pfHRP-2重組蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制品技術領域，特別是涉及一種PfHRP-2重組蛋白及其在瘧疾 pfHRP-2檢測試劑盒的陽性質控品中的應用。
【背景技術】
[0002] 瘧疾是一種由按蚊傳播的寄生蟲病，以發熱、寒戰、貧血為特征。瘧原蟲可分為四 種(惡性瘧、間日瘧、卵形瘧和三日瘧）。目前全球90多個國家報道了瘧疾病例，據估計全球 每年發現5億多臨床病例和270多萬瘧疾所致死亡病例，其中惡性瘧所致死亡病例最多。
[0003] 檢測瘧疾的方法主要分三種:病理學診斷、免疫學診斷和分子生物學診斷。其中病 理學診斷（顯微鏡鏡檢)是目前公認的金標準，缺點是需要訓練有素的檢驗技術員，敏感性 較低，不是所有的實驗室都能開展瘧原蟲鏡檢工作;分子生物學診斷靈敏度高于病理學診 斷，但其缺點是技術復雜，設備和環境要求高、費時，不能在現場應用。
[0004] 免疫學診斷通過檢測高特異性的靶抗原來實現，目前公認的瘧疾靶抗原主要有富 組氨酸蛋白_2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2，pfHRP2)、癥原蟲乳 酸脫氫酶(Plasmodium Lactate Dehydrogenase，pLDH)。依照標記和檢測系統的不同可分 為：間接焚光抗體法（Indirect Fluorescent Antibody Test IF-ΑΤ)、酶聯免疫吸附試驗 (Enzyme Linked Immunosorbentassay,ELISA)、免疫層析技術等。其中基于免疫層析技術 的膠體金試劑從取血、反應至結果判斷，只需10~15min，而且多個樣本可同時進行檢測，不 需特殊儀器，非常適合于瘧疾高發的邊遠山區基層醫院、衛生所防保醫生和村醫應用。
[0005] 體外診斷試劑校準品（物）、質控品（物)是實現體外診斷試劑臨床檢測及監督檢驗 結果準確一致的主要工具，也是保證量值傳遞的實物計量標準，如何確保檢測試劑的有效 性引起了Π )Α的關注，在2015年FDA公告中要求將質控品作為瘧疾HRP 2膠體金檢測試劑的 必備組分之一。但就目前而言，在市面上很難購買到膠體金產品的質控品。
[0006] 常規表達的pfHRP 2重組蛋白需在高堿性的緩沖情況下才可以充分溶解，而高堿 的環境并不適合蛋白的活性保持，特別是在蛋白濃度低的情況下，另外高堿性的緩沖環境， 并不適合膠體金檢測。
[0007] 瘧疾流行區主要位于熱帶和亞熱帶地區，例如非洲、東南亞等。這些區域氣候炎 熱，地理位置偏僻，經濟落后。美國CTK生物技術公司的質控品采用凍干保存的形式，干粉2 ~30°C可保存1年，重溶后2~8°C可保存1周，其要求存儲溫度低于30°C，重溶后需低溫保 存，不適合高溫環境，且重溶后穩定性差，只能保存一周時間。BinaxNOW公司的質控品采用 凍干保存的形式，干粉2~8°C保存，重溶后< _20°C保存，同樣不適合高溫環境。因此，開發 一種能夠適合高溫環境的瘧疾HRP-2膠體金檢測的質控品顯得尤為重要。

【發明內容】

[0008] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種pfHRP-2重組蛋白及其 在瘧疾pfHRP-2檢測的陽性質控品中的應用，該陽性質控品適合高溫環境，具有高穩定性， 用于檢定試劑卡的有效性。
[0009] 為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：
[0010] 一種pfHRP-2重組蛋白，其具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0011]本發明還提供了所述pfHRP-2重組蛋白在瘧疾pfHRP-2檢測中作為陽性質控品的 應用。
[0012] 本發明還提供了一種瘧疾pfHRP-2檢測的陽性質控品，其包含上述pfHRP-2重組蛋 白。
[0013]在其中一些實施例中，所述陽性質控品還包括凍干保護劑，所述凍干保護劑為含 有2~5wt % 明膠、5~IOwt %海藻糖、1~5wt %BSA、0 · 05~0 · 2wt %proClean300、0 · 2~ lwt% 吐溫20的0.01 ~0· IM PBS。
[0014]本發明還提供了一種瘧疾pfHRP-2檢測試劑盒，其包含上述陽性質控品。
[0015]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0016] 1、本發明的pfHRP-2重組蛋白是借助生物信息學軟件，通過序列分析在保證 pfHRP-2蛋白常見抗原表位完整的情況下，通過序列優化在改變蛋白的pi的同時，引入親水 序列進一步提高蛋白的親水性，最終制備得到的重組蛋白在中性以及弱堿性環境下的溶解 度提高，進而從分子層面上提高了蛋白的穩定性；
[0017] 2、本發明的瘧疾pfHRP-2檢測的陽性質控品含有高穩定性的pfHRP-2重組蛋白，陽 性質控品為凍干制劑，使用時，將質控品用試劑盒中配套樣本稀釋液復溶到原體積，即可使 用，可在2~40°C保存1年以上，滿足運輸及使用過程中對高溫環境的要求;復溶后，可在2~ 30°C保存1個月以上，以確保重復使用。
【附圖說明】
[0018]圖1為本發明實施例1中經改造拼接前后的PfHRP-2重組蛋白序列的親疏水性和抗 原性對比圖，其中圖IA-B為親疏水性對比，圖IC-D為抗原性對比；
[0019]圖2為本發明實施例1中經改造拼接前后的pfHRP-2重組蛋白序列的結構穩定性對 比圖；
[0020] 圖3為本發明試驗例1中的膠體金標準色板；
[0021] 圖4為本發明試驗例1中的特異性C水平的范圍。
【具體實施方式】
[0022] 為能進一步了解本發明的特征、技術手段以及所達到的具體目的、功能，解析本發 明的優點與精神，藉由以下實施例對本發明做進一步的闡述。
[0023]以下實施例中的步驟除了特殊說明外，均為本領域常規操作步驟，以下實施例中 所使用的原料，均來源于市售。
[0024] 實施例1 一種pfHRP-2重組蛋白
[0025] 該實施例的pfHRP-2重組蛋白，具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0026]該實施例的pfHRP-2重組蛋白的制備方法，包括如下具體步驟：
[0027] 1、針對瘧疾分布特點，選擇流行株序列為模板(WHO公布的亞洲、非洲區流行株； Genbank(U69551.1))進行序列改造和拼接；在第22個氨基酸位點和第45位點增加序列 HATDAHHAADAHHATDAHHAADA(該序列在抗原性能方面，涵蓋了多個高頻抗原特異性位點，親 水性能好），并修飾空間結構序列；
[0028]經改造拼接前后的序列的親疏水性和抗原性分別如圖IA-B和圖IC-D所示，從圖1 結果可以看出，插入基團提高了序列親水性，增強了蛋白溶解性;經改造拼接前后的結構穩 定性分別如圖2A和圖2B所示，從圖2結果可以看出，新序列空間結構形成的抗原性位點增 多，提高了特異性。
[0029] 2、經序列改造和拼接后，純化得到pfHRP-2重組蛋白，其具有如SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列。
[0030]實施例2 -種瘧疾PfHRP-2檢測的陽性質控品
[00311該實施例的瘧疾pfHRP-2檢測的陽