專利名稱：：銅氧還蛋白衍生的轉運制劑及其應用方法銅氧還蛋白衍生的轉運制劑及其應用方法相關申請本申請要求2004年10月7日提交的60/616,782號美國臨時專利申請、2005年5月13日提交的60/680,500號美國臨時專利申請、2005年7月19日提交的60/700,297號美國臨時專利申請的優先權。以上申請的全部內容全部并入本文做參考。政府權益聲明本申請的主題受國立衛生研究院(NIH，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Maryland,U.S.A.)的一項研究基金的支持(基金號ES04050-18)。政府對本發明擁有某些權利。
背景技術：
：蛋白質進入哺乳動物細胞常由所述蛋白質上的一個小片段介導，通常稱為"蛋白質轉導結構域(proteintransductiondomain)"或PTD。該片段可作為信號附著于外源蛋白質以幫助這種蛋白質轉運進入哺乳動物細胞。例如，兩性肽可用來促進人成纖維細胞HS68或鼠淋巴細胞性白血病細胞L1210對作為潛在抗腫瘤藥物的DNA切割金屬嚇啉(DNA-cleavingmetalloporphyrins)的攝取(Chaloin,L.etal.BioconjugateChem.12:691-700，(2001))。如penetratin、transportan、Tat(氨基酸47-57或48-60)以及模型兩性肽MAP等稱為細胞穿透肽(cell-penetratingpeptide)的肽已作為輸送載體用來轉運藥理學上重要的物質，如反義寡核苷酸、蛋白質和肽(Hallbrink,M.etal.Biochim.Biophys.Acta1515:101-109(2001);Lindgren，M.，etal.TrendsPharmacol.Sci.21:99-103(2000))。這種肽、尤其是果蠅轉錄因子Antennapedia的DNA結合同源結構域或21殘基肽載體Pep-l可在37'C或4。C被多種類型的培養細胞如人HS68細胞或鼠NIH-3T3成纖維細胞內在化。溫度變動沒有作用提示其穿透機制與經典的胞吞作用不同(Morris,M.C.etal.NatureBiotechnol.19:1173-1176(2001))，后者需要手性受體蛋白。用來將藥理學活性化合物轉運到哺乳動物細胞內的應用最廣泛的一種肽是人免疫缺陷病毒1型(HIV-I)反式激活蛋白Tat的11氨基酸富精氨酸蛋白質轉導結構域(PTD)(Schwarze，S.R.etal.Science285:1569-1572(1999),Schwarze，S.R.etal.TrendsCellBiol.10:290-295(2000))。小鼠腹腔注射120kDaf3-半乳糖苷酶/Tat融合蛋白可導致該融合蛋白跨細胞轉導進入幾乎所有組織，包括通過血-腦屏障。HIV-ITat的這一短肽結構域己示出可介導包括磁性納米粒子、噬菌體載體、脂質體及質粒DNA等大分子或顆粒的細胞內在化。與上述的其它細胞穿透肽不同，全長Tat或者其11氨基酸轉導結構域介導的貨物蛋白內在化在4。C被顯著抑制(Liu，Y.etal.Nat.Med.6:1380-1387(2000),Suzuki,T.etal.J.Biol.Chem.277:2437-2443(2002))，并且需要與受體例如細胞膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的硫酸乙酰肝素鏈相互作用。目前己經鑒別的大多數PTD都來自病毒和哺乳動物來源。其它來源的PTD對于設計不同實驗序列以及動物及人體的治療和預防程序是所需的。PTD的一個來源是細菌細胞。雖然已知細菌蛋白如霍亂毒素能進入哺乳動物細胞胞質溶質(Sofer，A,andFuterman，A.H.J.Biol.Chem.270:12117-12122(1995))，但此類蛋白的細胞毒性限制了應用細菌蛋白及其衍生的PTD將藥理學重要的貨物轉運進入哺乳動物細胞。發明簡述本發明的一個方面是一種肽，該肽與少于全長的野生型銅氧還蛋白(cupredoxin)或H.8外膜蛋白具有至少約90%的氨基酸序列相同性，并且其能促進相連的貨物分子進入哺乳動物癌細胞。在某些實施方案中，該肽與少于全長的天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白(msticyanin)、假天青蛋白、橙綠曲撓素(auracyanin)、天青蛋白樣蛋白或SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:43具有至少約90%的氨基酸序列相同性。在某些實施方案中，該肽來自,同纟錄假單胞菌(尸化wdo附o"osawwg/"c^fl)、層理席藻(尸/7or附/cZ/ww/a/M/"oyw附)、氧^f七亞鐵硫t干菌(T7n'oZn3c/〃z^々廠roox/(i(a7w)、裂環無色桿菌(爿c/zramo6actercyc/oc/osto1)、丁香假單胞菌(/^ew(io,nass>W"ga)、月囟月莫炎奈瑟氏球菌(A^zi化r/a附e"/"g/"'^y)、畐ll溶血弧菌(W6n'o;ara/7eamo(^/cw)、支氣管敗血性包特氏菌(Sorafefe〃aZ^owcto—ca)、百日咳桿菌(Bwcfe/e〃a戸f脇&)、橙色綠屈撓菌(C/z/orq/fecwsawraw"'acws)禾口淋病奈瑟氏球菌(7Ve^en'ago"o/r/zo^e)。