專利名稱：對蛋白制劑中的表面活性劑進行定量的方法
技術領域：
本發明涉及從表面活性劑制劑中去除組分的方法，以及測定制劑中表面活性劑的方法。
蛋白制劑比如人血清白蛋白(HAS)和重組人白蛋白(rHA)，加熱處理后形成顆粒是已知的問題(EP 0 341 103)。顆粒被認為是通過在空氣/液體界面和其他疏水性表面的蛋白變性而形成的(Manning，M.C.，Patel，K.和Borchart，R.T.(1989)，Pharmaceutical Research，6，903-918；Thurow，H.和Geisen，K.(1984)，Diabetologia，27，212-218.)。顆粒的形成能夠通過向所述蛋白制劑中加入表面活性劑而被抑制。
可以使用10～20μg.mL-1或更大濃度的聚山梨酯80作為對rHA最終產品的formulant以防止顆粒形成。EP 0 341 103討論了使用至多50mg.L-1濃度的不同表面活性劑來穩定人白蛋白溶液。很多其他藥物蛋白制劑包含表面活性劑。例如，OrthocloneTMOKT3(Janssen-Cilag GmbH，Germany)含有大約0.2mg.mL-1的聚山梨酯80；ActivaseTM50(Genentech，Inc.，CA.，USA)在每小瓶50mL總體積中含有≤4mg的聚山梨酯80；VepesidTMJ 100(BristolLaboratories NJ，USA)在其他成分中含有400mg的聚山梨酯80；以及NovoSevenTM240(Novo NordiskA/S，Denmark)在其他成分中含有0.65mg的聚山梨酯80。
因此，表面活性劑能夠代表包括藥物蛋白制劑在內的蛋白制劑中的顯著formulant。如此，就需要有對最終產品中的表面活性劑進行測定的規定要求。測定的準確度對于藥物制劑尤其重要。然而，在蛋白的存在下準確地評價表面活性劑的含量是不可能的，因為對于表面活性劑所采用的檢測技術比如光譜法、高效液相色譜法、界面張力測定術、毛細管電泳、總有機碳(TOC)滴定法和TLC等也檢測蛋白。因此該蛋白含量導致對表面活性劑含量的過度估算。
Garewal(Anal.Biochem.，54，319-324，1973)提供了測定蛋白水溶液中表面活性劑含量的方法。該方案教導，作為第一步，加入乙醇以破裂膠束，隨后加入硫氰酸鈷銨(ACT)。被Garewal例證的方法使用了Triton X-100表面活性劑水溶液，ACT連接到該表面活性劑上并且形成藍色絡合物。然后Garewal加入了不互溶的但ACT-Triton X-100可溶于其中的有機相(二氯化乙烯)。將該絡合物移入有機相并將該有機相與水相相分離。最后，通過記錄該有機相580nm～700nm的光譜來測定有機相中TritonX-100的含量；認為在622nm和687nm處吸光度的差值與存在的Triton表面活性劑的量成比例。
Garewal研究了向Triton X-100的水溶液中引入蛋白，牛血清白蛋白(BSA)，對該方法有效性的影響。對至多666μg.mL-1的BSA濃度進行了考察。使用較低的BSA濃度例如267μg.mL-1，引起提取效率降低到大約85％，但是將蛋白的濃度提高到666μg.mL-1時沒有發現在提取效率上引起任何進一步的顯著降低。Garewal總結是因為與ACT反應的聚(氧乙烯)基團在生物學組分(例如蛋白)中稀少，因此可期望最小的干擾并且此處說明的該方法適合于生物化學測定。
Garewal的方法在過去的30年中是生物制品中表面活性劑定量所選擇的方法。經過微小的修改，Garewal的方法出現在WCBP 2002，第六屆關于Regulator and Analytical Sciences for Biotechnology Health Products的會議上(2002年1月27～30日)的由美國馬薩諸塞州劍橋Biogen公司的，Lanteigne，D.和Kobayashi，K.所做題目為“Quantitative Determination of Polysorbate inFormulated Protein-Based Biopharmaceuticals by a Direct Colorimetric Method”的展板中。發表說明了對52mg.mL-1單克隆抗體制劑中聚山梨酯80(以商標″Tween 80″銷售)的測定。Lanteigne和Kobayashi指出，當樣品中含有“高”濃度的蛋白(例如52mg.mL-1)時，就需要使用“蛋白去除步驟來清除活性藥物物質(即蛋白)的可能干擾”。Lanteigne和Kobayashi用乙醇沉淀制劑中的蛋白來陳述該步驟，包括在零下30℃將樣品孵化過夜(離心和分離上層清液)，然后加入ACT來絡合表面活性劑并使用二氯甲烷作為有機液相提取該ACT-表面活性劑絡合物。
然而，隨著研究我們驚奇地發現，與他們的教導相反，該Lanteigne和Kobayashi法不能提供對蛋白溶液中表面活性劑含量的準確測定。這個方法的準確度以及基本Garewal法的準確度在較高蛋白濃度時尤其差。例如，如下面所說明的(見對比實施例1)，當對表面活性劑溶液中蛋白含量大于50mg.mL-1的樣品進行測定時，Garewal法給出了令人誤解的結果。不期望Garewal法對含有200mg.mL-1蛋白的溶液提供準確的表面活性劑測定。這是因為這些方法沒有從所要分析的表面活性劑樣品中除去蛋白組分。而且，我們證明被Garewal和被Lanteigne和Kobayashi建議的乙醇加入步驟導致表面活性劑不可接受的高度損失，并且因此提供了不可信的數據。我們也證明當用Lanteigne和Kobayashi說明的ACT/二氯甲烷方法提取表面活性劑時，去除表面活性劑制劑中的蛋白含量導致不可接受的表面活性劑損失。
為了克服這些不期望的問題，我們設計了從給定的樣品中將蛋白和其他組分與表面活性劑分離的新方法，據此提供更完全的表面活性劑制劑，當其被分析時，提供的結果更代表它所取自的原始樣品中表面活性劑的真實含量。而且，本發明的方法不要求為了去除蛋白而將樣品孵化過夜的時間消耗步驟，并因此是比Lanteigne和Kobayashi所說明的方法實行起來更為有效的方法。
據此，在本發明的第一個方面，提供從液相表面活性劑制劑中去除蛋白組分的方法，其包括(a)提供一種含有蛋白組分的液相表面活性劑制劑；(b)向步驟(a)的制劑中加入絡合劑并且讓該絡合劑與該表面活性劑形成絡合物；(c)與步驟(b)同時或隨后，分別向步驟(a)的制劑或步驟(b)的產物中加入可混溶的沉淀劑，以形成液相反應混合物并且讓該可混溶的沉淀劑沉淀該液相反應混合物內的蛋白組分；和(d)從步驟(c)的產物中將所述絡合物與沉淀的蛋白組分相分離以提供純化了的液相表面活性劑制劑；其中該絡合物保留在所述液相反應混合物之內的溶液中，并且步驟(d)將該絡合物保留在該液相中。
任何表面活性劑類型都能夠通過本發明第一方面的方法來純化。表面活性劑是能夠起降低液體表面張力作用的分子。表面張力是作用在液體表面的力，趨向于將表面的面積最小化；在數量上，它是作用在表面上單位長度切線方向的力。水的表面張力在室溫(20℃)用張力計測量時是72dyne/cm；表面活性劑能將該值降低到典型地不超過50dyne/cm的表面張力，例如大約30～50dyne/cm。
