一種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶及其修飾方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶及其修飾方法與應用，該修飾方法包括以下步驟：(1)將槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，攪拌條件下進行縮合反應，反應結束后得到反應混合物；所述的槐糖脂衍生物為羧酸型中長脂肪鏈槐糖脂；(2)依次采用去離子水和磷酸鹽緩沖液對步驟(1)得到的緩沖液體系進行透析，得到的透析物經過離心分離得到修飾后的溶菌酶。經過修飾的溶菌酶不僅能有效抑制革蘭氏陽性菌活性，同時也能顯著抑制革蘭氏陰性菌活性，從而擴展天然溶菌酶的抑菌譜，可作為多功能食品保鮮劑。
【專利說明】
-種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶及其修 飾方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及利用生物表面活性劑槐糖脂共價修飾蛋清溶 菌酶，從而擴展天然溶菌酶的抗菌譜，進一步拓寬溶菌酶的應用范圍，特別是在食品保鮮領 域的應用。
【背景技術】
[0002] 溶菌酶是一種堿性酶，可W水解黏多糖。溶菌酶主要通過破壞細胞壁中的N-乙酷 胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖間的β-1，4糖巧鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖膚，導 致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。存在于動植物體內和人的外分泌液中，目前可W 從牛、羊、馬等乳汁中分離出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最豐富，約為0.3%~0.4%。從雞 蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種，129個氨基酸殘基構成的單一膚鏈。它富含堿性氨基 酸，有4對二硫鍵維持酶構型，其Ν端為賴氨酸，C端為亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽抱 桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽性菌。化學性質非常穩定，對熱也極為穩定。溶菌酶的最適溫 度為5(TC，最適pH為6，溶菌酶具有熱穩定性，100攝氏度保持十分鐘仍具有活性。它作為一 種小分子蛋白質，具有對組織無刺激無毒性等優點。在《關于批準溶菌酶等物質為食品添加 劑及部分食品添加劑和營養強化劑擴大使用范圍、用量的公告(2010年第23號）中》，溶菌酶 已經可W在干酪和發酵酒中作為防腐劑使用。
[0003] 溶菌酶的應用過程中的優點：（1)溶菌酶是很穩定的蛋白質，有較強的抗熱性。蛋 清溶菌酶是C型，是已知的最耐熱的酶；（2)溶菌酶不會因為有機溶劑的處理而失活，當轉移 到水溶液中時，溶菌酶的活力可全部恢復；（3)溶菌酶可被冷凍或干燥處理，且活力穩定；
[4] 溶菌酶適宜抑5.3-6.4,可用于低酸性食品防腐；（5)溶菌酶生產成本較低；（6)溶菌酶作 為防腐劑安全性高。溶菌酶是一種天然蛋白質，1992年FA0/WT0的食品添加劑協會已經認定 溶菌酶在食品中應用是安全的。
[0004] 但由于革蘭氏陰性菌的細胞膜外壁存在一層脂多糖LPS，天然的溶菌酶很難溶解 該膜層，所W無法有效抑制該類菌的活性，限制了溶菌酶的應用范圍。目前，為了提高溶菌 酶對大腸桿菌等革蘭氏陰性細菌的抑菌效果，國內外已經做了一些相關研究，可W通過熱 處理、利用還原劑還原溶菌酶的二硫鍵添加其它化學物質與溶菌酶協同作用等改變酶的構 象。溶菌酶的化學修飾研究主要集中在：利用化學小分子（small molecule)或多糖 (poly saccharides)與溶菌酶結合（conjugation)進而修飾溶菌酶，或利用蛋白水解酶 (proteol^ic enzymes)修飾的溶菌酶。
