0061] 電荷異構（cIEF):用涂層毛細管 Neutral Capillary (50 μ m i. dX45cm),通過 Beckman毛細管電泳儀（型號：PA800plus)在毛細管兩端加電壓使樣品電離，電離完成后用 32Karat軟件對圖譜進行分析積分，用面積歸一化法計算。
[0062] DSC:使用MIcroCal VP-DSC，起始溫度為10°C，結束溫度為110°C，掃描速率為 60°C /Hr。不同樣品分別扣除相應的緩沖液之后得到最終各個樣品的Tm值。
[0063] 實施例1
[0064] 氨基酸、多元醇、氯化鈉等對融合蛋白穩定性的影響
[0065] 按照表1所示用無菌注射用水配置各種溶液，用配制完成的各個溶液分別對融合 蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO. :3所示）進行超濾置換。
[0066] 將融合蛋白濃度為10mg/ml的超濾置換液用相應的溶液稀釋至I. 5mg/ml。然后取 I. 5ml稀釋液，并向其中加入適量的的聚山梨酯20,使其終濃度為0. 03重量％。使用0. 2 μ m 濾膜過濾后作為樣品檢測。
[0067] 另外，各取出5ml表1所述溶液，加入適量的聚山梨酯20使得其終濃度為0. 03%， 然后用0. 2 μ m濾膜過濾后作為緩沖液空白對照。使用DSC方法，檢測不同蛋白穩定劑下的 熱融溫度Tm值，實驗結果見表2。
[0068] 表1 :不同種類蛋白穩定劑對融合蛋白穩定性影響
[0069]
[0071] 2 :不同種類蛋白穩定劑DSC結果
[0073] 將14組不同樣品分別扣除相應的溶液空白之后得到最終各個樣品的Tm值。研究 結果顯示14組樣品均具有較高的熱穩定性。其中樣品組1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、 2-3、2-4、2-6、2-7熱穩定性最優，樣品組2-1、2-2、2-5次之。結果表明，采用表1中的各組 分與重組融合蛋白組成的重組融合蛋白制劑具有較佳的熱穩定性。
[0074] 實施例2
[0075] pH值穩定性
[0076] 按照表3用無菌注射用水配制各個pH值的溶液，用配制完成的各個溶液分別對融 合蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO. : 3所示）進行超濾置換。
[0077] 將融合蛋白濃度為10mg/ml的超濾置換液用相應的溶液稀釋至I. 5mg/ml。然后取 I. 5ml稀釋液并向其中加入適量的的聚山梨酯20,使其終濃度為0. 03重量％。使用0. 2 μ m 濾膜過濾后作為樣品檢測。
[0078] 另外，各取出5ml各個pH值得溶液，加入適量的聚山梨酯20使其終濃度為0. 03 重量％，然后用〇. 2 μ m濾膜過濾后作為緩沖液空白對照。使用DSC方法，檢測不同pH值下 的熱融溫度Tm值，實驗結果見表4。
[0079] 表3 :pH值穩定性實施例樣品
[0081 ] 表4 :pH穩定性DSC結果
[

[0083] 6組不同樣品分別扣除相應的緩沖液之后得到的Tm值表明，樣品1~4具有較高 的熱穩定性，樣品5熱穩定性次之，樣品6的Tm略低，表明重組融合蛋白制劑的pH在5. 5~ 7.0之間具有較高的熱穩定性。
[0084] 實施例3
[0085] 重組人血管內皮生長因子受體-抗體-人補體受體1融合蛋白制劑
[0086] 按以下配方配制制劑，融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. :3所示。
[0087] 處方 A
[0088] 重組融合蛋白 IOmgZml 枸櫞酸鈉 10 mmol/L 精氨酸 80 mmol/L 蔗糖 5重量％ 聚山梨酯20 0.03重量％ pH 6,2 溶劑 無菌注射用水
[0089] 將半成品無菌分裝至西林瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。
[0090] 處方 B
[0091] 重組融合蛋白 40 mg/ml 枸櫞酸銷 10 mmol/L 精氨酸 80 mmol/L 鹿糖 ：5重量％ 聚山梨酯20 0.03重量％ pH 6.2 溶劑 無菌注射用水
[0092] 將半成品無菌分裝至西林瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。
[0093] 實施例4
[0094] 加速穩定性實驗
[0095] 將實施例3的樣品分別置于25°C恒溫箱中保存進行加速穩定性實驗，一個月后將 樣品取出并與樣品〇天時檢測結果進行比較，以衡量制劑在高溫條件下的加速穩定性，實 驗結果如表5和表6所不。
[0096] 表5 :25°C ±2°C蛋白電荷異構變化結果（PI > 8. 0)
[0098] 表6 :25°C ±2°C蛋白純度變化結果（SEC主峰百分含量）
[0100] 通過毛細管等電聚焦（ClEF)和蛋白純度（SEC-HPLC)表征重組融合蛋白的化學穩 定性。以等電點PI > 8. 0的百分含量變化和蛋白純度（SEC-HPLC)的主峰含量作為判定手 段，結果表明：制劑A、B的電荷異構含量在加速1個月后沒有明顯變化（見表5)。同時制 劑A、B的主峰含量同樣沒有明顯變化（見表6)，而其他指標如外觀、蛋白濃度、濁度等在該 加速條件下均沒有發生明顯變化。結果表明，在25°C加速條件下兩種制劑處方能保持該重 組融合蛋白穩定性至少1個月。
[0101] 實施例5
[0102] 長期穩定性實驗
[0103] 該實施例中所用樣品與實施例4相同，即為實施例3制備的制劑。將樣品分別置 于2~8°C恒溫箱中保存進行長期穩定性實驗，于三個月、六個月時間點將樣品取出并與樣 品0天時檢測結果進行比較，以衡量制劑在低溫條件下的長期穩定性。