典型地，表面活性劑為非離子的，即具有不帶電的親水性頭基。非離子表面活性劑的實例包括具有聚(氧化烯)基團的表面活性劑，比如聚(氧乙烯)基團、醇基或另外的極性基團。適合的非離子表面活性劑可以具有疏水基和活潑氫原子，比如具有氧化烯尤其是只具有氧乙烯或還具有氧丙烯的脂族醇、酸、酰胺或烷基酚。因此，該非離子表面活性劑可以是烷基酚和環氧烷的縮合物；聚氧化烯失水山梨糖醇油酸酯；或聚氧化烯二醇(polyoxyalkyleneglycol)。
具體的非離子表面活性劑化合物包括烷基(C6-C22)酚環氧乙烷縮合物、脂族(C8-C18)初級或次級直鏈或支鏈醇與環氧乙烷的縮合產物，以及環氧乙烷與環氧丙烷和乙二胺的反應產物的縮合制備的產物。其他非離子表面活性劑化合物包括長鏈叔胺氧化物、長鏈叔膦氧化物和二烷基亞砜。非離子表面活性劑也可以是糖酰胺，比如多糖酰胺，比如在US 5,389,279中說明的乳糖酸酰胺(lactobionamide)或在US 5,009,814中說明的糖酰胺。這種類型的其他典型表面活性劑包括Igepal DM 730、Igepal DM 530、Igepal DM 210、Igepal CO880、Igepal CO 530、聚乙二醇，包括以商標Brij銷售的化合物(比如聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij 30)，月桂醇醚(Brij 35)，聚氧乙烯(20)鯨蠟醇醚(Brij 58)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(Brij 78)和聚氧乙烯(20)油醇醚(Brij 92))，和聚氧乙烯脂肪酸酯，包括以商標Myrj銷售的化合物(比如Myrj51)。典型的非離子表面活性劑包括聚氧乙烯辛基酚(比如TritonX-100)；烷基苯氧基聚乙氧基(3)乙醇，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯(Tween20)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯(Tween40)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單硬脂酸酯(Tween60)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三硬脂酸酯(Tween65)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯(Tween80)，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇三油酸酯(Tween85)，聚氧乙烯(20)棕櫚酸酯(G2079)，聚氧乙烯(20)月桂醇醚；聚氧乙烯(23)、聚氧乙烯(25)氫化蓖麻油(G1292)和聚氧乙烯(25)氧丙烯單硬脂酸酯(G2162)。
適合用于本發明第一方面方法的其他表面活性劑可以為陰離子的，具有負電荷頭基。陰離子表面活性劑的實例包括長鏈脂肪酸、磺基琥珀酸鹽、烷基硫酸鹽、磷酸鹽和磺酸鹽，比如十二烷基硫酸鈉、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、和牛磺膽酸鈉。
陽離子的，具有正電荷頭基。陽離子表面活性劑包括質子化了的長鏈胺和長鏈季胺類化合物，比如十六烷基三甲基溴化銨(Cetavlon)、鯨蠟基三甲基溴化銨和N-十六烷基氯化吡啶。
兩性的，具有兩性離子的頭基。兩性表面活性劑的實例包括甜菜堿和某些卵磷脂。
表面活性劑可以有一個或多個氧化烯基團。任何氧化烯基團都可以出現，比如氧乙烯、氧丙烯、氧丁烯等。在商業可獲得的表面活性劑中氧乙烯基團是常見的。多氧化烯基團可以以聚合物(例如均聚物、共聚物或嵌段共聚物)出現，即作為聚(氧化烯)基團，比如均聚體的聚(氧乙烯)基團。對于表面活性劑來說含有六個或更多個氧化烯基團是通常的，盡管本方法對具有較少比如5、4、3、2、或1個氧化烯基團的表面活性劑也是適用的。表面活性劑可以為具有一個或多個聚(氧乙烯)基團的非離子表面活性劑，比如聚山梨酯、辛基酚基環氧乙烷縮合物、環氧乙烷/聚環氧丙烷嵌段共聚物、聚氧化烯二醇、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯烷基烯丙基醚等。
聚山梨酯(也叫做聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，以注冊商標Tween銷售)是衍生于失水山梨糖醇酯的非離子表面活性劑(Becher，P.″Polyol Surfactants″inNonionic Sulfactants，Schick，M.J.Ed.(Dekker，New York，1967)，247-299頁；Chislett，L.R.和Walford，J.(1976)Int Flavours Food Addit.，7，61；Varma，R.K.等(1985)Arzneimittel-Forsch，35,804)。優選的聚山梨酯包括聚山梨酯20、21、40、60、65、80、81、85等。尤其優選的表面活性劑為聚山梨酯80，它的通式(I)為 w、x、y、z的總和是20辛基苯氧聚乙氧基乙醇(也叫做辛苯聚醇，以商標Triton X、Igepal CA和Polytergent G銷售)是非離子表面活性劑，可以通過將異辛基酚與環氧烷比如環氧乙烷反應來制備。通常商業可獲得的辛苯聚醇的每個分子中的氧乙烯單元的平均數目(n)典型地在5～15之間。所述通式用下面式(II)代表 在以Triton X-100銷售的典型的這種表面活性劑中，n是大約9.5。
聚乙烯聚丙烯乙二醇(亦稱為泊洛沙姆，以注冊商標Pluronic銷售)是具有下面式(III)代表的通式的一系列非離子表面活性劑HO(CH2CH2O)a(CH-(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH (III)其中，b至少是15，并且(CH2CH2O)a+(CH2CH2O)c在20～90％重量變化。該分子量范圍在1,000～16,000g.mol-1或更多。關于泊洛沙姆的綜述，見Schmolka，I.R.(1967)Am.Perfumer Cosmet.，82(7)，25-30。泊洛沙姆的具體實例包括“Pluronic L62LF”，其中a＝7，b＝30，c＝7；“Pluronic F68”其中a＝75，b＝30，c＝75；和“PluronicL101”其中a＝7，b＝54，c＝7。
用于本發明第一方面方法的表面活性劑可以還含有一個或多個直鏈或支鏈烴鏈。在商業可獲得的表面活性劑中典型可見的烴鏈包括脂肪酸。脂肪酸通常在烴骨架中具有至少六個碳原子，并且較大的骨架是通常的，比如C16和C18。據此，所述烴鏈可以是油酸(即C16脂肪酸)基團。該表面活性劑可以含有聚(氧化烯)基團和烴鏈二者。例如，聚山梨酯含有聚(氧乙烯)基團和油酸基團二者；辛苯聚醇包含支鏈烴鏈和聚(氧乙烯)基團。
