脂肪酸組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發明申請是基于申請日為2012年7月20日、申請號為201280035948.X(國際申請 號為PCT/US2012/047731)、名稱為"脂肪酸組合物"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 和本申請一起提交的電子遞交序列表（"sequencelisting.txt，5,136字節，2011 年7月20日創建"）的內容W其整體通過引用并入本文。
技術領域
[0003]本發明設及經分離微生物W及其菌株和突變體、生物質、微生物油、組合物和培養 物;生產微生物油、生物質和突變體的方法;和使用經分離微生物、生物質、培養物和微生物 油的方法。
【背景技術】
[0004]基于碳鏈的長度和飽和特征，將脂肪酸分類。基于鏈中存在的碳數目，脂肪酸被稱 為短鏈、中等長度鏈或長鏈脂肪酸；當碳原子之間不存在雙鍵時稱為飽和脂肪酸，當存在雙 鍵時被稱為不飽和脂肪酸。當僅存在一個雙鍵時，不飽和長鏈脂肪酸是單不飽和的，當存在 多于一個雙鍵時，是多不飽和的。
[000引基于脂肪酸的甲基端的第一個雙鍵的位置，將多不飽和脂肪酸(PUFA)分類：ω-3 (η-3)脂肪酸在第Ξ個碳處含有第一個雙鍵，而ω-6(η-6)脂肪酸在第六個碳處含有第一個 雙鍵。例如，二十二碳六締酸r'DHA")是具有22個碳的鏈長度和6個雙鍵的ω-3長鏈多不飽 和脂肪酸化C-PUFA)，通常命名為"22: 6η-3"。其他ω-3LC-PUFA包括二十碳五締酸ΓΕΡΑ")， 命名為"20: 5η-3"、ω-3二十二碳五締酸r'DPAη-3")，命名為"22: 5η-3"。0齡和ΕΡΑ已被稱 作"基本'脂肪酸。ω-6LC-PUFA包括花生四締酸TARA")，命名為"20: 4η-護和ω-6二十二碳 五締酸r'DPAη-護），命名為"22: 5η-護。
[0006]由于位于細胞膜中，ω-3脂肪酸是影響細胞生理功能的重要的生物學分子，它能 調節生物活性化合物的產生與基因表達，并起到生物合成底物的作用。Roche，Η.Μ.， Proc.Nu化.5〇。.58:397-401(1999)。例如，0齡在人類大腦皮層中構成約15%至20%的脂 質，在視網膜中構成30%至60%的脂質，在睪丸與精子中富集，并且是母乳中的一個重要組 分。Berg自，J.P.和Barnathan'G..Adv.Biochem.Eng.Biotechno1.96:49-125(2005)oDHA在 腦中構成至多97%的ω-3脂肪酸，且在視網膜中構成至多93%的ω-3脂肪酸。此外，DHA是 胎兒與嬰兒發育W及維持成人認知功能所必需的。（參考文獻同上。）因為在人體中無法從 頭合成ω-3脂肪酸，因此運些脂肪酸必須從營養來源獲取。
[0007]亞麻仁油與魚油被認為是良好的ω-3脂肪酸膳食來源。亞麻仁油不含有Ε Ρ A、 DHA、DPA或ARA，但卻含有亞麻酸(C18:3n-3)，其是使機體能夠制造EPA的一種結構單元。然 而有證據顯示代謝轉換的速率緩慢且多變，特別在健康不佳的那些個體中。根據具體的種 及其飲食，魚油在脂肪酸組成的類型與水平方面存在顯著的差異。例如，與野生魚類相比， 水產養殖所飼養的魚的ω-3脂肪酸水平較低。此外，魚油具有含環境污染物的風險，并且可 能與穩定性問題和魚的腥臭或味道有關。
[000引破囊壺菌是破囊壺菌目（Τ虹austochyhiales)的微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌 屬（Schizochy1:;rium)與破囊壺菌屬（Thraustochy1:;rium)的成員，并且已經確認為包括DHA 與EPA在內的ω-3脂肪酸的一種替代來源。參見第5130242號美國專利。與相應的魚油或微 藻油相比，由運些海生異營性微生物所生產的油通常具有較簡單（simpler)的多元不飽和 脂肪酸譜(profiles)sLewis,Τ.Ε.iMar.Biotechnol. 1:580-587(1999)。已報導破囊壺菌種 的菌株所生產的ω-3脂肪酸，在該生物體所生產的總脂肪酸中占很高的百分比。第5130242 號美國專利；Huang，J.等的J.Am.Oil.Chem.Soc. 78 :605-610( 2001) ;Huang，J.等的 Mar.Biotechnol. 5:450-457(2003)。然而，分離的破囊壺菌在所生產的LC-PUFA的種類和量 方面不同，運使得一些先前所述的菌株在培養中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或 會表現低的生產力。因此，一直存在對展現出高生產力和所期望的LC-PUFA分布的微生物的 分離的需求。

【發明內容】

[0009 ] 本發明設及WATCC登錄號ΡΤΑ-10212保藏的種的經分離的微生物。
[0010] 本發明設及具有WATCC登錄號ΡΤΑ-10212保藏的種的特征的經分離的微生物。
[0011] 本發明設及包含下述18srRNA的經分離的微生物，所述18srRNA包含沈QIDNO: 1多核巧酸序列或與SEQIDNO: 1具有至少94%同一性的多核巧酸序列。
