專利名稱：一種豬用融合蛋白制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬用融合蛋白的凍干制劑，屬藥物制劑領域。
背景技術：
在《一種豬用融合蛋白的制備方法》專利(申請號20081014768.3)中，我 們公開了利用融合技術得到的豬血清白蛋白與干擾素的融合蛋白(The ftision protion of porcine:在本發明中，以下略作FPP)。這種融合蛋白既能延長干擾素 在血漿中的半衰期，又能保持干擾素的生物學活性，并且融合蛋白是在畢赤酵 母中進行分泌表達，純化較為簡單，為防治豬病毒性疾病提供了新的手段。
可是，FPP的等電點偏酸，其水溶液制劑在偏酸或接近中性時溶解性急劇 降低，在低溫或者室溫保存時，該制劑容易出現凝集、混濁或凝膠化。另外， 該制劑的物理化學穩定性低，容易降解或形成聚集體。再者，FPP的水溶液制 劑在振動或攪拌后的發泡會造成藥物制劑的品質下降，藥效減低。因此，從生 物活性的角度來說，FPP制劑以凍干制劑為佳。
為了克服FPP水溶液制劑的上述缺陷，在申請號20081014768.3的專利中， 對FPP凍干制劑的藥物載體進行了初步探討，典型的載體為水、鹽、糖類、醇 類或氨基酸，但未能對其作進一步研究。
按一般的凍干制劑工藝，為了得到良好的形態，多采用高蛋白濃度的水溶 液進行制備。但是，當制劑的水溶液濃度較高時，在保存中容易出現聚集體， 效果反而不佳。并且，FPP是具有較強生理活性的物質，作為醫藥使用時，僅 需較低的濃度。因此，需要開發在低濃度水溶液時FPP不易生成聚集體，且長 期保存穩定性優良的凍干制劑的制備方法。
并且，如果這種凍干制劑的緩沖液選擇不當，復溶后，溶液的滲透壓高， 可導致給藥部位出現炎癥反應、溶血現象和產生疼痛等；如果鹽、糖、醇、大 分子化合物、金屬離子等穩定劑，氨基酸、表面活性劑等防聚集劑，聚乙二醇 等低溫保護劑選擇不當，也會影響藥效，需要進行研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種FPP凍干制劑，該凍干制劑具有優良的保存穩定 性，再溶解時不出現凝集、混濁、凝膠化等現象。本發明的第二個目的是提供成形和復溶性能優良的凍干制劑。
本發明的第三個目的是提供具有適宜的pH和滲透壓比的凍干制劑。 為達到上述目的，本發明者等人進行了悉心研究。結果表明，將濃度不超 過10mg/mL的FPP，在穩定劑、氯化鈉、以及緩沖劑存在的條件下進行凍干， 能夠制備出結塊形成性、溶解性、長期保存穩定性良好的凍干制劑，并且在該 凍干制劑的制備和保存過程中不生成聚集體，由此凍干制劑再融化后的水溶液 不產生凝集、混濁、凝膠化等現象，保證了藥物能夠充分發揮藥效。
本發明提供
含有FPP、阻止FPP生成聚集體的穩定劑、氯化鈉、以及緩沖劑的凍干制 劑，且該凍干制劑是從FPP濃度不超過10mg/mL的水溶液中制備得到。
這些FPP凍干制劑在凍干時以及凍干后的長期保存過程中，具有優良的穩 定性，不生成FPP的聚集體，由凍干制劑再溶解后的水溶液不產生凝集、混濁、 凝膠化等現象，甚至在保存該水溶液時也難以生成聚集體。
本發明提供的方案是
本發明的制劑的水溶液中，所含FPP的濃度在0.1mg/mL到10mg/mL之間， 優選0.5mg/mL—6mg/mL。
本發明的制劑的水溶液在小瓶中或在安瓿瓶中凍干。
本發明的制劑的水溶液的pH在5.8到7. 8范圍，優選pH6.2到pH7.5范圍。
本發明的制劑所用的穩定劑是從精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯 氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖類、及它們的可藥用鹽構成的組合中選 出。優選從精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、及它們的可藥用鹽 構成的組合，特別優選從精氨酸、賴氨酸、組氨酸、及它們的可藥用鹽構成的 '組合。可藥用鹽是鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽。這些穩定劑的用量沒有特別的限定， 優選按凍干時和/或凍干后保存時可防止生成FPP聚集體的充分有效的用量， 相對于FPP的質量，優選0.01至100倍的質量，最優選0.1至30倍的質量，在 上述制劑中配合使用。