在其它實施方案中，該肽長度為至少10個殘基且不超過50個殘基。在某些實施方案中，該肽包含與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46或SEQIDNO:47具有至少約90%的氨基酸序列相同性的序列。在其它實施方案中，該肽包含或由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:47組成。在某些實施方案中，該肽包含氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD和DGXXXXDXXYXKXXD,其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是賴氨酸，X是任意氨基酸。最后，在某些實施方案中，該肽與銅綠假單胞菌天青蛋白的50-77氨基酸區域具有顯著的結構同源性。本發明的另一方面是包含貨物化合物(cargocompound)和氨基酸序列的復合物，其中所述氨基酸序列與銅氧還蛋白或者其片段具有至少約90%的序列相同性，并且所述氨基酸序列或者其片段與所述貨物化合物相連，且所述氨基酸序列能促進所述貨物化合物進入哺乳動物癌細胞。在某些實施方案中，該復合物的氨基酸序列與少于全長的野生型銅氧還蛋白或H.8外膜蛋白具有至少約90%的氨基酸序列相同性。在其它實施方案中，所述貨物化合物為蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米粒子、毒素和藥物。在特定實施方案中，所述貨物是蛋白質或多肽，其與氨基酸序列相連形成融合蛋白。在其它特定實施方案中，所述貨物化合物是毒素，更具體地是銅綠假單胞菌外毒素A。在其它實施方案中，所述貨物是可檢測的物質，更具體的是一種可通過熒光測定法、顯微鏡檢術、X線CT、MRI或超聲進行檢測的物質。最后，本發明還涵蓋了在藥學上適當載體內的復合物。本發明的另一方面是將貨物化合物輸送進入細胞的方法。在一個實施方案中，該方法包括用上述復合物接觸一或多個細胞。在其它實施方案中，一或多個細胞來源于癌癥患者并被重新導入患者體內。在其它實施方案中，所述細胞是癌細胞，更具體的是骨肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。在其它實施方案中，給患者施用治療有效量的所述復合物。在其它實施方案中，所述復合物通過靜脈內、局部、皮下、肌內給藥或注入腫瘤內施用。在其它實施方案中，所述復合物與另一種癌癥治療同時施用。本發明的另一方面是診斷癌癥的方法。在某些實施方案中，給癌癥患者施用具有貨物的復合物，該貨物是一種可檢測的物質，并檢測所述貨物的定位。在特定實施方案中，所述貨物化合物是x線造影劑并通過X線CT檢測；所述貨物化合物是磁共振成像造影劑并通過MRI檢測及所述貨物是超聲造影劑并通過超聲檢測。在其它實施方案中，將一或多個細胞與具有可檢測物質的復合物接觸并檢測所述貨物的定位。本發明的另一方面是含有上述任意復合物的試劑盒。在某些實施方案中，該試劑盒進一步包含藥學上可接受的佐劑或賦形劑。在其它實施方案中，該試劑盒進一步包含用于施用試劑的載體。序列簡述SEQIDNO:1是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:2是層理席藻質體藍素的氨基酸序列。SEQIDNO:3是氧化亞鐵硫桿菌鐵硫菌藍蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:4是裂環無色桿菌假天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:5是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白36-128氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:6是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白36-89氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:7是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白36-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:8是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白36-50氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:9是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白50-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:10是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白50-66氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:11是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白67-