[0012] 本發明設及包含18srRNA多核巧酸序列的經分離的微生物，所述18srRNA多核巧 酸序列與WATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物的18srRNA多核巧酸序列具有至少94%同 一性。
[0013] 本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的經分離的微生物，其中由微生物 生產的總脂肪酸包含W重量計超過約10%的二十碳五締酸。
[0014] 本發明設及具有WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的特征的經分離的微生物，其 中由微生物生產的總脂肪酸包含W重量計超過約10%二十碳五締酸。
[0015]本發明設及生產甘油Ξ醋組分的經分離的微生物，其中甘油Ξ醋組分的二十碳五 締酸含量為W重量計至少約12%。
[0016] 在一些實施方式中，本發明的經分離的微生物是突變菌株。
[0017] 本發明設及WATCC登錄號口了4-10212、口了4-10213、口了4-10214、口了4-10215、口了八-10208、PTA-10209、PTA-10210 或PTA-10211 保藏的經分離的微生物。
[0018] 本發明設及包含本發明的微生物的任一種或其混合物的生物質。
[0019] 本發明設及分離的生物質，其中W重量計生物質干細胞重量的至少約20%是脂肪 酸，其中W重量計脂肪酸的超過約10%是二十碳五締酸，且其中脂肪酸包含W重量計各低 于約5%的花生四締酸和二十二碳五締酸n-6。在一些實施方式中，W重量計脂肪酸的至少 約25%是二十二碳六締酸。
[0020] 在一些實施方式中，本發明設及包含甘油Ξ醋的分離的生物質，其中W重量計甘 油Ξ醋的至少約12%是二十碳五締酸。
[0021] 在一些實施方式中，本發明設及本發明的分離的生物質的任何一種，其中脂肪酸 還包含W重量計各低于約5%的油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳締酸和芥酸。
[0022] 本發明設及包含本發明的微生物的任一種或其混合物的分離的培養物。
[0023]本發明設及用于非人類動物或人類的包含本發明的微生物或生物質的任一種或 其混合物的食用產品、化妝品或藥物組合物。
[0024]本發明設及下述微生物油，所述微生物油包含W重量計至少約20%的二十碳五締 酸和W重量計各低于約5%的花生四締酸、二十二碳五締酸n-6、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十 碳締酸、芥酸和十八碳四締酸的。在一些實施方式中，微生物油還包含W重量計至少約25% 的二十二碳六締酸。
[0025]發明設及下述微生物油，所述微生物油包含W重量計至少約10%的甘油Ξ醋組 分，其中甘油Ξ醋組分中W重量計至少約12%的脂肪酸是二十碳五締酸，其中甘油Ξ醋組 分中W重量計至少約25%的脂肪酸是二十二碳六締酸，和其中甘油Ξ醋組分中W重量計低 于約5%的脂肪酸是花生四締酸。
[0026]本發明設及用于非人類動物或人類的包含本發明的微生物油的任一種的食用產 品、化妝品或藥物組合物。在一些實施方式中，食用產品是嬰幼兒配方。在一些實施方式中， 嬰幼兒配方適于早產兒。在一些實施方式中，食用產品是牛奶、飲料、治療性飲品、營養飲品 或其組合。在一些實施方式中，食用產品是非人類動物或人類產品的添加劑。在一些實施方 式中，食用產品是營養補充劑。在一些實施方式中，食用產品是動物飼料。在一些實施方式 中，動物飼料是水產養殖飼料。在一些實施方式中，動物飼料是家養動物飼料、動物園動物 飼料、耕畜飼料、家畜飼料或其組合。
[0027]本發明設及生產包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括:在培養物中 培養本發明的經分離的微生物的任一種或其混合物W生產包含ω-3脂肪酸的油。在一些實 施方式中，所述方法還包括提取油。
[0028]本發明設及生產包含ω-3脂肪酸的微生物油的方法，所述方法包括從本發明的生 物質的任一種中提取包含ω-3脂肪酸的油。在一些實施方式中，使用有機溶劑提取方法(例 如己燒提取)來提取微生物油。在一些實施方式中，使用無溶劑提取方法來提取微生物油。 [0029]本發明設及由本發明的方法生產的微生物油。
[0030]本發明設及用于生產本發明的生物質的方法，其包括:在培養物中培養本發明的 經分離的微生物的任一種或其混合物W生產生物質。
[0031]本發明設及由本發明的方法生產的生物質。
[0032]本發明設及用于生產本發明的突變菌株的方法，其包括:對本發明的微生物的任 一種進行誘變處理并分離突變菌株。
[0033]本發明設及本發明的經分離的微生物、生物質或微生物油的任一種或其混合物用 于制造治療炎癥或其相關病況(condition)的藥物的用途。
[0034]本發明設及本發明的經分離的微生物、生物質或微生物油的任一種或其混合物用 于治療炎癥或其相關病況的用途。
[0035]本發明設及用于治療炎癥或其相關病況的本發明的經分離的微生物、生物質或微 生物油的任一種或其混合物。
[0036]本發明設及用于治療需要的個體的炎癥或其相關病況的方法，其包括給個體施用 本發明的經分離的微生物、生物質或微生物油的任一種或其混合物和藥學上可接受的載 體。