本發明的制劑所用的緩沖劑只要具有調節凍干前及再溶解后水溶液的pH 和保持FPP的溶解性的作用，就沒有特別限制。例如，應用磷酸緩沖液、檸檬 酸緩沖液、醋酸緩沖液等，優選使用磷酸緩沖液，特別優選使用磷酸鈉緩沖液。 其用量相對于再溶解后的水量，在lmM—100mM之間。本發明的制劑在凍干前和/或再溶解后的水溶液優選具有注射劑適宜的滲 透壓，與生物體幾乎等滲，或按注射劑的滲透壓比在1至2之間。氯化鈉按達
到與生物體等滲的滲透壓的量添加，優選的滲透壓比為1至2，例如相對于再溶 解后的水量為140mM的程度。
為防止FPP向容器上吸附，加入表面活性劑，優選使用聚山梨醇酯80、聚 山梨醇20、 HCO-60、聚乙二醇等非離子表面活性劑以及它們兩種以上組合，最 優選使用聚氧乙烯醚表面活性劑(聚山梨醇酯80等)。其添加量，優選相對于 再溶解后的水重量的0.001%至2.0%的范圍。
對于本發明的凍干制劑中所含FPP中的干擾素的種類沒有特殊的限定。例 如，來源于動物的，來源于能自發產生干擾素的細胞的，來源于基因重組手段 得到的等。
本發明的FPP凍干制劑可以含有制劑所必要的其它添加劑，如抗氧化劑、 防腐劑、賦形劑、鎮痛劑等。
本發明的FPP凍干制劑的制備
將FPP、穩定劑、氯化鈉、以及緩沖劑溶解于注射用蒸餾水中，根據需要
添加表面活性劑后，過濾除菌，分裝在小瓶或者安瓿瓶等容器中進行凍干。作
為凍干的方法，通常由以下三個操作單元組成
(1) 常壓下冷卻凍結的凍結過程；
(2) 減壓下升華干燥的一次干燥過程；
(3) 減壓下除去吸附水和結晶水的二次干燥過程。
本發明的凍干制劑在使用時，加入注射用水等溶劑進行溶解，但FPP的濃 度不要超過10mg/mL。使用劑量可通過FPP相對于干擾素的效價計算出，同時 考慮FPP相對于天然干擾素延長的半衰期，按照摩爾數相當即意味著使用較大 劑量的FPP，但使用頻率可降低，如一周一次或更少。
本發明的凍干制劑可以通過任何已知的方法給藥，例如皮下或肌肉注射、 靜脈輸注、透皮、吸入、口服等方法，優選的方法為注射給藥或靜脈輸注，治 療包括在一段時間內使用單一劑量或復合劑量。
具體實施例方式
以下列舉實施例詳細說明本發明，但本發明并不限定于這些實施例。 實施例l: FPP凍干制劑，基礎比較例
5用含有140mM氯化鈉、0.01。/。聚山梨醇酯80的10mM的磷酸緩沖液(pH7.0) 溶解FPP，并使FPP終濃度為lmg/mL。調節此溶液的pH后，過濾除菌，無菌 條件下在每小瓶中分裝2mL，常規凍干。 實施例2: FPP凍干制劑，FPP濃度比較例
在例1中，用不同濃度的FPP加入量，代替濃度為lmg/mL的FPP水溶液， 分別得到FPP終濃度為0.1、 0.3、 0.6、 0.9、 1.2、 1.5、 1.8、 2.1、 2.4、 2.7、 3.0、 3.3、 3.6、 3.9、 4.2、 4.5、 4.8、 5.1、 5.4、 5.7、 6.0、 6.3、 6.6、 6.9、 7.2、 7.5、 7.8、 8.1、 8.4、 8.7、 9.0、 9.5、 10,0 (mg/mL)的水溶液。調節此溶液的pH后，過濾 除菌，無菌條件下在每小瓶中分裝2mL，常規凍千。 實施例3: FPP凍干制劑，pH比較例
在例1中，用不同pH的10mM磷酸緩沖液，代替pH7.0的FPP水溶液， 分別得到pH為5.8、 6.0、 6.2、 6.4、 6.6、 6.8、 7.0、 7.2、 7.4、 7.6、 7.8、 8.0的 水溶液。過濾除菌后，無菌條件下在每小瓶中分裝2mL，常規凍干。 實施例4: FPP凍干制劑，氯化鈉含量比較例
在例1中，用不同含量的氯化鈉加入量，代替含量為140mM氯化鈉的FPP 水溶液，分別得到氯化鈉含量為100、 120、 140、 160、 180、 200、 220、 240、 260、 280、 300 (mM)的水溶液。調節此溶液的pH后，過濾除菌，無菌條件下 在每小瓶中分裝2mL，常規凍干。 實施例5: FPP凍干制劑，穩定劑種類及含量比較例