[0005] 此外，槐糖脂（sophorolipids)是一類無毒、可生物降解的生物表面活性劑。槐糖 脂亦可用作食品乳化劑和發泡劑。近年來，研究者們還發現一些槐糖脂還表現出良好的抑 菌活性，可用作多功能食品保鮮劑。我們利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物(P化-C12)共價修飾 天然蛋清溶菌酶，改善其對革蘭氏陰性菌的抑菌效果，從而擴增溶菌酶的抗菌譜，進一步拓 寬溶菌酶的應用范圍，特別是在食品保鮮領域的應用。

【發明內容】

[0006] 本發明提供了一種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物(P化-C12)共價修飾的天然蛋清 溶菌酶及其修飾方法，改善溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抑菌效果，從而擴展溶菌酶的抗菌譜， 進一步拓寬溶菌酶的應用范圍。
[0007] -種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶，由中長脂肪鏈槐糖脂衍生 物與天然溶菌酶通過共價結合得到，其中，所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的簇基與天然 溶菌酶的氨基酸殘基形成酷胺鍵；
[0008] 所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物為簇酸型中長脂肪鏈槐糖脂，結構下式所示：
[0009]
[0010] 本發明中，使簇酸型中長脂肪鏈槐糖脂衍生物與溶菌酶的氨基酸殘基通過共價結 合得到修飾后的溶菌酶，從而將槐糖脂結構引入到溶菌酶的表面，經過活性測試，發現其對 革蘭氏陰性菌具有更好的抑菌效果，同時，對其抗菌譜也有較大的擴展。
[0011] 本發明還提供了一種溶菌酶的修飾方法，包括W下步驟：
[0012] (1)將槐糖脂衍生物的活性醋溶解在DMS0,然后加入溶菌酶的化肥化水溶液，攬拌 條件下進行縮合反應，反應結束后，加入甘氨酸溶液得到反應混合物；
[0013] (2)依次采用去離子水和憐酸鹽緩沖液對步驟(1)得到的緩沖液進行透析，得到的 透析物經過離屯、分離得到修飾后的溶菌酶。
[0014] 形成活性醋的目的是為了活化簇基，使得槐糖脂衍生物能夠與溶菌酶的氨基成 鍵，完成修飾過程，作為優選，所述的活性醋為N-徑基班巧酷亞胺醋。
[0015] 作為優選，所述的溶菌酶為蛋清溶菌酶。采用鹽提法制備的蛋清溶菌酶的成本較 低。
[0016] 作為優選，所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的添加量為1.0-2.Og/L。所述的溶菌 酶的添加量為1.5-2.0肖/1。溶菌酶與長脂肪鏈槐糖脂衍生物的混合溫度為30°(>35°(：。通過 上述方法可將中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的活性幾基與溶菌酶的氨基酸殘基通過共價結合 得到修飾后的溶菌酶，從而將槐糖脂結構引入到溶菌酶的表面。
[0017] 修飾的具體步驟如下：
[0018] 將中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的N-徑基班巧酷亞胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液的 最終濃度為0.7mM，攬拌情況下，逐滴滴加入25mL 1 %化肥化的蛋清溶菌酶溶液(0.2mM)，繼 續緩慢攬拌30°C下反應化。反應結束后，向體系內加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液(glycine solution)，30°C恒溫lOmin。反應體系室溫下利用去離子水透析，再利用抑7.0 20mM憐酸 鹽緩沖液4°C透析1天。
[0019] 本發明還提供了一種所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物(P化-C12)的制備方法，包 括W下步驟：