蛋白組分可以包括由原料制備的任何純化了的表面活性劑制劑中不期望的任何蛋白分子。具體地該組分可以為干擾任何后續表面活性劑定量準確度的組分。如果組分包含肽、多肽或蛋白或由這些所組成，那么它就是蛋白組分。短語“肽、多肽或蛋白”包括天然存在的或人造的氨基酸的任何聚合物，優選以肽鍵連接的。優選肽、多肽或蛋白在長度上至少是10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個氨基酸。該蛋白組分可以是天然存在的或重組產生的蛋白，比如白蛋白、白蛋白融合蛋白比如WO 01/77137(作為參考在此引入)中提到的、單克隆抗體、依托泊苷、血清蛋白(比如凝血因子)、antistasin、壁虱抗凝肽(tick anticoagulant)或在WO 01/77137中公開的任何一種或多種白蛋白“融合配偶體(fusion partners)”，如從白蛋白中分離的個體蛋白。
不象現有技術方法，本發明第一方面的方法是能夠有效地將表面活性劑與高度濃縮的蛋白組分相分離，例如，在步驟(a)的液相表面活性劑制劑中蛋白組分可以以至少50、75、100、150、200mg/ml的濃度存在，其中組分的水平以每表面活性劑制劑體積中的重量計。
測量步驟(a)的液相表面活性劑制劑中表面活性劑與蛋白組分的比例是恰當的。據此，當以存在于步驟(a)的液相表面活性劑制劑中每蛋白組分分子質量中的表面活性劑分子質量來表達時(即ppm)，表面活性劑與蛋白組分的比例可以小于4,800ppm，比如小于4,500ppm、4,000ppm、3,500ppm、3,000ppm、2,500ppm、2,000ppm、1,500ppm、1,000ppm、900ppm、800ppm、700ppm、600ppm、500ppm、400ppm、300ppm、200ppm、110ppm、100ppm、90ppm、80ppm、75ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、18ppm、17ppm、16ppm、15ppm、14ppm、13ppm、12ppm、11ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm或更少。
術語“液相表面活性劑制劑”包括包含有表面活性劑的任何液相制劑。該制劑可以是含水的。
所說的“提供”，在提供液相表面活性劑制劑的上下文中，我們包括取整體樣品、取較大制劑中的等分部分或由同一基本批(basic lot)制備的一批樣品。
術語“絡合劑”包括因具有與一個或多個表面活性劑分子形成弱鍵的能力而能來改變表面活性劑疏水特征的化合物。上述定義的表面活性劑是本方法條件下的。典型地絡合劑是含有多價金屬離子比如過渡金屬離子的化合物。例如，所述金屬離子可以是VI、VII、VIII、IX或X過渡金屬離子，比如釔、鎬、鈮、鉬、锝、釕、銠、鈀、銀、鎘、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉑、金、汞，但優選過渡金屬離子是第三過渡金屬離子比如鈷、鐵、銅、鋅、鎳、錳、鉻、釩、鈦和鈧。鈷化合物可以用作絡合劑。據此，該絡合劑可以是硫氰酸鈷銨(ACT)。ACT是用于絡合具有氧化烯或聚(氧化烯)(例如氧乙烯或聚(氧乙烯))基團的表面活性劑的適合的絡合劑。相似地，離子化合物比如離子(III)硫氰酸鹽可以用作絡合劑。
不象現有技術方法，本發明的方法不依賴有色絡合物的形成來確定表面活性劑的存在。因此，在本發明中使用的絡合劑不一定需要形成有色的絡合物。
將有效量的絡合劑加入到液相表面活性劑制劑中。換句話說，加入絡合劑的量足夠基本上絡合該液相表面活性劑制劑中全部的表面活性劑。典型地是過量添加。基本上絡合該液相表面活性劑制劑中全部的表面活性劑所需的絡合劑的量能夠采用該表面活性劑的來污染溶液通過絡合劑的經驗測試來確定。
所說的“讓絡合劑與表面活性劑形成絡合物”，我們是指該絡合劑的至少一部分與表面活性劑的至少一部分絡合。典型地，在將絡合劑加入到液相表面活性劑制劑中后，對該制劑進行混合以將該絡合劑分散在制劑中。讓絡合發生的最適宜條件將依賴于表面活性劑的性質和絡合劑的性質，并且典型地包括對該液相的溫度、壓力、pH和/或離子強度的改變。對于絡合有用的條件可以包括中性pH和低離子強度(Crabb和Persinger，1961，Journal of theAmerican Oil Chemist′s Society，41，752-755)。例如，當表面活性劑是聚山梨酯80并且絡合劑是ACT時，適合于讓絡合劑與表面活性劑形成絡合物的條件在下面的實施例中列出。
絡合物在形成之后保留在液相內的溶液中。因此在讓絡合劑與表面活性劑形成絡合物所使用的條件下(但是沒有任何蛋白存在)，基本上沒有絡合物形成沉淀。如果在于47,800g 4℃條件下將該液相離心15分鐘得到的片狀沉淀物中能夠收集的表面活性劑的量，小于在下列實施例中說明的采用HPLC測定的離心后從上清液中收集的表面活性劑的20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％重量，該絡合物就能被說成是保留在溶液中了。較低的百分數值是優選的。
“沉淀劑”是引起除了表面活性劑以外的其他組分沉淀的任何試劑。為了起到它的作用該沉淀劑必須在液相表面活性劑制劑中是“可混溶的”。換句話說，在所用的條件下，該沉淀劑不能形成與該液相表面活性劑制劑不可混溶的液相或固相。優選沉淀劑是在含水液相表面活性劑制劑中可混溶的。為了是水可混溶的，沉淀劑通常具有極性區域。典型地沉淀劑是有機的水可混溶溶劑。水可混溶的沉淀劑實例包括極性質子溶劑和極性非質子溶劑比如醇、氰基烷基、胺、酰胺、羧酸、醛、酮、乙二醇、醚、烷基鹵化物和芳香烴。優選的沉淀劑包括丙酮、乙腈、異丙醇、甲醇和乙醇。乙腈提供較好的在表面活性劑產量和污染物攜帶之間的平衡。而且，乙腈具有優于丙酮的優點包括(a)丙酮的使用要求使用玻璃器皿進行上清液操作，這可能由于清洗而被去污劑污染，而乙腈的使用允許使用用完就扔掉的塑料容器，因此將污染的風險最小化；并且(b)丙酮具有-18℃的閃點，低于典型的離心溫度，為了安全最好使用乙腈，其閃電為+13℃。
沉淀劑的加入是在絡合劑加入到液相表面活性劑制劑的同時、或更一般地是之后，但不是之前。這是本發明與現有技術的一個很重要的差別。Garewal(op.cit.)與Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)都是在絡合劑(ACT)加入之前將沉淀劑(乙醇)加入到表面活性劑制劑中的。這引起一些表面活性劑由于被代入到了沉淀中而從溶液中損失。因此，所得的上清液中表面活性劑的定量是對起始制劑中表面活性劑量的不準確的測量。不用聯系理論，可以相信通過在加入絡合劑的同時或更一般地在其之后而不是之前加入沉淀劑，蛋白組分去除的效率得到改進。絡合劑將全部的該表面活性劑基本上保留在溶液中而蛋白組分被沉淀了。
在一些情況下，沉淀劑的后續加入可以提高絡合劑的作用并且導致表面活性劑和絡合劑更大程度的形成絡合。不用聯系理論，我們相信這是因為沉淀劑進一步將表面活性劑與蛋白組分分離，因此使表面活性劑被絡合劑更好的絡合。
當“讓可混溶的沉淀劑在該液相反應混合物內沉淀蛋白組分”時，該液相反應混合物可以在利于蛋白組分沉淀而基本上不擾亂絡合物的條件下孵化。所用的實際條件將依賴于所談論系統內的具體組分的性質。本領域的技術人員能夠憑經驗試驗來決定對于系統組分的任何給定組合的適當條件。