在例1中，加入10mM、 50mM、 100mM、 150mM、 200mM含量的氨基酸 如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、天冬 氨酸鈉、甘氨酸、丙氨酸及硫酸葡聚糖鈉，分別得到不同含量、不同氨基酸種 類的水溶液。調節溶液的pH后，過濾除菌，無菌條件下在每小瓶中分裝2mL， 常規凍干。
實施例6: FPP凍干制劑，緩沖劑種類比較例
在例1中，用不同含量的檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液代替磷酸緩沖液，得 到的水溶液調節pH后，過濾除菌，無菌條件下在每小瓶中分裝2mL，常規凍干。 實施例7: FPP凍干制劑，優化例
用含有140mM氯化鈉、100mM精氨酸，0. 01%聚山梨醇酯80的10mM的 磷酸緩沖液(pH6. 5 )溶解FPP，并使FPP終濃度為lmg/mL，過濾除菌后，得
6'到FPP水溶液。調節此溶液的pH后，無菌條件下在每小瓶中分裝2mL，常規 凍干。
實驗例1:對FPP溶解度的評價
(1) FPP溶解度的評價方法
在試管中稱量FPP，加入含有各種濃度的氯化鈉以及穩定劑、0.01%聚山梨 醇酯80的10mM磷酸鈉緩沖液后，恒溫保持24小時，離心分離未溶解的FPP (15， 000rpm， 10分鐘)，取上清作為試樣。用親水性Durapore濾膜Millipore GV (0.22,)過濾，適當稀釋，用紫外吸收法定量測定得到的溶液中的FPP濃度， 以計算FPP的飽和溶解度。
紫外吸收法定量測定的具體方法是
將待測的蛋白質溶液稀釋到光密度在0.2至2.0之間，在波長280rnn和 260nm處以相應的溶劑作空白對照，分別測定待測樣品的光密度值(OD28()和 OD26Q)。應用280nrn和260nm的吸收差法經驗公式直接計算出蛋白質濃度。
蛋白質濃度(mg/mL) =1.45XOD280—0.74XOD260
(2) pH對FPP溶解度的影響
采用實施例3的方法配制pH不同的溶液，在4'C以及2(TC按(1)的方法 檢測FPP的溶解度，其結果是，隨著pH的降低，FPP的溶解度緩慢增加，pH5. O或以下溶解度顯著上升。并且在任何情況下，隨著溫度上升，溶解度也相應增 .加。
(3) 氯化鈉濃度對FPP溶解度的影響
采用實施例4的方法配制含有不同濃度的氯化鈉的溶液，在4'C以及20°C 按(1)的方法檢測FPP的溶解度，其結果是，隨著氯化鈉濃度的上升，FPP的 溶解度顯著增加。并且在任何情況下，隨著溫度上升，溶解度也相應增加。
(4) 各種穩定劑對FPP溶解度的影響
采用實施例5的方法配制含有不同濃度的、不同穩定劑種類的溶液。在96 孔微量滴定板中每孔分別加入200 uL， 4"C保存48小時后，通過濁度測定儀測 定其濁度，以反映FPP的溶解度，溶液的溶解度越低，溶液的濁度越高。
對于添加物研究的結果表明，下述物質對FPP溶解度的保持具有穩定作用。 ①氨基酸類精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸鈉、天冬氨酸鈉、谷氨酰
胺、半胱氨酸、脯氨酸(0.05M時具有效果)②多糖類硫酸葡聚糖(0.1。^時具有效果) 實驗例2:凍干前后的FPP水溶液的性狀
為了測定凍干過程中FPP的物理穩定性的變化，將凍干前的FPP水溶液以
及凍干后直接用純化水再溶解的FPP水溶液于4'C保存24小時后，目測觀察溶 液的性狀，同時也對凍干制劑再溶解所需的時間以及滲透壓比進行測定。
此實驗剔除了混濁、難溶，以及滲透壓比偏離較大的配方。 實驗例3:凍干制劑保存復溶后的性狀
將實驗例2中篩選的配方，制備凍干制劑之后，于25"C、 4(TC、 5(TC保存 l個月后，再次測定溶液的性狀，同時也對凍干制劑再溶解所需的時間以及滲透 壓比進行測定。
此實驗剔除了保存后產生混濁、難溶，以及滲透壓比偏離較大的配方。
實驗例4:凍干制劑中聚集體含量變化