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:12是pGST-azu36-128正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:13是pGST-azu36-128反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:14是pGST-azu36-50正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:15是pGST-azu36-50反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:16是pGST-azu36-77正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:17是pGST-azu36-77反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:18是pGST-azu36-89正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:19是pGST-azu36-89反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:20是pGST-azu50-77正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:21是pGST-azu67-77正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:22是pGST-azu50-77和pGST-azu67-77反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:23是pGST-azu50-66正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:24是pGST-azu50-66反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:25是綠色熒光蛋白基因正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:26是綠色熒光蛋白基因反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:27是gst-gfp-azu50-77正向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:28是gst-gfp-azu50-77反向引物的氨基酸序列。SEQIDNO:29是丁香假單胞菌天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:30是腦膜炎奈瑟氏球菌天青蛋白/H.8外膜蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:31是副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:32是支氣管敗血性包特氏菌天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:33是橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素A的氨基酸序列。SEQIDNO:34是橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的氨基酸序列。SEQIDNO:35是代表銅氧還蛋白入胞結構域(entrydomain)保守殘基的人工氨基酸序列，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是賴氨酸，X是任意氨基酸。SEQIDNO:36是淋病奈瑟氏球菌Laz蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:37是銅綠假單胞菌wt-天青蛋白50-67氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:38是橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的57-89氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:39是百日咳桿菌天青蛋白50-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:40是腦膜炎奈瑟氏球菌Laz蛋白106-132氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:41是銅綠假單胞菌天青蛋白53-70氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:42是銅綠假單胞菌天青蛋白53-64氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:43是百日咳桿菌天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:44是銅綠假單胞菌天青蛋白51-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:45是丁香假單胞菌天青蛋白51-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:46是副溶血弧菌天青蛋白52-78氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:47是支氣管敗血性包特氏菌天青蛋白51-77氨基酸片段的氨基酸序列。