[0020] (1)在隔絕水分的條件下，向中長脂肪鏈槐糖脂中加入絕干甲醇和甲醇鋼，加熱回 流進行反應，經過后處理得到水解中間體；
[0021] (2)在DMAP的作用下，步驟(1)得到的水解中間體與乙酸酢在THF中進行醋化反應， 得到醋化中間體；
[0022] (3)在憐酸鹽緩沖液存在的條件下，步驟(2)得到的醋化中間體在脂肪酶的作用下 進行選擇性水解反應，得到所述的簇酸型中長脂肪鏈槐糖脂。
[0023] 作為優選，步驟（1)中所述槐糖脂與甲醇鋼的初始添加量之摩爾比為1:0.15:-1: 0.2。且反應回流時間控制在3-化。所用的酸的濃度無特別嚴格的要求。
[0024] 步驟(2)中，步驟(1)產物與乙酸酢的初始添加量摩爾比為1:6-1:10,步驟(1)產物 與DMAP的初始添加量摩爾比為1:0.3-1:0.6。所述反應溫度為25-30°C，反應時間為1-化。
[0025] 步驟(3)中，所述的脂肪酶用于選擇性地水解側鏈的醋基并保留其他的醋基，所述 脂肪酶可選擇W下所述，PS-30(f;rom P.cepacia),P化（from porcine pancreas)和AYS (from C.rugosa)和Novozym-435(f;rom C.an1:a;rctica)。反應溫度為25-30°C，反應時間為 24-7 化。
[0026] 本發明還提供了一種所述的槐糖脂的發酵法制備方法，包括如下步驟：
[0027] (1)將購置的凍干假絲酵母菌C.bombicola ATCC 22214均勻分散至ImL滅菌后的 YM培養基中（YM培養基組成包括，單位1 L酵母粉3. Og，麥芽粉3. Og，蛋白腺5 . Og，葡萄糖 10.Og，用蒸饋水定容至1 L)。隨后將其畫線接種到YM瓊脂培養基斜面上(YM瓊脂培養基組 成包括:酵母粉3. Og/L，麥芽粉3. Og/L，蛋白腺5. Og/L，葡萄糖10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L)，于25 °C恒溫2天后，挑取培養基斜面上的單菌落接種至滅菌后的液體培養基中，25°C，200巧m培 養24h (液體培養基組成包括，單位比:酵母粉3. Og，麥芽粉3. Og，蛋白腺5. Og，葡萄糖10.0 g， 用蒸饋水定容至1L)，并分裝于甘油管中，-8(TC保存備用。
[0028] (2)將上述步驟(1)菌懸液按照體積百分比5%的接種量將菌懸液接入上述冷卻的 液體種子培養基中，2500-mL規格的搖瓶，裝液量為500mL，搖瓶于25°C、轉速為20化pm的搖 床上培養2地，得到液體種子；
[0029] (3)將上述步驟(2)液體種子培養基接種至滅菌后的裝配有電子數控與攬拌裝置 的10-L發酵罐培養基中，發酵溫度25°C，轉速不超過1200rpm，溶氧控制在30%，利用6M氨氧 化鋼溶液調控體系抑3.5。當細胞生長進入靜止期時，將葡萄糖(50%，v/v)及月桂酸W適 宜的速率添加入發酵罐中，發酵過程中每隔化監測發酵液中的葡萄糖濃度，當葡萄糖濃度 低于150mM時，補加葡萄糖。
[0030] (4)發酵72h結束后，將發酵液于8000巧m下離屯、lOmin，離屯、后，發酵液體系呈Ξ 相，最上層為培養基液體層，中間層主要含槐糖脂產物，而最下層固體相為細胞層。回收最 底層細胞W備循環復用。同時利用等體積乙酸乙脂洗涂Ξ次底層，用與等體積的有機溶劑 正己燒回收發酵液中未反應的油脂(洗3次）。合并乙酸乙醋，減壓除溶劑得槐糖脂粗產品， 得到產物產量為160-180g/L。
[0031] (5)向lOOmL的圓底燒瓶中順序加入步驟(4)產物，絕干甲醇和甲醇鋼，CaCb保護， 加熱回流化，降至室溫，再加入適量K0H水溶液，繼續回流化，減壓除溶劑，溶解于去離子水 溶，利用肥1調抑至苯酪呈紅色，置于冰浴中至有沉淀析出，通過硅膠層析柱分離得到產物。
[0032] 作為優選，步驟(5)中所述無酷基槐糖脂衍生物與甲醇鋼的添加量之摩爾比為1: 015: -1: ο. 2。且反應回流時間控制在3-化。所用的酸的濃度無特別嚴格的要求。
[0033] 同現有技術相比，本發明的有益效果：
[0034] (1)本發明利用生物表面活性劑槐糖脂衍生物對天然蛋清溶菌酶實施了有效化學 修飾，酶在修飾過程中的酶活損失小，調整酶活性中屯、的空間結構，強化了溶菌酶的抑菌效 果，開發了一種新穎的溶菌酶修飾劑與修飾方法，方式簡單靈活，是一種頗具實用價值的生 物工程技術。