[0104] 實驗結果如表7和8所示。
[0105] 表7 :2~8°C蛋白電荷異構變化結果（PI > 8.0)
[0107] 表8 :2~8°C蛋白純度變化結果（SEC主峰百分含量）

[0109] 結果表明，在2~8°C的長期儲存條件下，樣品在6個月時間內電荷異構（cIEF)和 蛋白純度（SEC-HPLC)沒有明顯變化。同時其他指標如外觀、蛋白濃度、濁度等在該加速條 件下均沒有發生明顯變化。結果表明兩種制劑在長期條件下至少能保存6個月。
[0110] 實施例6
[0111] 凍融穩定性
[0112] 該實施例所用樣品與實施例3的制劑配方基本相同，不同之處在于融合蛋白氨基 酸序列如SEQ ID NO. :1所示。樣品在-80°C條件下冷凍后在室溫條件下解凍，重復上述操 作反復凍融3次和6次后對樣品進行檢測，實驗結果如表9和10所示。
[0113] 表9 :凍融條件下蛋白電荷異構變化結果（PI > 8. 0)
[0115] 表10 :凍融條件下蛋白純度變化結果（SEC主峰百分含量）
[0117] 結果表明，三組樣品電荷異構（cIEF)和蛋白純度（SEC-HPLC)凍融6次后均無明 顯變化，物理特性相關的外觀、可見異物等檢測指標均合格。結果表明制劑經至少6次凍融 后，物理化學性質依然穩定。
[0118] 以上研究結果表明，采用本發明的緩沖液和穩定劑與重組融合蛋白配制成的液體 制劑，具有較佳的穩定性，可以使融合蛋白在較高濃度下穩定保存，制劑在高溫加速、長期 冷藏和反復凍融等條件下也均能保持穩定，可以提高臨床使用安全性。
[0119] 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種重組融合蛋白液體制劑，其特征在于，所述液體制劑包含：重組融合蛋白、緩沖 鹽、穩定劑、表面活性劑和無菌注射用水，其中， 所述重組融合蛋白的濃度為5~45mg/mL ; 所述緩沖鹽為枸櫞酸鹽、醋酸鹽中的一種或兩種以上的組合，且所述鹽的濃度為 5-25mmol/L，較佳地為 8-22mmol/L ; 所述穩定劑為氯化鈉、氨基酸、多元醇中的一種或兩種以上的組合，所述氨基酸為精 氨酸、甘氨酸、組氨酸中的一種或兩種以上的組合，所述多元醇為蔗糖、山梨醇、甘露醇中 的一種或兩種以上的組合，且所述氯化鈉的濃度為100-200mmol/L ;所述氨基酸的濃度為 50-350mmol/L ;所述多元醇的濃度為1重量％~15重量％，以所述液體制劑的總重量計； 所述表面活性劑為聚山梨酯20、聚山梨酯80、泊洛沙姆188中的一種或兩種以上的組 合，且所述表面活性劑的濃度為0. 01重量％~0. 08重量％，以所述液體制劑的總重量計； 且所述液體制劑的pH為4. 5~7. 5。2. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述重組融合蛋白為重組人血管內皮 生長因子受體-抗體-人補體受體1融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. :1或SEQ ID NO. :3 所示。3. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述穩定劑為氨基酸、多元醇中的一種 或兩種以上的組合。4. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述氯化鈉的濃度為120-180mmol/L。5. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述氨基酸的濃度為70-260mmol/L。6. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述多元醇的濃度為220~270mmol/ L〇7. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述液體制劑的pH為5. 0-7. 2,較佳 地，pH 為 5. 5-7. 0。8. 如權利要求1所述的液體制劑，其特征在于，所述液體制劑的pH為5. 5-7,包含： 重組融合蛋白 5-45mg/ml; 枸櫞酸鹽 5-15 mmol/L; 粘 Μ 酸 50-100 mniol/L; 蔗糖 2-8重量％; 聚山梨酯20 0.02-0.06重量。/〇; 以及無菌注射用水。9. 一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求1-8任一項所述的液體制劑，以 及盛裝所述液體制劑的容器。10. 如權利要求1-8任一項所述的液體制劑或權利要求9所述的試劑盒的用途，其特征 在于，用于制備預防和/或治療年齡相關性黃斑變性的藥物。
【專利摘要】本發明提供一種重組融合蛋白液體制劑，包含重組融合蛋白、緩沖鹽、穩定劑和表面活性劑。本發明建立了能使重組融合蛋白穩定儲存的液體制劑，可以提高重組融合蛋白的物理化學穩定性，液體制劑在高溫加速、長期冷藏和反復凍融等條件下均能保持重組融合蛋白穩定性，可以提高臨床使用安全性。
【IPC分類】A61K47/02, A61K47/26, A61K39/395, A61K47/18, A61P27/02, A61K47/22, A61K47/10
【公開號】CN105435222
【申請號】CN201410497937
【發明人】汪音爵, 李俊峰, 黃小樂
【申請人】信達生物制藥(蘇州)有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月25日
【公告號】WO2016045626A1