SEQIDNO:48是代表銅氧還蛋白入胞結構域保守殘基的人工氨基酸序列，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是賴氨酸，X是任意氨基酸。附圖簡述圖l(a)和(b).圖片顯示天青蛋白入胞(entry)與其細胞毒性相關。(a)進行MTT分析以確定wt-天青蛋白誘導的針對J774、UISOMel-2和成纖維細胞的細胞毒性。(b)M44KM64E突變體天青蛋白處理的人正常成纖維細胞中的細胞周期進展分析。以O(對照)、0.5或l.Omg/ml突變體天青蛋白孵育成纖維細胞24小時。在處理末期，以流式細胞術確定細胞中DNA含量。圖2(a)和(b).(a)不同截短型天青蛋白構建體及其純化步驟示意圖。不同azu基因片段框內融合在gst基因的3'端。(b)細胞生長與裂解后純化GST-azu融合蛋白，上樣SDS-PAGE并用考馬斯亮藍染色進行觀察。圖3(a)、(b)和(c).(a)圖顯示GST-GFP-azu50-77融合蛋白的構建。gfp基因被導入到gst基因的3'端(形成GST-GFP)，然后將azu50-77片段框內連接到gfp基因的3'端以產生GST-GFP-azu50-77融合蛋白。將GST-GFP-azu50-77作為單一融合蛋白從細胞裂解物中純化。對純化后的蛋白進行SDS-PAGE并以考馬斯亮藍染色進行檢測(9(b))，并且用抗天青蛋白抗體通過Western印跡檢測(9(c))。圖4(a)、(b)和(c).圖片顯示GST-綠色熒光蛋白(GFP)和GST-GFP-天青蛋白融合蛋白內在化的動力學研究。分析了用不同濃度的GST-GFP(10(a))或GST-GFP-azu50-77(10(b))在37。C處理1小時的J774細胞中的綠色熒光。用流式細胞術分析了10000個細胞。(c)GST-GFP-azu50-77內在化的時間依賴性。以200昭/mlGST-GFP-azu50-77在37。C按照標出的時間孵育J774細胞，并用流式細胞術進行分析。圖5(a)、(b)和(c).(a)圖片顯示外毒素A結構域III(氨基酸405-613)及結構域Ib的一部分(氨基酸381-404)與GST融合(GST-PEDIII)，如針對GST-GFP融合所述。然后使用PCR將azu50-77片段連接到GST-PEDIII的羧基末端(GST-PEDIII-azu50-77)。(b)以谷胱甘肽Sepharose4B凝膠過濾柱層析法純化融合蛋白并通過SDS-PAGE確定其大小。(c)圖片顯示通過PEDIII介導的細胞毒性確定的GST-PEDIII-azu50-77融合蛋白在UISO-Mel-2癌細胞和正常成纖維細胞(FBT)中的作用。如圖所示，以不同濃度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu50-77孵育UISO-Mel-2細胞和FBT細胞24小時，然后以MTT分析確定細胞存活。圖6.圖片顯示a-螺旋在wt-天青蛋白與wt-天青蛋白50-77蛋白轉導結構域中的位置。圖中還標出了天青蛋白50-77結構域中被脯氨酸殘基取代的3個氨基酸。圖7.圖片顯示GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合蛋白針對UISO-Mel-2癌細胞和FBT細胞的PEDIII介導的細胞毒性。以標出的不同濃度的GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu50-77孵育UISO-Mel-2和FBT細胞24小時，然后用MTT分析確定細胞存活。圖8(a)和(b).(a)圖片顯示用VAST算法計算得出的天青蛋白與其它銅氧還蛋白的結構比對。圖中省略了天青蛋白所不具有的橙綠曲撓素B和鐵硫菌藍蛋白的N端延長部分。灰色條表示天青蛋白上能夠與每個相鄰殘基重疊的區域。空白部分表示非比對區域。天青蛋白蛋白轉導結構域(PTD)，即氨基酸50-77，用豎直虛線標出，鐵硫菌藍蛋白中無此區域。銅氧還蛋白名稱后面括號內的數字為蛋白質數據庫登錄號。(b).包含某些已知細菌天青蛋白中間部分的殘基的多氨基酸序列比對。細菌種屬縮寫如下Psae，銅綠假單胞菌(SEQIDNO:44);Pssy，丁香假單胞菌(SEQIDNO:45);Neme，腦膜炎奈瑟氏球菌(SEQIDNO:40);Vipa，副溶血弧菌(SEQIDNO:46);Bobr，支氣管敗血性包特氏菌(SEQIDNO:47)。括號內為間隔氨基酸數。用CLUSTALX軟件(HigginsandSharp,Gene101:6427-6432(1988))進行多序列比對。圖9.圖9顯示腦膜炎奈瑟氏球菌Laz蛋白和銅綠假單胞菌天青蛋白。方框左側文字表示蛋白名稱。方框上方文字表示其正下方蛋白區域的名稱。方框下方數字表示蛋白連接區的氨基酸數。圖10.圖10顯示某些天青蛋白融合蛋白構建體。