[0035] (2)本發明提供的一種擴展溶菌酶抗菌譜的方法，較之天然溶菌酶，不僅對革蘭氏 陽性菌具有抑菌活性，而且對革蘭氏陰性菌的抑菌活性大幅提高，有效拓展了溶菌酶的抑 菌譜。
【附圖說明】
[0036] 圖1是中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的核磁碳譜圖；
[0037] 圖2是天然溶菌酶與中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾溶菌酶的酶活力對比；
[0038] 圖3是中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾溶菌酶對常見食源性致病菌的抑菌圈直 徑。
【具體實施方式】
[0039] 實施例1
[0040] 中長脂肪鏈槐糖脂衍生物(P化-C12)的制備方法：
[0041 ] 向lOOmL的圓底燒瓶中順序加入假絲酵母菌C.bombicola ATCC 22214發酵產物 27.01g(43.27mmol，leq)，50mL 絕干甲醇和 1.621^(6.49111111〇1，0.1569)甲醇鋼，〔曰(：12保護， 加熱回流化，降至室溫，酸調抑至中性，減壓除溶劑后溶解在去離子水中，并置于〇°C冰浴至 粉末沉淀析出，過濾，水洗，減壓干燥，得產物20.5g(81 % )。
[0042] (2)向lOOmL的圓底燒瓶中順序加入28.42邑(51.61111111〇1，169)步驟（1)產物，50血絕 干有機溶劑 了冊，38.721^(412.88111111〇1，869)乙酸酢和2.52旨（20.64111111〇1，0.469)014?，室溫 下攬拌化，化C12保護，減壓除溶劑后溶解于乙酸乙醋，并利用飽和化肥化溶液洗涂混合物3 次，回收有機相，MgS〇4干燥，過濾，減壓干燥，得無色油狀物27.4g。
[0043] (3)分別向裝有20血，抑二7.4，0.2M憐酸鹽緩沖液的50血錐形瓶中順序加入，0.8g 步驟(2)產物(溶解在5mL丙酬中），0.4g脂肪酶Novozyme 435。室溫下置于恒溫震蕩水浴中 維持72h，反應結束后，用乙酸乙醋萃取反應液，回收有機相，無水硫酸鋼干燥，減壓除溶劑， 產物產率87.5%，產物C譜見圖1。
[0044] 實施例2
[0045] 利用簇酸型中長脂肪鏈槐糖脂衍生物(P化-C12)共價修飾天然蛋清溶菌酶：
[0046] 1)將中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的N-徑基班巧酷亞胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液 的最終濃度為0.7mM，攬拌情況下，逐滴滴加入25mL，0.2mM，1 %化肥化的蛋清溶菌酶溶液， 繼續緩慢攬拌30°C下反應化。反應結束后，向體系內加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液，30°C恒 溫lOmin，室溫下利用去離子水透析，再20mM憐酸鹽緩沖液透析，pH 7.0,4°C維持1天左右。 為了除去未反應的酸型全乙酷基槐糖脂，透析物在5°C120(K)rpm離屯、lOmin，做種收集懸浮 物。
[0047] 2)溶菌酶酶活測定：
[004引將待測酶液和底物懸液分別置于25°C水浴中保溫20min，吸取底物懸液2.8mL，置 于1 cm比色皿中比色測定450nm下的0D值，此為零時讀數，然后加入酶液0.2mL，迅速搖均，從 加入酶液起計時，每隔Imin測定1次450nm下的0D值，共測定3次。本實驗的酶活力單位定義 為:每分鐘0D值下降0.001為1個活力單位(25°C、pH值6.2)，即每毫克活力單位化/111旨）=^ 0D45/min)X10シ樣品的質量(mg)。槐糖脂衍生物修飾溶菌酶酶活是天然酶活93.2%。
[0049] 實施例3
[0050] 抑菌圈的測定：采用杯碟法。取20mL溶化的固體培養基于培養皿中，凝固后，取 0.2mL濃度為106-107C即/血的各菌懸液均勻涂布于固體培養基中，lOmin后，將牛津杯放置 于培養皿表面，加入樣品液，蓋好培養基，置于37Γ恒溫培養2地，測抑菌圈直徑。每個樣品 液實驗重復3次，取平均值。