絡合物保留在液相反應混合物內的溶液中。在此上下文中，如果在于47,800g 4℃條件下將該液相反應混合物離心15分鐘得到的片狀沉淀物中能夠收集的表面活性劑的量，小于在下列實施例中說明的采用HPLC測定離心后從上清液中收集的的表面活性劑的20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％重量，則絡合物“保留在溶液中”。較低的百分數值是優選的。
所說的“從步驟(c)產物中將所述絡合物與沉淀的蛋白組分相分離”的步驟能夠采用本領域中已知的用于從溶液中分離沉淀的任何適合方法來完成，只要它“將該絡合物保留在液相中”。基本上全部的絡合物都被保留在步驟(c)的液相產物中。毫無疑問，如果該絡合物分配到分離的不可混溶的液相中，它就不被保留在液相中了。這是本發明方法與Garewal(op.cit.)與Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)方法的又一重要差別。Garewal(op.cit.)與Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)方法通過加入不可混溶的有機相(二氯化乙烯或二氯甲烷)來從水性溶液中分離絡合的表面活性劑。不用聯系理論，我們相信表面活性劑絡合物分配進入分離的液相導致巨大的污染物攜帶。與此對照，我們不依賴絡合物分離的這種形式，并且因此實現了蛋白組分的更大去除。
分離步驟典型地是通過將反應混合物離心，這樣使沉淀的蛋白組分形成片狀沉淀物并且絡合物被保留在上清液中，并將上清液從片狀沉淀物中分離來進行。最佳的離心參數比如g和持續時間將根據形成的沉淀的性質而變化。從以下實施例中能夠得到指導，盡管本領域的技術人員能憑經驗測驗決定適當的條件。
然而，本領域的技術人員應該意識到在本領域中可以有多數其他方法來將液相制劑與沉淀分離，比如過濾。
分離步驟的產物是純化了的液相表面活性劑制劑。所說的“純化了的液相表面活性劑制劑”包括基本上不含沉淀的蛋白組分的液相表面活性劑制劑的意義。在此上下文，如果液相表面活性劑制劑能在下面實施例中定義的條件下應用于疏水固相萃取柱，不堵柱子或在SPE純化后不顯著影響表面活性劑的純度，那么該液相表面活性劑制劑就是基本上不含沉淀的蛋白組分。
本發明第一方面的方法可以包括一個或多個附加的純化步驟來對該純化了的液相表面活性劑制劑中的表面活性劑進一步進行純化。任何適合的方法都可使用。
在一個實施方案中，本發明第一方面的方法包括將純化了的液相表面活性劑制劑中的絡合物非共價結合地結合到固相上。典型地是使用疏水固相，因為它吸附表面活性劑。或者，可以使用親水固相，它吸附保留在該純化了的液相表面活性劑制劑中的蛋白組分，而不保留表面活性劑組分，因此使表面活性劑作為洗出液被收集。
如果絡合物在暴露于固相之前解體可能是有幫助的。技術人員熟知使絡合物解體的方法。具體細節依賴于表面活性劑和絡合劑的性質。例如，可以使用鰲合劑。典型地鰲合劑將與表面活性劑競爭來結合到絡合劑的多價金屬離子上。據此，當絡合物劑是ACT(即該多價金屬離子是鈷)時，解體該絡合物的適合方法為在該純化了的液相表面活性劑中加入鰲合劑比如乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一個實施方案中，在附加步驟中使用的固相是固相萃取(SPE)柱或盤。
固相萃取(SPE)柱或盤可以是疏水的。疏水固相萃取(SPE)柱或盤的實例包括聚苯乙烯二乙烯基苯(例如下面例舉的Bakerbond SDB1柱，Merck提供的Licrolut EN PDBV柱或Phenomenex提供的StrattaX)或C2-24烷基柱。
在本發明第一方面的方法中，表面活性劑是非共價地結合到固體基質上的，該固體基質可以用使結合的表面活性劑保持結合在基質上而任何保留的蛋白組分都被洗掉的液體來洗滌。適合的洗滌液體是本領域熟知的并且可商業獲得的。適合的洗滌液體包括異丙醇、己烷和乙腈。如果洗滌液體是酸性或堿性的可能有幫助。例如，乙酸能夠以適當濃度的比如0.1％(v/v)存在于己烷中以提供酸性洗滌液體。能夠以適當濃度的銨或三乙胺比如0.5％(v/v)銨或1％(v/v)三乙胺存在于己烷中以提供堿性洗滌液體。所述適當的洗滌條件能夠被技術人員根據表面活性劑和固相的性質來決定。
基質可以用不從基質中去除表面活性劑的液體洗滌。典型地，適當的洗滌液體可以是足夠親水性的以不擾亂表面活性劑與基質的相互作用，或者可以是足夠疏水性的以沉淀溶液中的表面活性劑。確定適合的洗滌液體的方法能夠按照如下進行。如果表面活性劑(例如聚山梨酯80)的至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或基本上100％能夠被在下列條件下從基質(例如聚苯乙烯二乙烯基苯SPE柱，比如下面例舉的Bakerbond SDB1柱，Merck提供的Licrolut EN PDBV柱，或Phenomenex提供的StrattaX，或其等價物)上去除，該液體就被認為是會沉淀表面活性劑的(a)柱子是根據下面實施例(2)的步驟2(v)(a)制備的。
(b)柱子負載10mL的15μg.mL-1表面活性劑水溶液(大約0.5mL.min-1)。
(c)柱子用3×1mL的所述的洗滌液體洗滌。通過在真空下讓空氣通過該柱子至少30秒來使其完全干燥。
(d)按照實施例2的步驟(v)(d)-(g)洗脫每個柱子上的表面活性劑并且收集，根據實施例2中步驟(vii)-(ix)所列出的方案用按照實施例2的步驟2(vi)設定的HPLC裝置測定表面活性劑的回收率。
(e)回收率應該由提取計算而得不用該考察溶劑洗滌。
因此技術人員能夠依據表面活性劑的性質和所用固體基質的性質選擇適合的洗滌液體。適合的洗滌液體可以為足夠強到沉淀固相上的表面活性劑或足夠弱到最小化或防止表面活性劑的洗脫。典型地該洗滌液體為水不溶性有機溶劑或水溶性有機溶劑。
適合的洗滌液體，尤其是在具有聚(氧化烯)(比如聚(氧乙烯))基團(例如聚山梨酯80)的表面活性劑的情況下，可以包括己烷等，比如氯仿或甲苯。適合的洗滌液體，尤其是在具有與固相牢固結合的基團比如去水山梨糖醇基團(例如聚山梨酯80)的表面活性劑的情況下，能夠是不洗脫表面活性劑的弱的洗滌液體，比如乙腈、異丙醇和/或三乙胺。技術人員應當理解，適當的話這些方式可以結合。例如，聚山梨酯80含有聚(氧乙烯)基團和去水山梨糖醇基團二者，因此強的和弱的洗滌液體都能使用。例如，我們發現下列洗滌液體對于聚山梨酯80是適合的30％(v/v)乙腈然后是異丙醇、含有1％(v/v)三乙胺的己烷最后是己烷。
根據表面活性劑的性質、基質的性質和要被去除的蛋白組分的性質可以采用進一步的洗滌步驟。
在洗滌步驟之后，典型地是表面活性劑從基質上洗脫并且作為洗出液收集。任何適合的洗脫液都能使用。我們發現甲苯∶乙醇(1∶1)混合物在實施例系列中提供了好的結果。
能夠將純化了的液相表面活性劑制劑或從其衍生的洗出液進行分析以測定表面活性劑的含量。技術人員熟知測定溶液中表面活性劑含量的方法。例如，如果表面活性劑含有至少六個氧乙烯基團，那么該表面活性劑能夠用ACT來絡合并且表面活性劑濃度可以用分光光度法測定，例如如Garewal(op.cit.)所說明的。或者，表面活性劑含量能夠用HPLC或水性GPC來測定，比如在下面實施例中說明的。