方框左側文字表示構建體名稱，并標出了質粒和蛋白產物。方框上方文字表示其正下方蛋白區域。"N.Sp"表示淋病奈瑟氏球菌信號肽；"H.8"表示淋病奈瑟氏球菌的H.8區；"N.Azu"表示淋病奈瑟氏球菌天青蛋白；"P.Sp"表示銅綠假單胞菌信號肽；"P.Azu"表示銅綠假單胞菌信號肽。實施方案詳述本發明涉及將貨物化合物輸送進入細胞的方法與材料。本發明的貨物化合物輸送是通過使用適當的轉運多肽實現的。在本發明的一個實施方案中，所述貨物化合物與轉運多肽相連接。適當的轉運肽包括銅氧還蛋白，或含有"銅氧還蛋白入胞結構域"的銅氧還蛋白片段。術語"銅氧還蛋白入胞結構域"是指銅氧還蛋白片段，其包括銅氧還蛋白進入哺乳動物癌細胞所必需的氨基酸序列。本發明輸送的貨物化合物包括但不限于蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸(包括反義核酸)、染料、熒光和放射性標簽、微粒或納米粒子、毒素、無機和有機分子、小分子及藥物。在某些實施方案中，藥物和毒素能殺傷腫瘤細胞。在本發明的一個實施方案中，銅氧還蛋白為天青蛋白，例如銅綠假單胞菌的wt-天青蛋白。"wt-天青蛋白"是指銅綠假單胞菌的野生型天青蛋白。與之相似，術語"wt-天青蛋白入胞結構域"是指wt-天青蛋白的片段，該片段包括wt-天青蛋白進入細胞所必需的氨基酸15序列。在本發明的其它實施方案中，銅氧還蛋白為質體藍素、鐵硫菌藍蛋白或假天青蛋白及其它。在具體實施方案中，天青蛋白來自銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、副溶血弧菌或支氣管敗血性包特氏菌及其它。在一個實施方案中，輸送貨物化合物以殺傷或阻礙細胞例如癌細胞的周期進展。此類癌細胞可以是例如骨肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞或乳腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞或前列腺癌細胞及其它。例如，貨物化合物可以是細胞周期控制蛋白，例如p53;細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，例如p16、p21或p27;自殺蛋白，例如胸苷激酶或硝基還原酶；細胞因子或其它免疫調節蛋白，例如白介素l、白介素2或粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子(GM-CSF);或者是毒素，例如銅綠假單胞菌外毒素A及其它。在其它實施方案中，輸送上述類別化合物之一的生物活性片段。在另一實施方案中，貨物化合物被輸送來產生靶組織影像。例如，靶組織可以是癌癥，貨物化合物可以是一種通常用于產生影像以供X線計算機斷層攝影(CT)、磁共振成像(MRI)及超聲檢測的化合物。在這些實施方案中，貨物化合物是發射Y射線或正電子的放射性同位素、磁共振成像造影劑、X線造影劑或超聲造影劑。銅氧還蛋白'"銅氧還蛋白"是一種具有電子傳遞特性的藍色含銅小蛋白(10-20kDa)，其參與例如細菌氧化還原鏈或光合作用。銅離子僅結合于蛋白質基質。銅離子周圍的兩個組氨酸和一個半胱氨酸配體形成的特殊扭曲三角平面排布賦予了金屬位點獨特的電子特性，并賦予了該蛋白明顯的藍色。已在中到高分辨率解析中結晶定性了一些銅氧還蛋白。銅氧還蛋白包括天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白、假天青蛋白、橙綠曲撓素以及天青蛋白樣蛋白。本文中使用的術語"銅氧還蛋白"既包括不含銅原子的蛋白形式，也包括含銅蛋白。天青蛋白天青蛋白屬于銅氧還蛋白家族，是128個氨基酸殘基的含銅蛋白，參與植物和某些細菌的電子傳遞。天青蛋白包括來自銅綠假單胞菌(SEQIDNO:l)("wt-天青蛋白")、木糖氧化產堿菌x少/awx/dara)和反硝化產堿菌(AdemYn:/cara)的那些。Murphy,L.M.etah,J.Mol.Biol.315:859-71(2002)。雖然天青蛋白之間的序列同源性在60-90%變動，但這些分子之間結構同源性很高。所有天青蛋白都具有一個特征性的具有希臘鑰匙基序的P-三明治結構，并且其唯一銅原子總是位于蛋白的相同區域。此外，天青蛋白在銅原子位點周圍還具有基本上中性的疏水片層(Murphyetal.)。質體藍素質體藍素是在真核植物和藍細菌中發現的銅氧還蛋白。每分子質體藍素含有一個銅分子，其氧化形式為藍色。質體藍素存在于葉綠體，發揮電子載體的作用。自1978年確定白楊質體藍素的結構以來，人們已通過結晶學或NMR方法確定了藻類(柵藻(sce^fe^m^)、拼苔(e她ramo—<3)、衣藻(c/z/awj^/omowos))禾口植物(菜豆)質體藍素的結構，并且將白楊質體藍素結構的分辨率精細到了1.33A分辨率。SEQIDNO:2顯示了藍細菌層理席藻的質體藍素的氨基酸序列。盡管藻類和維管植物質體藍素之間存在序列差異(例如衣藻和白楊蛋白之間的序列相同為62%)，但它們的三維結構是保守的(例如衣藻和白楊蛋白Qx位置的偏差僅為0.76A)。結構特征包括位于8鏈反向平行(3桶一端的扭曲四面體銅結合位點、明顯的負電荷片層以及平整的疏水表面。銅位點處于對其電子傳遞功能最為有利的位置，負電荷片層和疏水片層據認為參與了對生理反應配偶體(partner)的識別。化學修飾、交聯及定點誘變實驗已經證明了負電荷片層與疏水片層在與細胞色素f的結合相互作用中的重要性，并證實了質體藍素中兩條具有重要功能的電子傳遞通路模型。