【主權項】
1. 一種利用中長脂肪鏈槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶，其特征在于，由中長脂肪鏈 槐糖脂衍生物與天然溶菌酶通過共價結合得到，其中，所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的 羧基與天然溶菌酶的氨基酸殘基形成酰胺鍵； 所述的中長脂卩枯連地?日旨析A物I %釀?由長·日旨卩枯連地*唐日旨結拔!下式所示：2. -種如權利要求1所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將所述的中長脂肪鏈槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3 水溶液，攪拌條件下進行縮合反應，反應結束后得到反應混合物； (2) 依次采用去離子水和磷酸鹽緩沖液對步驟（1)得到的緩沖液體系進行透析，得到的 透析物經過離心分離得到修飾后的溶菌酶。3. 根據權利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的活性酯為N-羥基琥珀 酰亞胺酯。4. 根據權利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的溶菌酶為蛋清溶菌 酶。5. 根據權利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的羧酸型中長脂肪鏈槐 糖脂衍生物的制備步驟如下： (1) 在無水條件下，向中長脂肪鏈槐糖脂中加入絕干甲醇和甲醇鈉，加熱回流進行反 應，經過后處理得到水解中間體； (2) 將步驟（1)得到的水解中間體與乙酸酐在THF中經DMAP催化進行酯化反應，得到酯 化中間體； (3) 將步驟(2)得到的酯化中間體置于磷酸鹽緩沖液中，經脂肪酶的選擇性催化水解作 用，得到所述的羧酸型中長脂肪鏈槐糖脂。6. 根據權利要求5所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，步驟（1)中，所述的槐糖脂與 甲醇鈉的起始摩爾比為1:0.15-1:0.2,回流時間為3-6h; 步驟(2)中，水解中間體、乙酸酐和DMAP的起始摩爾比為1:8~10:0.4~0.6,反應溫度 為25-30°(：，反應時間為1-311; 步驟(3)中，所述脂肪酶為PS-30、PPL、AYS或Novozym-435，反應溫度為25-30°C，反應時 間為 24-76h。7. 根據權利要求6所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的槐糖脂制備步驟如 下： (1) 將凍干假絲酵母菌C.bombicola ATCC 22214均勻分散至ImL滅菌后的YM培養基中， 隨后將其畫線接種到YM瓊脂培養基斜面上，25°C恒溫2天后，挑取單菌落接種至滅菌后的液 體培養基中，25 °C，200rpm培養24h; (2) 將步驟（I)的菌懸液接種至滅菌后的種子培養基中，25°C，200rpm培養24h; (3) 將步驟(2)種子培養基接種至滅菌后的裝配有電子數控與攪拌裝置的發酵罐培養 基中，25°C，轉速不超過1200rpm，溶氧控制在30%，利用氫氧化鈉溶液調控體系pH 3.5，當 細胞生長進入靜止期后，將葡萄糖及月桂酸添加入發酵罐中，每隔3h監測發酵液中葡萄糖 濃度，濃度低于150mM時補加葡萄糖； (4) 將步驟(3)發酵液于SOOOrpm下離心10min，離心后，發酵液體系呈三相，中間層含槐 糖脂產物，利用等體積乙酸乙酯洗滌，合并有機相，減壓除溶劑得槐糖脂。8. -種如權利要求1所述的溶菌酶的應用，其特征在于，所述的溶菌酶用于制備多功能 食品保鮮劑或者抑菌劑。
【文檔編號】C12N9/36GK106011109SQ201610484733
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】石玉剛, 王賀, 任月萍, 卞立晴, 吳煜, 蔡文強, 余頔
【申請人】浙江工商大學