由于在被測樣品中蛋白組分的低水平，相比于根據現有技術方法進行的分析，該分析結果與初始液相表面活性劑制劑中實際的表面活性劑含量更緊密地相關。優選地，當用下面舉例的方法進行HPLC測定時，被測樣品中蛋白組分的水平在可檢測水平以下。
據此，當所用液相表面活性劑制劑是較大制劑的等分部分或一批制劑中的一個樣品時本發明方法能夠是有用的，并且該方法包括使純化了的表面活性劑制劑中或來源于此的更進一步的洗出液中如此測定的的表面活性劑含量與該較大制劑的或批中的其他樣品的表面活性劑含量相關的附加步驟。
進行了該相關后，使用者就能夠適當地標識該較大制劑或該批中的其他樣品，或者能夠提供適當的質量控制報告來反應如此測定的表面活性劑的含量。
既然本發明的方法提供比現有技術方法更準確的測定表面活性劑含量的方法，因此旨在用本發明方法分析并且用如此測定的表面活性劑含量標識的制劑將與現有技術制劑在其標簽或其他相關的數據上區分，它更準確地并且更精確地反應其含有的表面活性劑的水平。據此，這樣的產品更能夠順應控制要求。
據此，在本發明的第二個方面，提供了按照上述定義方法能得到的標識了的液相表面活性劑制劑。在優選的實施方案中，該液相表面活性劑制劑包括蛋白組分，比如上述討論的。優選該組分在步驟(a)中的液相表面活性劑制劑中以至少50、75、100、150、200mg/ml或更大的濃度存在，其中組分水平以每表面活性劑制劑體積中的重量計。
測量步驟(a)的液相表面活性劑制劑中表面活性劑與蛋白組分的比例是恰當的。據此，當以存在于步驟(a)的液相表面活性劑制劑中每蛋白組分分子質量中的表面活性劑分子質量來表達時(即ppm)，表面活性劑與蛋白組分的比例可以小于4,800ppm，比如小于4,500ppm、4,000ppm、3,500ppm、3,000ppm、2,500ppm、2,000ppm、1,500ppm、1,000ppm、900ppm、800ppm、700ppm、600ppm、500ppm、400ppm、300ppm、200ppm、110ppm、100ppm、90ppm、80ppm、75ppm、70ppm、60ppm、50ppm、40ppm、30ppm、20ppm、18ppm、17ppm、16ppm、15ppm、14ppm、13ppm、12ppm、11ppm、10ppm、9ppm、8ppm、7ppm、6ppm、5ppm或更少。
對于有技術的讀者，上述說明的方法在對含有表面活性劑的藥物制劑批的質量控制中是有用的是顯然的。質量控制是通過測試制造過程中產品的樣品典型地是小批或批樣品是否違反標準規格來維持制造產品的標準的體系，以此確保輸出產品符合標準的要求。這在需要符合控制要求的藥物產品的制造中是尤其重要的。因此，表面活性劑測定上下文中的“組分”一般是期望的藥學活性化合物。因此，該制劑的表面活性劑含量的質量控制可以采用上述定義的方法通過測定制劑樣品中的表面活性劑含量來進行。
據此，在本發明的第三方面，提供采用上述定義的方法進行質量控制的含有表面活性劑的藥物制劑。
本發明將通過參照下列圖和實施例進行更詳細地說明，其中

圖1顯示如對比實施例1中說明的采用金屬離子絡合形成物和溶劑提取物進行的聚山梨酯80的測定結果。
圖2顯示如實施例1中說明的不同白蛋白提取物的HPSEC色譜。
圖3顯示實施例2中使用的HPLC裝置。
圖4A顯示校準數據。
圖4B顯示實施例2中產生的線性標準曲線。
圖5顯示計算理論塔板數的色譜圖。
圖6顯示計算峰拖尾的色譜圖。
圖7顯示計算分離度的色譜圖。
對比實施例1下面的實施例是基于Garewal(op.cit.)方法進行的。
向5％和25％(w/v)的rHA制劑樣品中加入聚山梨酯80(Sigma的“Tween80”)達到終濃度為15μg.mL-1，并將其200μL的等分部分與2mL的ACT試劑(100mL Milli Q水中含17.8g硫氰酸銨和2.8g硝酸鈷)混合。
然后該混合物用2mL的氯仿于室溫混合15分鐘來提取。然后收集氯仿并且用再用4個1mL等分部分的氯仿進行重復提取。
于600nm處測定每份氯仿提取物的吸光度并且計算每份樣品的總吸光度(即在上述定義的條件下提取的總ACT絡合物)。
對用超純水(Millipore Corp.的Milli QTM水)和rHA(5％w/v)制備的標準聚山梨酯80溶液(0、0.5、5.0和50.0mg.mL-1)也重復該提取操作。
結果顯示于表1。
表1
當ACT試劑與聚山梨酯80在水溶液中混合時，導致能被提取入有機緩沖液的有色(藍色)不溶性鹽的形成。rHA的ACT試劑-溶劑提取產生比水得到的高的背景吸收(圖1)。這表明rHA含有聚山梨酯80以外的其他物質，該物質與ACT試劑反應產生比該法所期望的吸光度更高的吸光度。
用這種方法對rHA最終產品中聚山梨酯80的估算比已知濃度多了超過4000倍(表1)，這表示該方法是不準確的。在未加樣的rHA樣品中的高吸光度與測定的變異性結合大概是這一結果的解釋。用未加樣的rHA得到的高并且變化的干擾響應使得該方法不適合rHA最終產品中聚山梨酯80的直接測定。
對比實施例2為了克服當使用對比實施例1方法時出現的污染物問題，對包括使用C18SPE柱的附加純化步驟的效果進行了評價。
制備聚山梨酯80在超純水中最終濃度為50mg.mL-1，在rHA中為15μg.mL-1。向每份200μL的這些樣品中加入800uL的乙醇，再加入2mL的ACT試劑。然后向該混合物中加入5mL的氯仿于室溫混合15分鐘來提取。然后移取該氯仿提取物并在C18SPE柱上按照如下提取
采用離心蒸發法將SPE洗出液干燥并再懸浮于1mL(水提取物)或0.5mL(rHA提取物)的四氫呋喃(THF)中。然后測定每份重懸洗出物在600nm處的吸光度。
采用上述說明的步驟，對作為對照的不含聚山梨酯80的rHA的200μL等分部分也進行了提取。結果顯示于表2。
表2
“ND”指沒有測定。因為未加樣的rHA的吸收相當于50mg.mL-1標準，因此沒有計算這些樣品的回收率。即rHA樣品有很高的背景吸收。
由水得到的ACT-聚山梨酯80絡合物的回收率超過80％(表2)。用0.25～1.0mL的SPE洗脫體積來保持ACT-聚山梨酯80絡合物的該回收率(表2)。使用低洗脫體積可在減少重懸前洗出液干燥時間上是有益的。
采用形成ACT絡合物來從rHA中對聚山梨酯80的提取、溶劑提取和SPE導致含有或不含有聚山梨酯80的樣品基本上相同的吸光度(表2)。這表明在這些提取物中產生的顏色不完全歸因于聚山梨酯80的存在，并且可以由rHA污染物、賦形劑或該蛋白本身所產生。
因此，盡管使用C18SPE色譜能夠提取聚山梨酯80-ACT絡合物，也會產成很高的背景響應。
對比實施例3Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)所說明的對含有“高”濃度蛋白(例如52mg.mol-1)的溶液中表面活性劑水平進行測定的方法，涉及蛋白的乙醇沉淀，包括在加入ACT來絡合該表面活性劑以及使用二氯甲烷作為有機液相來對ACT-表面活性劑絡合物進行提取之前，將樣品于-30℃孵化過夜(加離心和分離上清液)。