其中一條推測的電子傳遞通路相對較短(約4A)，包括了位于疏水片層中的暴露于溶劑的銅離子配體His-87,另一條通路較長(約12-15A)，包括了負電荷片層中的近似保守殘基Tyr-83。Redinboetal，J.Bioenerg.Biomembr.26(1):49-66(1994)。鐵硫菌藍蛋白鐵硫菌藍蛋白是一種來自硫桿菌屬(thiobacilhis)的藍色含銅單鏈多肽。氧化亞鐵硫桿菌的非常穩定和高度氧化的銅氧還蛋白鐵硫菌藍蛋白(SEQIDNO:3)的氧化形式的X線晶體結構已通過多波長異常衍射被測定并精細到了1.9A分辨率。鐵硫菌藍蛋白包括核心p-三明治折疊，該折疊由6-和7-鏈P-折疊組成。與其它銅氧還蛋白類似，銅離子與四個排布成扭曲四面體的保守殘基(His85,Cysl38,Hisl43,Metl48)配位。Walter,R丄.etal,J.Mol.Biol.263:730-51(1996)。橙綠曲撓素從嗜熱的綠色滑動光合細菌橙色綠屈撓菌中也分離出了三種藍色含銅小蛋白，分別稱為橙綠曲撓素A、橙綠曲撓素Bl和橙綠曲撓素B-2。兩種B形式蛋白具有幾乎相同的特性，而與A形式蛋白不同。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明表觀單體分子量為14(A)、18(B-2)和22(B-l)kDa。橙綠曲撓素A的氨基酸序列已被測定，顯示橙綠曲撓素A是139個殘基的多肽。(VanDreisscheetal，ProteinScience8:947-957(1999)。His58、Cysl23、Hisl28及Metl32之間的間隔使其被認為是進化上保守的金屬配體，如同在已知的含銅小蛋白質質體藍素和天青蛋白中一樣。二級結構預測也顯示橙綠曲撓素具有一個類似于銅綠假單胞菌天青蛋白和白楊葉中的質體藍素中的一般P-桶結構。但橙綠曲撓素似乎兼有這兩類含銅小蛋白序列的序列特征。與天青蛋白共有序列的總體相似性和與質體藍素共有序列的總體相似性大致相同，即30.5%。橙綠曲撓素的N端序列區域1-18明顯富含甘氨酸和羥基氨基酸。見橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素的A鏈的示范氨基酸序列SEQIDNO:33(NCBIProteinDataBank登錄號.AAM12874)。橙綠曲撓素B分子具有標準的銅氧還蛋白折疊。橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的晶體結構已得到研究(Bondetal,J.Mol.Biol.306:47-67(2001))。除額外的N端鏈以外，該分子與細菌銅氧還蛋白天青蛋白非常相似。如同在其它銅氧還蛋白中一樣，Cu配體之一位于多肽的第4鏈，另外三個配體位于第7鏈和第8鏈之間的大環上。參考后三個配體之間的氨基酸間隔可對Cu位點幾何學進行討論。晶體學鑒定的橙綠曲撓素B的Cu結合結構域可能通過N端尾巴束縛(tethered)在細胞質膜周質側，該N端尾巴與其它某些膜結合電子傳遞蛋白中已知的系鏈蛋白(tether)具有顯著的序列相同性。McManus等(JBiolChem.267:6531-6540(1992))給出了B形式的氨基酸序列。見橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的A鏈的示范氨基酸序列SEQIDNO:34(NCBIProteinDataBank登錄號.IQHQA)。假天青蛋白假天青蛋白是藍色含銅單鏈多肽家族。SEQIDNO:4顯示了裂環無色桿菌假天青蛋白的氨基酸序列。假天青蛋白的X線結構分析顯示其結構與天青蛋白相似，盡管這些蛋白之間的序列同源性低。假天青蛋白和天青蛋白總體結構間存在兩個主要區別。相對于天青蛋白，假天青蛋白具有由兩個a-螺旋組成的羧基末端延伸。天青蛋白在中間肽區域含有一個伸展的環，形成含有短a-螺旋的翼(flap),而該環在假天青蛋白中則是縮短的。在銅原子位點的僅有主要區別在于Met側鏈構象和Met-S與銅鍵長，假天青蛋白中鍵長明顯短于天青蛋白。銅氧還蛋白的細胞毒性活性銅氧還蛋白的電子傳遞(氧化還原)特性已經得到廣泛研究，但迄今為止尚不清楚其是否表現細胞毒性作用。本發明人令人驚訝的發現銅氧還蛋白以及含鐵(血紅素)氧化還原蛋白細胞色素c551能夠在J774小鼠巨噬細胞腫瘤細胞與人癌細胞中誘導凋亡或抑制細胞周期進展。銅氧還蛋白的氧化還原活性對于其細胞毒性活性不重要。例如，不含銅原子的銅氧還蛋白與含有銅原子的相比常表現出遠遠更低的氧化還原活性，但卻表現出顯著的細胞毒性活性。與其在癌細胞中的活性相比，在銅氧還蛋白處理的攜帶腫瘤的小鼠的正常組織中銅氧還蛋白在體內僅誘導低水平的凋亡。2002年1月15日提交的共有未決美國專利申請10/047,710及2003年11月24日提交的共有未決美國專利申請10/720,603中描述了銅氧還蛋白的細胞毒性活性。這些在先申請并入本文作參考。本發明人現示出銅氧還蛋白對癌細胞的選擇性作用與其進入這些細胞的能力相關。在實施例5中，發明人顯示銅氧還蛋白進入J774細胞。這些細胞是鼠網狀細胞肉瘤的腹水形式，具有巨噬細胞樣特征。在實施例18和19中，發明人顯示天青蛋白樣蛋白，奈瑟氏球菌(Neisseria)的H.8外膜蛋白，又稱為Laz，能夠特異性地進入腦腫瘤細胞。與之相反，銅氧還蛋白進入正常細胞的比例大大降低。在一個實施方案中，本發明涉及一種"復合物"，其含有與被輸送至細胞的"貨物化合物"相連接的銅氧還蛋白或者銅氧還蛋白的片段。