[0037]本發明設及經分離的微生物W及其菌株和突變體，W及其生物質、微生物油、組合 物和培養物。本發明設及從本發明的微生物生產微生物油、生物質和突變體的方法和使用 微生物、生物質和微生物油的方法。本文描述的微生物是高生產力的并產生獨特的脂肪酸 譜，所述脂肪酸譜部分特征為高水平的ω-3脂肪酸，特別是高水平的EPA。
[0038]具體地，本發明設及如下各項：
[0039] 1. -種微生物油，其包含ω-3多不飽和脂肪酸，所述ω-3多不飽和脂肪酸包含W 重量計占ω-3多不飽和脂肪酸總量的約含90%量的二十二碳六締酸和二十碳五締酸，其中 二十碳五締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約19 %至約 55%，且二十二碳六締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約 35% 至約 71%。
[0040] 2.根據項1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸總量的從約19%至約43%，且所述二十二碳六締酸的量為W重量計占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約35%至約47%。
[0041] 3.根據項1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸總量的從約27%至約54%，且所述二十二碳六締酸的量為W重量計占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約36%至約63%。
[0042] 4.根據項1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸總量的從約26%至約38%，且所述二十二碳六締酸的量為W重量計占二 十二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約52%至約64%。
[0043] 5.根據項1所述的油，其中所述二十碳五締酸的量為W重量計占二十二碳六締酸 和二十碳五締酸總量的從約28%至約36%，且所述二十二碳六締酸的量為W重量計占二十 二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約54%至約62%。
[0044] 6.根據項1-5任一項所述的油，其中所述油包含每克油從約120mg至約220mg的二 十碳五締酸和每克油從約240mg至約450mg的二十二碳六締酸。
[0045] 7.根據項1-5任一項所述的油，其中所述油包含每克油從約130mg至約195mg的二 十碳五締酸和每克油從約320mg至約480mg的二十二碳六締酸。
[0046] 8.根據項1-5任一項所述的油，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸還包含W重量計占 ω-3多不飽和脂肪酸總量的約0%至約10%量的二十二碳五締酸。
[0047] 9.根據項8所述的油，其中所述油包含每克油約150mg至約300mg的二十碳五締酸； 每克油從約200mg至約400mg的二十二碳六締酸；和每克油從約0至約55mg的二十二碳五締 酸。
[0048] 10.根據項1-9任一項所述的油，其中所述油由裂殖壺菌屬種生產。
[0049] 11.根據項任一項所述的油1-10,其中所述油包含W重量計各少于約5%的花生四 締酸、二十二碳五締酸n-6、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳締酸、芥酸和十八碳四締酸。
[0050] 12.根據項1-11任一項所述的油，其中所述油包含W重量計至少約10%的甘油Ξ 醋組分，其中所述甘油Ξ醋組分中W重量計至少約12%的脂肪酸是二十碳五締酸，其中所 述甘油Ξ醋組分中W重量計至少約25%的脂肪酸是二十二碳六締酸和其中所述甘油Ξ醋 組分中W重量計少于約5%的脂肪酸是花生四締酸。
[0051] 13. -種包含ω-3多不飽和脂肪酸的微生物油，所述ω-3多不飽和脂肪酸包含W 重量計占ω-3多不飽和脂肪酸總量的約含90%量的二十二碳六締酸和二十碳五締酸，和W 重量計占ω-3多不飽和脂肪酸總量的約ο%至約2%量的二十二碳五締酸;其中W重量計二 十碳五締酸的量為二十二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約10%至約25%，W重量計二 十二碳六締酸的量為二十二碳六締酸和二十碳五締酸總量的從約75%至約90%。
[0052] 14.根據項13所述的油，其中所述油包含每克油為從約55mg至約150mg的二十碳五 締酸;每克油為從約410mg至約540mg的二十二碳六締酸和每克油為從約0至約12mg的二十 二碳五締酸。
[0053] 15.根據項1-6和8-13任一項所述的油，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸總量為每克 油至少約400mg。
[0054] 16.根據項1-6和8-13任一項所述的油，其中所述二十二碳六締酸和二十碳五締酸 總量為每克油約400mg。