對于實施例3篩選的配方，制備凍干制劑之后，凝膠過濾法測定凍干后(原 始值)、以及25°C、 40°C， 5(TC保存1個月后的凍干制劑中聚集體含量與FPP 含量的比。觀察到隨著保存溫度的上升，聚集體有生成增加的傾向，但是添加 精氨酸、賴氨酸以及組氨酸后，即使高溫保存，也僅生成很少量的聚集體(聚 集體生成率4(TC時約3^或以下，5(TC時約5—9^或以下)，并且物理化學性 質穩定。
實驗例5: pH對聚集體生成的影響
對于實施例3篩選的配方，制備不同pH的凍干制劑之后，凝膠過濾法測定 凍干后(原始值)、以及25°C、 40°C， 5(TC保存1個月后的凍干制劑中聚集體 含量與FPP含量的比。觀察到pH偏堿配方的凍干制劑在5(TC保存時，隨著時 間的延長，聚集體的生成增多；而pH在6.5或以下的制劑中聚集體生成少，在 '弱酸性pH區域可使穩定性提高。 實驗例6:凍干制劑的生物活性變化(比活性)
按照實驗例1一5的篩選，得到實施例7的配方，制得的凍干制劑在25t:、 5(TC保存2個月，或在1(TC、 25t:保存1.5年。將其凍干制劑再溶解后的水溶 液的生物活性按下述方法進行測定。
生物活性的測定方法
采用PK-15 (豬腎細胞)細胞-VSV(水泡性口炎病毒)系統微量細胞病變抑制法測定其活性(方法見《中國生物制品規程》2000版)
用凍干制劑再溶解后的水溶液作為測試品，以相應劑量的干擾素作為標準 品，待PK-15細胞在96孔板上貼壁長成70%豐度單層后，分別加入10倍稀釋 的測試品或標準品，每個稀釋度接6 L，陰性對照孔只加測試品或標準品不加 病毒，陽性對照是只加病毒不加測試品或標準品，孵育24h后，加入100TCID50 的VSV病毒進行攻毒，48h后觀察可見陽性對照孔出現病變，陰性對照孔細胞 狀態良好。觀察細胞孔典型病變的稀釋度，并將測試品的比活性除以標準品的 比活性，得到效價(％)。
結果測試品與標準品均在10'"咅稀釋度孔中發現水泡性口炎病毒在PK-15 細胞上的典型病變，稀釋度高于10^時，細胞都嚴重病變。
結論依實施例7的配方制得的凍干制劑即使高溫保存，生物活性也幾乎 沒有變化，具有穩定的生物活性。
產業上的實用性
本發明的凍干制劑可用于制備臨床上有用的含有FPP的水溶液，并且該制 劑在凍干時及凍干后的保存時聚集體生成少，穩定性優良。此外，該制劑還具 有凍干時具有良好的結塊形成性，再溶解性優良的特征，進而可用于制備具有
注射劑適宜的pH和滲透壓比的制劑。
權利要求
1、一種豬血清白蛋白與豬或人干擾素的融合蛋白的凍干制劑，其特征為含有融合蛋白、防止融合蛋白生成聚集體的穩定劑、氯化鈉、以及緩沖劑，這種凍干制劑由融合蛋白的濃度不超過10mg/mL的水溶液制備得到，且用于制備再溶解后融合蛋白的濃度不超過10mg/mL的水溶液。
2、 如權利要求1所述的凍干制劑，其中，穩定劑選自精氨酸、賴氨酸、組氨 酸、谷氨酰胺、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、硫酸化多糖類、以及這些物 質的可藥用鹽構成的組，其使用量足以防止FPP在凍干時和/或凍干后保 存時生成聚集體。
3、 如權利要求1所述的凍干制劑，其中，緩沖劑為磷酸鹽。
4、 如權利要求1所述的凍干制劑，其中，凍干前和/或再溶解后的水溶液具 有注射劑適宜的pH，其pH在5.8至7.8的范圍。
5、 如權利要求1所述的凍干制劑，其中，凍干前和/或再溶解后的水溶液具 有注射劑適宜的滲透壓比，其滲透壓比在1至2的范圍。
6、 如權利要求1所述的凍干制劑，它可以進一步含有聚氧乙烯醚類表面活性 劑。
7、 如權利要求1所述的凍干制劑，它在小瓶或安瓿瓶中制備。
全文摘要
含有用豬血清白蛋白與豬或人干擾素人工結合的融合蛋白、精氨酸或賴氨酸等穩定劑、氯化鈉、以及緩沖劑的凍干制劑，它由濃度不超過10mg/mL的融合蛋白的水溶液制備得到，和/或用于制備再溶解后融合蛋白的濃度不超過10mg/mL的水溶液，并且保存穩定性優良。
文檔編號A61K38/38GK101450205SQ20081023159
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月31日 優先權日2008年12月31日
發明者李智濤, 李玉林, 王云龍, 陳小科, 潔 韓 申請人:河南省生物工程技術研究中心