所述貨物化合物可通過共價或非共價連接形成復合物。制備此類復合物的方法為本領域技術人員所熟知。例如，如果貨物化合物是蛋白質或多肽，該復合物可形成融合蛋白。或者，.貨物化合物可以直接或通過接頭分子例如二硫鍵或酯鍵共價連接于銅氧還蛋白或銅氧還蛋白片段。銅氧還蛋白入胞結構域(CupredoxinEntryDomain)本發明提供了一種蛋白轉導結構域，其可將相連的貨物轉運進入哺乳動物癌細胞但不能進入非癌細胞。已發現銅氧還蛋白包含蛋白轉導結構域，銅氧還蛋白入胞結構域，其可促進相連的貨物進入哺乳動物癌細胞。在某些實施方案中，可使用整個銅氧還蛋白以促進相連的貨物選擇性轉運進入癌細胞。在其它實施方案中，可使用銅氧還蛋白的一部分將相連的貨物轉運進入癌細胞。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白的區域組成，該區域長度小于全長野生型蛋白質。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白的超過約10個殘基、約15個殘基或者約20個殘基組成。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域由銅氧還蛋白的不超過約50個殘基、約40個殘基或者約30個殘基組成。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域與銅氧還蛋白具有至少約90%的氨基酸序列相同性、至少約95%的氨基酸序列相同性或者至少約99%的氨基酸序列相同性。本文使用的術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"可互換使用，用來表示氨基酸殘基的聚合物。"多肽"、"肽"或"蛋白質"可在細胞內合成并與其它蛋白質和細胞組分分離。或者，"多肽"、"肽"或"蛋白質"可按照本領域技術人員所熟知的方法人工合成。這些術語適用于氨基酸聚合物，其中一或多個氨基酸殘基為相應天然氨基酸的人工合成的化學類似物。這些術語還適用于天然氨基酸聚合物。術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"還包括修飾，所述修飾包括但不限于糖基化、脂質附著、硫酸化、谷氨酸殘基的Y-羧基化、羥基化及ADP核糖基化。應了解多肽并非總是完全的線性的。例如，多肽可由于泛素化而呈分枝狀，也可以是環狀(含有或不含分枝)，通常這是由于翻譯后事件的結果，包括天然加工事件以及非天然發生的人操縱事件。環狀、分枝狀和分枝環狀多肽可通過非翻譯天然過程與完全人工合成方法而合成。實施例描述了適用于本發明的鑒定銅綠假單胞菌Wt-天青蛋白片段的方法。這種方法還可用來鑒別其它銅氧還蛋白的片段。實施例l和實施例2描述了一系列在N端和C端截短的wt-天青蛋白的谷胱甘肽S-轉移酶("GST")融合體的構建。這些實施例還描述了融合蛋白產物的純化。實施例9顯示這種融合體在37"C時在J774細胞中內在化。當wt-天青蛋白被內在化時，GST仍保留在細胞外周而未被內在化。azu36-128(SEQIDNO:5)與azu36-89(SEQIDNO:6)也如azu36-77(SEQIDNO:7)—樣被內在化。其它截短體顯示azu50-77(SEQIDNO:9)可被內在化，而azu36-50(SEQIDNO:8)的內在化效率非常低。其它截短體azu50-77(SEQIDNO:9)至azu50-66(SEQIDNO:IO)以及azu67-77(SEQIDNO:ll)顯示很少的內在化，表明有效的內在化要求不十擾在第66-67位或]L:周l韋l的序列。就實際而言，數據支持使用氨基酸50-77用于有效的轉運。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域是wt-天青蛋白入胞結構域。在本發明某些實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸50-77(SEQIDNO:9)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸36-77(SEQIDNO:7)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸36-89(SEQIDNO:6)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸36-128(SEQIDNO:5)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸50-67(SEQIDNO:37)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸53-70(SEQIDNO:41)。在本發明另一實施方案中，wt-天青蛋白入胞結構域含有至少wt-天青蛋白的氨基酸53-64(SEQIDNO:42)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域是銅綠假單胞菌天青蛋白以外的銅氧還蛋白的入胞結構域。