[0055] 17.根據項1-14任一項所述的油，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸總量為每克油從 約 400mg至約 750mg。
[0056] 18.根據項任一項1-14所述的油，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸總量為每克油至 少約500mg。
[0057] 19.根據項任一項1-14所述的油，其中所述二十二碳六締酸和二十碳五締酸總量 為每克油約500mg。
[0058] 20.根據項1-19任一項所述的油，其中所述油具有W重量計總ω-3多不飽和脂肪 酸的選自 1:1至1:1.5、1:1至1:2、1:1.5至1:2、1:1至1:2.5、1:2至1:2.5和1:4至1:7 的ΕΡΑ: DHA比率。
[0059] 21.-種口服劑型，其包含根據項1-20任一項所述的油。 巧060] 發明詳述
[0061]本發明設及經分離的微生物及由其所衍生的菌株。由本發明的經分離的微生物所 "衍生"的菌株可W是天然衍生的或人工衍生的，比如突變體、變體或重組菌株。本文中使用 時，術語"分離的"并不一定反映分離物已被純化的程度，而是指從天然形式或天然環境中 分離（isolation)或隔離（separation)。分離物可包括但不限于分離的微生物、分離的生物 質、分離的培養物、分離的微生物油及分離的序列（比如本文中所公開的分離的多核巧酸序 列）。本文中使用時，術語"微生物'包括但不限于術語"微藻"、"破囊壺菌"及與本文中所述 的任一種保藏微生物相關的分類學分類。與本發明的任一種微生物(包括本文中所述的保 藏微生物）相關時所用的術語"破囊壺菌目"（"Thraustochytriales")、"破囊壺菌" ("thraustochytrid")、''裂殖壺菌屬"（"Schizochytrium")及。破囊壺菌屬" TThraustochytrium")基于囊括可獲得的系譜信息的當前分類學分類，并且在本申請遞交 日后修訂分類學分類的情況下不意圖其限制作用。
[0062] 在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的經分離的微 生物。與ATCC登錄號PTA-10212相關的分離的微生物在本文中也稱為破囊壺菌屬種 (Thraustoch}rtriumsp.)ATCCPTA-10212,即破囊壺菌屬菌種27797。與ATCC登錄號PTA-10212相關的經分離的微生物是在布達佩斯條約(BudapestTreaty)下于2009年7月14日保 藏于美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道化niversityBoulevard) 10801號的美國典型培養物保藏中屯、(AmericanTypeQiltureCollection)的專利保藏庫 (PatentD邱ositoiT)。在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10212保藏的經 分離的菌株。在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10212保藏的經分離的菌 株。
[0063]在一些實施方式中，本發明設及具有WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的特征的 經分離的微生物或由其所衍生的菌株。WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的特征可W包括 其生長性質與表型性質(表型性質的例子包括形態學性質和繁殖性質）、其物理性質和化學 性質（比如干重和脂質譜）、其基因序列及其組合，其中所述特征使運些種區別于先前鑒定 過的種。在一些實施方式中，本發明設及具有WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的特征的經 分離的微生物，其中所述特征包括:包含SEQIDNO: 1的多核巧酸序列或與SEQIDNO: 1的 同一性為至少94%、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的多核巧酸序列的18srRNA，WATCC登錄 號PTA-10212保藏的種的形態學性質與繁殖性質，W及WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的 脂肪酸譜。在一些實施方式中，本發明的分離的微生物具有與WATCC登錄號PTA-10212保藏 的微生物基本相同的生長特征。在一些實施方式中，本發明的分離的微生物具有與WATCC 登錄號PTA-10212保藏的微生物基本相同的生長性質。在一些實施方式中，本發明設及經分 離的微生物，其包含具有SEQIDNO: 1的多核巧酸序列或與SEQIDNO: 1的同一性為至少 94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核巧酸序列的183誠酷。在一些實施方式中，本發 明設及經分離的微生物，其包含與WATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物的18srRNA多核 巧酸序列的同一性為至少94 %的18srRNA多核巧酸序列。
