ .0(0.4) AUC (SD) l>mX)(96.0) 255.1(90.8) N 15 14
[0148] 示出了半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的Cmax、基線值和AUC的平均值。
[0149] *p-值〈0.05。
【主權項】
1. 一種提升含角蛋白的組織的生長、外觀和/或體積的方法，其包括： 向需要或期望提升皮膚、毛發或指/趾甲的人或動物施用皮膚提升量的、毛發提升量的 或指/趾甲提升量的含有Trp的妝。2. 根據權利要求1的方法，其中所述含有Trp的肽是溶菌酶水解物。3. 根據權利要求2的方法，其包括每天施用0.5克至7.5克水解物。4. 根據權利要求3的方法，其包括每天施用1克至約6克。5. -種增加血液血清中Cys或谷胱甘肽的生物利用度的方法，其包括： 向需要或期望增加血液血清中Cys的生物利用度的人或動物施用足夠量的含有Trp的 肽。6. 根據權利要求5的方法，其中所述含有Trp的肽是溶菌酶水解物。7. 根據權利要求6的方法，其包括每天施用0.5克至7.5克水解物。8. 根據權利要求7的方法，其包括每天施用1克至約6克。9. 含有Trp的肽用于提升含角蛋白的組織的生長、外觀和/或體積的用途，所述含角蛋 白的組織包括皮膚、毛發或指/趾甲。10. 根據權利要求9的方法，其中所述含有Trp的肽是溶菌酶水解物。11. 根據權利要求9或10的方法，其包括每天施用0.5克至7.5克水解物。12. 根據權利要求9至11中任一項的方法，其包括每天施用1克至約6克。13. 含有Trp的肽用于增加血液血清中Cys的生物利用度或用于增加角蛋白產生的用 途。14. 含有Trp的肽用于制造用于提升皮膚、毛發或指/趾甲的生長、外觀和/或體積的藥 物或營養物的用途。
【文檔編號】A61Q19/00GK105828829SQ201480068362
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年11月28日
【發明人】瑞珍娜·格拉齊克, 漢森·穆哈耶里, 喬納斯·威特·斯齊格
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司