我們發現Lanteigne和Kobayashi所建議的最初的乙醇沉淀步驟導致不可接受水平的表面活性劑損失。
用40mL的冷乙醇處理rHA(5％w/v)+10μg.mL-1聚山梨酯80的等分部分(10mL)。樣品在Sorval RC5C離心機中(轉子＝SS34)于20,000rpm.離心20分鐘。用旋轉蒸發干燥上清液(至大約2mL)，然后在C18SPE柱上提取。
用乙醇沉淀和之后的C18SPE對rHA的去除，并沒有使聚山梨酯80的回收率超過35％(沒有顯示數據)。這表明該蛋白沉淀導致了聚山梨酯80的損失，因為該C18SPE回收率比由水提取物(即沒有蛋白)得到的低。
Garewal(op.cit.)方法也包括，作為第一步，加入乙醇，盡管沒有如Lanteigne和Kobayashi說明的那樣還要將樣品在-30℃孵化過夜。我們發現Garewal建議的最初的乙醇加入步驟，或替代地加入相似的溶劑(在這種情況下可以是甲醇或異丙醇)，也導致不可接受水平的表面活性劑損失。
制備rHA(5％w/v)+10μg.mL-1聚山梨酯80并且取其10mL等分部分與5mL的甲醇、異丙醇或乙醇混合。然后將該處理過的樣品(15mL)按照上述在C18SPE柱上提取，洗出液如前述實施例1進行聚山梨酯80的測定。在C18SPE之前用30％異丙醇、甲醇或乙醇對rHA最終產品進行的預處理導致聚山梨酯80的回收率分別為7、25和51％。這些回收率對于控制測定來說是不可接受的低，并且將導致錯誤的結果。
對比實施例4在使用對比實施例3中說明的Lanteigne和Kobayashi(op.cit.)法時，除了觀察到的作為乙醇沉淀的結果表面活性劑損失之外，我們還證明加入ACT來絡合表面活性劑的步驟和使用二氯甲烷作為有機液相進行的ACT-表面活性劑絡合物提取步驟也引起表面活性劑的損失。
對10mL等分部分的rHA(5％w/v)+10μg.mL-1Tween80和10mL等分部分的超純水+10μg.mL-1聚山梨酯80中聚山梨酯80的回收率進行了比較。在與5mL的二氯甲烷混合之前向每份樣品中加入70mL的ACT試劑(100mL超純水中含17.8g硫氰酸銨和2.8g硝酸鈷)。將樣品孵化過夜。混合物以3000rpm離心5分鐘，棄去上層水相。加入一些無水硫酸銨晶體并且將該樣品混合并按照上述再離心。然后將二氯甲烷轉移到干凈的管中并且于氦氣流中干燥。然后將殘渣重懸于1mL甲醇中并在重懸于100mLTHF之前以離心蒸發干燥。然后將這些重懸的樣品按照實施例1中說明的進行聚山梨酯80的測定。
由水樣品得到的聚山梨酯80的回收率是82％。由rHA樣品得到的聚山梨酯80的回收率僅為21％。這表明Lanteigne和Kobayashi的表面活性劑回收率方案在有蛋白污染物存在時不能有效地提取表面活性劑。
實施例1對對比實施例1中所用方法進行的顯著修改包括·在ACT加入之后，而不是之前，加入蛋白沉淀劑；和·用離心而不是溶劑提取的方法將ACT-聚山梨酯80絡合物最初地與蛋白組分分離。
對六批(“A”～“F”)rHA進行了檢查。F批故意加入了15μg.mL-1聚山梨酯80。向10mL等分部分的rHA(250mg.mL-1)中加入2mL的ACT然后加入18mL的丙酮。
然后樣品渦旋混合并于4℃以47,800g離心15分鐘。取上清液并用含100mM EDTA的0.5MTris/HCl的pH 8.0緩沖液30mL(在Bakerbond SDB200mg/3mL柱上預提取過)稀釋。這些稀釋樣品然后采用50mg BakerbondSDB1柱進行如下固相萃取
然后該SPE洗出液用旋轉蒸發干燥，再懸浮于200μL四氫呋喃(THF)中，并用HPSEC分析，如下
在兩批(E和D)中只觀察到有輕微的污染(圖2)。然而，為了便于通過使用峰高而不是峰面積定量和/或使用未配方的rHA標準曲線(即該標準曲線能夠在加入聚山梨酯80之前采用rHA制備)來進行準確和精確的測定，該污染可忽略。
實施例2
1.受試藥物制劑OrthocloneTMOKT3OrthocloneTMOKT3((莫羅單抗-CD3)-Janssen-CilagGmbH，德國)的產品說明中指定每5mL安瓿在其他組分之中含有1mg的聚山梨酯80。對于分析，1.25mL的該產品用于測定，相當于0.25mg的聚山梨酯80。
VepesidTMJ 100((依托泊苷)-Bristol Laboratories NJ，美國)在其他組分中含有400mg的的聚山梨酯80。對于聚山梨酯80的分析，采用5μL的產品來測定。
NovoSevenTM240((凝固因子VIIa重組體)Novo Nordisk A/S，丹麥)在其他組分中含有0.65mg的聚山梨酯80。重構是按照該產品說明書說明的加入8.5mL美國藥典無菌注射用水來進行的。對于聚山梨酯80的分析，采用3mL的重構產品來測定。
2.聚山梨酯80的提取和分析聚山梨酯80的分析按照如下進行(i)使用下列裝置1mL，50mg Bakerbond SDB1 SPE柱(Mallinckrodt BakerB.V.)；3mL，200mg Bakerbond SDB 1SPE柱(Mallinckrodt Baker B.V.)；分析HPLC系統，具有適合50μL樣品環的自動進樣器，系統控制器和積分儀；適合上述HPLC系統的反射指數檢測器；Phenomenex Phenogel 50 5μm柱(300×7.8mm)；Phenomenex Phenogel 505μm保護柱(50×7.8mm)；HPLC柱加熱器和控制模塊(Waters，沒有插件)；Sterilin容器(70mL)；具有帽的玻璃螺帽小瓶(2mL，12mm×46mm)；具有轉子的適合12mm×46mm小瓶的Univap旋轉蒸發濃縮器；具有波紋頂密封的250μL玻璃HPLC樣品小瓶。
(ii)使用下列試劑硫氰酸銨，AR級(Fisher Chemicals)；六水合硝酸鈷，AR級(Fisher Chemicals)；乙腈，遠紫外級(Fisher Chemicals)；乙二胺四乙酸(二鈉鹽)，SigmaUltra級(Sigma)；三(羥甲基)氨基甲烷，Sigma級(Sigma)；鹽酸(濃的)，SLR級(Fisher Chemicals)；己烷，Distol級(Fisher Chemicals)；四氫呋喃，GPC級(Fisher Chemicals)；三乙胺，AR級(Fisher Chemicals)；異丙醇，HPLC級(Fisher Chemicals)；甲醇，HPLC級(Fisher Chemicals)；氯仿，HPLC級(Fisher Chemicals)；水，實驗室級；甲苯，GPC級(Fisher Chemicals)；乙醇，AR級(Fisher Chemicals)；聚山梨酯80，CAPP Raw原料34(Surfachern)；十六酸，SigmaUltra級(Sigma)。
(iii)使用下列溶液(a)OrthocloneTMOKT3、VepesidTMJ 100和NovoSevenTM240如上述所定義，用實驗室級水配到10mL；(b)含有15μg.mL-1聚山梨酯80的重組人白蛋白25％(w/v)水溶液(10mL)。
(c)ACT試劑(71.2g的硫氰酸銨和11.2g的六水合硝酸鈷溶于20mL的實驗室級水中，體積配到100mL).