[0064] 在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10212保藏的微生物的突變菌 株。在進一步的實施方式中，該突變菌株是WATCC登錄號PTA-10213(即破囊壺菌屬菌種 27797-2)、PTA-10214(即破囊壺菌屬菌種27797-13)或PTA-10215(即破囊壺菌屬菌種 27797-20)保藏的菌株。與ATCC登錄號PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相關的微生物是 在布達佩斯條約（BudapestTreaty)下于2009年7月14日保藏于美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道(UniversityBoulevard) 10801號的美國典型培養物保 藏中屯、(AmericanTypeQiltureCollection)的專利保藏庫（PatentDepository)。
[0065] 在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的經分離的微 生物。與ATCC登錄號PTA-10208相關的分離的微生物在本文中也稱為裂殖壺菌屬種 (Schizoch^riumsp)ATCCPTA-10208,即裂殖壺菌屬菌種27173(9.l)-3-E。與ATCC登錄號 PTA-10208相關的微生物是在布達佩斯條約(BudapestTreaty)下于2009年7月14日保藏于 美國維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道(UniversityBoulevard) 10801 號的美國典型培養物保藏中屯、（AmericanTypeCultureCollection)的專利保藏庫 (PatentD邱ositoiT)。在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的經 分離的菌株。
[0066] 在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的經分離的微 生物，其中由微生物生產的總脂肪酸包含W重量計超過約10%、超過約11 %、超過約12%、 超過約13%、超過約14%、超過約15%、超過約16%、超過約17%、超過約18%、超過約19% 或超過約20%的EPA。在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的 經分離的微生物，其中由微生物生產的總脂肪酸包含W重量計約10%至約55%、約10%至 約50%、約10%至約45%、約10%至約40%、約10%至約35%、約10%至約30%、約15%至約 55 %、約15 %至約50%、約15 %至約45 %、約15%至約40 %、約15 %至約35%、約15 %至約 30 %、約20 %至約55 %、約20 %至約50 %、約20 %至約45 %、約20 %至約40 %、約20 %至約 35 %或約20 %至約30 %的EPA。
[0067]在一些實施方式中，本發明設及具有WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的特征的 經分離的微生物，其中由微生物生產的總脂肪酸包含W重量計超過約10%的二十碳五締 酸。WATCC登錄號PTA-10208保藏的微生物的特征包括其生長性質與表型性質（表型性質的 例子包括形態學性質和繁殖性質）、其物理性質和化學性質（比如干重和脂質譜）、其基因 序列及其組合，其中所述特征使運些種區別于先前鑒定過的種。在一些實施方式中，本發明 設及具有WATCC登錄號PTA-10212保藏的種的特征的經分離的微生物，其中所述特征包括： 包含SEQIDN0:2的多核巧酸序列的18srRNA，WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的形態學 性質與繁殖性質，W及WATCC登錄號PTA-10208保藏的種的脂肪酸譜。在一些實施方式中， 本發明的分離的微生物具有與WATCC登錄號PTA-10208保藏的那些微生物基本相同的物理 和化學性質。
[006引在一些實施方式中，本發明設及WATCC登錄號PTA-10208保藏的微生物的突變菌 株。在進一步的實施方式中，該突變菌株是WATCC登錄號PTA-10209(即裂殖壺菌屬菌種 27173(9.l)-3-E#2)、PTA-10210(即裂殖壺菌屬菌種27173(9.l)-3-E#4)或PTA-10211(即裂 殖壺菌屬菌種27173(9.1)-3-E#8)保藏的菌株。與ATCC登錄號PTA-10209、PTA-10210和PTA-10211相關的微生物是在布達佩斯條約(BudapestTreaty)下于2009年9月25日保藏于美國 維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學大道(UniversityBoulevard) 10801號的 美國典型培養物保藏中屯、（AmericanTypeCultureCollection)的專利保藏庫（Patent Depository)。
[0069]在一些實施方式中，本發明設及生產