(d)EDTA緩沖溶液(37.22g的乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)和60.55g的三(羥甲基)氨基甲烷溶解于大約900mL的實驗室級水中，通過加入濃鹽酸將pH調整到8.0，體積配到1L)。該溶液按照如下使用固相萃取來純化·使6mL的THF然后是6mL的實驗室級水在重力下流過3mL 200mgBakerbond SDB1 SPE柱來對其進行洗滌。
·使用Pharmacia P1泵讓6mL的所述EDTA緩沖液以大約4mL.min-1速度通過該SPE柱并棄去該溶液。
·將剩下的EDTA緩沖液以大約4mL.min-1速度通過該SPE柱并收集溶液用于測定。
(e)30％(v/v)乙腈(30mL的乙腈與70mL的實驗室級水混合)；(f)含1％(v/v)三乙胺的己烷(200μL的三乙胺溶解于19.8mL的己烷中)；(g)甲苯∶乙醇(1∶1)(10mL的甲苯與10mL的乙醇混合)；(h)聚山梨酯80標準溶液(將0.5000±0.0005g的聚山梨酯80在A級容量瓶中溶解于最終體積為50mL的實驗室級水中)。最終濃度＝10mg.mL-1；和(i)“系統適應性”標準溶液(將0.10g的十六酸和0.10g的聚山梨酯80在容量瓶中溶于最終體積10mL的四氫呋喃中最終濃度＝聚山梨酯80是10mg.mL-1，并且十六酸是10mg.mL-1；以200μL等分部分于-20℃儲存在玻璃瓶中)。
(iv)蛋白沉淀和去除按照如下進行(a)向所有的試管(標準的和受試的)中都加入4mL的ACT試劑，并將該混合物溫和地攪拌混合。
(b)向所有的試管(標準的和受試的)中都加入20mL的乙腈。將試管蓋蓋，并劇烈振搖以打碎粘性沉淀并渦旋混合至少1分鐘。試管在室溫孵化15分鐘。
(c)孵化后，每份樣品再渦旋混合1分鐘，然后于4℃以47,800g(SorvallRC5C離心機和SS34轉子以20,000r.p.m.)離心20分鐘。
(d)向10個Sterilin pots(70mL)中加入17mL的EDTA緩沖溶液。
(e)離心后，將每個試管的全部上清液轉移到EDTA緩沖溶液中(上述制備的)的分離的等分部分(17mL)。
(f)每個離心試管再用17mL的EDTA緩沖溶液漂洗，其被加入到適當的Sterilin pot中。這代表純化了的表面活性劑制劑。
(v)將純化了的表面活性劑制劑通過固相萃取(SPE)進一步純化。SPE按照如下進行(a)按照生產商的說明，將10個1mL 50mg Bakerbond SDB 1SPE柱安裝到SPE多支管中，并且每個管用2mL的氯仿然后是2mL的甲醇最后是2mL的30％乙腈洗滌。
(b)用上述列出的純化了的表面活性劑制劑負載每個柱子(大約0.5mL.min-1)。
(c)每個柱子用2mL的30％乙腈然后是1mL的異丙醇、含1％(v/v)三乙胺的己烷1mL以及最后是1mL的己烷洗滌。最后于真空下讓空氣穿過每個柱子至少30秒使SPE柱完全干燥。
(d)將玻璃螺帽2mL瓶裝到SPE多支管中用于洗出液的收集。
(e)每個柱子用2等分部分的1000mL的甲苯∶乙醇(1∶1)以大約0.5mL.min-1的速度洗脫。每個等分部分之后，通過將注滿空氣的10mL注射器推過該SPE柱來將該洗出液放到收集試管中。
(f)所有的洗出液在真空下于50℃用離心蒸發干燥，然后重懸于200μL的THF中。
(g)將每個樣品轉移到250μL的玻璃HPLC小瓶中并用波紋頂蓋密封。
(vi)HPLC裝置如圖3所示建立。將含有2L的四氫呋喃(THF)流動相存儲器放置在設定于25℃恒溫控制水浴中。吸濾器與HPLC泵進口管連接，流動相注入連到用于排氣的保護柱上(the mobile phase primed the line up tothe guard column placed to expel air)。自動進樣器與保護柱連接然后連到分析柱上。保護柱和分析柱被放到如Waters HPLC恒溫器控制模塊中設定的25℃恒溫控制箱中。在安裝完柱子之后讓溫度平衡1小時。分析柱的出口連接到折射率檢測器進口，折射率檢測器參考是指定的，出口連到廢液容器。泵的流速設定到1.0mL.min-1并且折光率檢測器設定到靈敏度256和時間常數10秒。檢測器箱設定到35℃。該HPLC系統控制器和積分儀根據制造商的說明來設定以收集和積分色譜數據。在分析之前，進行系統適應性試驗(見下面)。
(vii)下列操作用于HPLC分析折光率檢測器在使用之前清洗至少1小時并監測穩態基線；制備EDTA緩沖溶液并開始它的提取；制備所有其他測定緩沖液；開始受試液和標準液的提取；啟動HPLC系統并平衡；檢查HPLC的基線制備受試溶液；進行系統適應性試驗；當樣品通過SPE時，檢查HPLC系統以確保該系統適應性試驗是可接受的；當提取完成后并且系統適應性是可接受的時，進行樣品試驗。
(viii)聚山梨酯80的提取標準曲線是由將0.00、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50mg的聚山梨酯80溶于10mL的實驗室級水中制備而得。
(ix)用HPLC對聚山梨酯80按照如下進行純化(a)在進行完系統適應性試驗后立即將每個樣品50μL于上述說明的標準條件下注入到HPLC中。
(b)在所有樣品的色譜和聚山梨酯80峰的積分完成之后，建立聚山梨酯80峰高對標準濃度(mg.mL-1)的標準曲線以作為標準，通過線性回歸來計算標準曲線的斜率(m)和x-軸上的截距(cc)。這些回歸數據用于按照如下來計算受試樣品中聚山梨酯80的濃度最適合于標準曲線的線是受試的聚山梨酯80的峰高＝mx+c其中x＝聚山梨酯80濃度(μg.mL-1)因此聚山梨酯80濃度(μg.mL-1)＝(受試的聚山梨酯80峰高-c)/m然后計算該受試樣品中聚山梨酯80的平均濃度(μg.mL-1)。
3.結果提取標準曲線產生回歸線R2為0.999并且標準化峰高CV百分比為3.4％的線性標準曲線(圖4)。使用該標準曲線測得的聚山梨酯80的量與所述的配方量相比較，顯示出與白蛋白、NovoSevenTM和VepesidTM很接近(表3)。
表3
按照上述說明的對rHA最終產品中聚山梨酯80定量的方法顯示出它本身就適合于所有產品的定量而不需對該方法做修改。
系統適應性試驗操作1.將50μL系統適應性標準溶液注射到在標準條件下運行的HPLC上。
2.通過計算理論板數、拖尾和聚山梨酯80與十六酸的分離度(見下面)來對受試樣品進行評價。
3.如果這些參數中任意一個比期望值低，不管是聚山梨酯80的還是十六酸的，就用一套新柱子代替這些柱子。
受試樣品的評價1.采用方程1來計算聚山梨酯80(第一個洗脫峰)和十六酸(第二個洗脫峰)峰的理論塔板數，參照圖5。
期望值聚山梨酯80＞650理論塔板數十六酸＞6200理論塔板數2.采用方程2來計算聚山梨酯80和十六酸峰的峰拖尾，參照圖6。
期望值聚山梨酯 80＜3.5十六酸 ＜3.03.采用方程3來計算聚山梨酯80和十六酸的分離度，參照圖7。
期望值分離度＞2.0
權利要求
1.一種從液相表面活性劑制劑中去除蛋白組分的方法，其包括(a)提供一種含有蛋白組分的液相表面活性劑制劑；(b)向步驟(a)的制劑中加入絡合劑并且讓該絡合劑與該表面活性劑形成絡合物；(c)與步驟(b)同時或隨后，分別向步驟(a)的制劑或步驟(b)的產物中加入可混溶的沉淀劑，以形成液相反應混合物并且讓該可混溶的沉淀劑沉淀該液相反應混合物內的蛋白組分；和(d)從步驟(c)的產物中將所述絡合物與沉淀的蛋白組分相分離以提供純化的液相表面活性劑制劑；其中該絡合物保留在所述液相反應混合物之內的溶液中，并且步驟(d)將該絡合物保留在該液相中。
2.根據權利要求1的方法，其中所述表面活性劑含有一種或多種氧化烯基團。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述表面活性劑是非離子的，并且優選是烷基酚與環氧烷的縮合物；聚氧化烯失水山梨糖醇油酸酯；或聚氧化烯二醇。
4.根據權利要求2或3的方法，其中所述絡合劑包括多價金屬離子，優選過渡金屬離子。
5.根據任一項前述權利要求的方法，其中所述沉淀劑是水性有機可混溶溶劑，比如醇、氰基烷基、胺、酰胺、羧酸、醛、酮、二醇、醚、烷基鹵化物或芳香烴，例如丙酮、乙腈或乙醇。
6.根據任一項前述權利要求的方法，其中所述蛋白組分包括肽、多肽或蛋白。
7.根據權利要求6的方法，其中所述蛋白組分包括白蛋白、含有白蛋白的融合蛋白、單克隆抗體、依托泊苷或凝血因子。
8.根據任一項前述權利要求的方法，其中權利要求1的步驟(a)液相表面活性劑制劑中蛋白組分的蛋白濃度至少是50mg/ml。
9.根據任一項前述權利要求的方法，其中權利要求1的步驟(a)液相表面活性劑制劑中存在的表面活性劑相對于蛋白組分少于4800ppm。
10.根據任一項前述權利要求的方法，其中所述的提供純化了的液相表面活性劑制劑的步驟包括將反應混合物離心以使該沉淀的蛋白組分形成片狀沉淀并且絡合物保留在上清液中，以及使該上清液與片狀沉淀分離。
11.根據任一項前述權利要求的方法，其包括將絡合物非共價地結合到固相上的附加后續步驟，優選固相萃取(SPE)介質。
12.根據權利要求11的方法，其中在表面活性劑非共價地結合到固相上的步驟之前將絡合物解離。
13.根據權利要求12的方法，其中通過向該純化了的液相表面活性劑中加入鰲合劑來使絡合物解離。
14.根據權利要求11～13中任一項的方法，其中所述固相為疏水性SPE介質。
15.根據權利要求14的方法，其中所述SPE介質是聚苯乙烯二乙烯基苯或C2～24烷基介質。
16.根據權利要求11～15中任一項的方法，其中將結合到固相的表面活性劑進行洗滌以去除殘留蛋白組分。
17.根據權利要求16的方法，其中所述基質用水溶性有機溶劑洗滌，比如乙腈、異丙醇和/或三乙胺。
18.根據權利要求16的方法，其中所述固相用能夠沉淀表面活性劑的液體洗滌，如果表面活性劑存在于溶液中。
19.根據權利要求18的方法，其中所述固相用水不溶性有機溶劑洗滌，比如己烷、氯仿或甲苯。
20.根據權利要求11～19中任一項的方法，其中表面活性劑從固相上洗脫并且作為洗出液被收集。
21.根據任一項前述權利要求的方法，其包括測定純化了的液相表面活性劑制劑中的或來源于此的更進一步的部分中的表面活性劑含量的附加步驟。
22.根據權利要求21的方法，其中步驟(a)的液相表面活性劑制劑是較大制劑的等分部分或一批制劑中的一個樣品，并且該方法包括將如此測定的純化了的液相表面活性劑制劑中或來源于此的更進一步的部分中的表面活性劑含量與該較大制劑中或批中的其他樣品制劑中的表面活性劑含量進行相關的附加步驟。
23.根據權利要求22的方法，其包括對該較大制劑或批中的其他樣品制劑進行適當標識以反映如此測定的表面活性劑含量的附加步驟。
24.一種標識的液相表面活性劑制劑，其通過根據權利要求23的方法得到。
25.一種對含有表面活性劑的藥物制劑進行批質量控制的方法，其包括采用根據權利要求1～23任一項的方法測定該制劑樣品中表面活性劑的含量。
26.一種含有表面活性劑的藥物制劑，其采用根據權利要求25的方法進行質量控制。
全文摘要
本發明提供一種從液相表面活性劑制劑中去除蛋白組分的方法，其包括(a)提供一種含有蛋白組分的液相表面活性劑制劑；(b)向步驟(a)的制劑中加入絡合劑并且讓該絡合劑與該表面活性劑形成絡合物；(c)與步驟(b)同時或隨后，分別向步驟(a)的制劑或步驟(b)的產物中加入可混溶的沉淀劑，以形成液相反應混合物并且讓該可混溶的沉淀劑沉淀該液相反應混合物內的蛋白組分；和(d)從步驟(c)的產物中將所述絡合物與沉淀的蛋白組分相分離以提供純化了的液相表面活性劑制劑；其中該絡合物保留在所述液相反應混合物之內的溶液中，并且步驟(d)將該絡合物保留在該液相中。
文檔編號C07K1/00GK1816741SQ200480019339
公開日2006年8月9日 申請日期2004年5月7日 優先權日2003年5月7日
發明者菲利普·H·莫頓, 賈森·卡梅倫 申請人:達爾塔生物技術有限公司