在不同的實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可以是藍細菌層理席藻的質體藍素(SEQIDNO:2)、氧化亞鐵硫桿菌鐵硫菌藍蛋白(SEQIDNO:3);裂環無色桿菌假天青蛋白(SEQIDNO:4)、丁香假單胞菌天青蛋白(SEQIDNO:29)、腦膜炎奈瑟氏球菌天青蛋白(SEQIDNO:30)、淋病奈瑟氏球菌天青蛋白(SEQIDNO:36)、副溶血弧菌天青蛋白(SEQIDNO:31)、支氣管敗血性包特氏菌天青蛋白(SEQIDNO:32)、百日咳桿菌天青蛋白(SEQIDNO:43)或橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素(SEQIDNO:33和34)的片段。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少橙色綠屈撓菌橙綠曲撓素B的氨基酸57-89(SEQIDNO:38)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少百日咳桿菌的氨基酸50-77(SEQIDNO:39)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少腦膜炎奈瑟氏球菌的氨基酸106-132(SEQIDNO:40)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少丁香假單胞菌天青蛋白的氨基酸51-77(SEQIDNO:45)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少腦膜炎奈瑟氏球菌Laz的氨基酸89-115(SEQIDNO:40)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少副溶血弧菌天青蛋白的氨基酸52-78(SEQIDNO:46)。在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域含有至少支氣管敗血性包特氏菌天青蛋白的氨基酸51-77(SEQIDNO:47)。23銅氧還蛋白入胞結構域的修飾在本發明另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域被化學修飾或遺傳改變以產生保留了轉運貨物化合物進入細胞的能力的變體。例如，實施例14顯示在54、61和70位導入脯氨酸殘基的wt-天青蛋白保留了進入UISO-Mel-2細胞的能力。在另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域包含保守的氨基酸序列DGXXXXXDXXYXKXXD(SEQIDNO:35)或DGXXXXDXXYXKXXD(SEQIDNO:48)，其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是賴氨酸，X是任意氨基酸。見實施例17。銅氧還蛋白入胞結構域的變體可通過標準技術合成。衍生物是直接形成自天然化合物或經修飾或部分取代形成的氨基酸序列。類似物是與天然化合物結構相似但不相同、在某些組分或側鏈有所不同的氨基酸序列。類似物可以是合成的，也可以來自不同的進化起源。如果衍生物或類似物含有修飾的氨基酸，則變體可以是全長的或不是全長的。銅氧還蛋白入胞結構域的變體包括但不限于包含某些區域的分子，所述區域與銅氧還蛋白入胞結構域基本上同源，在相同大小的氨基酸序列上或者通過同源性算法進行比對時與一比對序列進行比較時，具有至少約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%的相同性。銅氧還蛋白入胞結構域與候選序列之間的術語"氨基酸序列相同性百分比(％)"是指銅氧還蛋白入胞結構域與候選序列進行比對時，銅氧還蛋白入胞結構域中與候選序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為確定％氨基酸相同性，對序列進行比對，必要時引入缺口以達到最大的％序列相同性；保守取代不認為是序列相同性的一部分。確定百分比相同性的氨基酸序列比對程序為本領域技術人員所熟知。通常使用可公開獲取的計算機軟件例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件比對肽序列。進行氨基酸序列比對時，給定的氨基酸序列A與、和或對給定的氨基酸序列B的％氨基酸序列相同性(也可描述為給定的氨基酸序列A與、和或對給定的氨基酸序列B具有或包含一定的％氨基酸序列相同性)可計算為%氨基酸序列相同性=，.100其中X是通過序列A和序列B的序列比對程序或算法比對評定為相同匹配的氨基酸殘基數，及Y是指序列B的氨基酸殘基總數。如果氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不等，那么A對B的％氨基酸序列相同性不等于B對A的％氨基酸序列相同性。銅氧還蛋白入胞結構域中可導入可導致銅氧還蛋白入胞結構域氨基酸序列變化的改變，所述氨基酸序列變化使銅氧還蛋白入胞結構域喪失轉運貨物化合物進入細胞的能力。"非必需"氨基酸殘基是指銅氧還蛋白入胞結構域序列中可以被改變而不會使其喪失轉運貨物化合物進入細胞的能力的殘基，而"必需"氨基酸殘基則為這種活性所必需。可進行"保守"取代的氨基酸為本領域中所熟知。表l"優選取代"顯示了有用的保守取代。一個種類中的氨基酸被被相同種類的另一氨基酸取代的保守取代在本發明范圍以內，只要這種取代不喪失銅氧還蛋白入胞結構域的活性。導致銅氧還蛋白入胞結構域活性改變的這種交換只要仍然具有這種活性，則仍被視為本發明的一部分。表1優選取代原始殘基示例取代優選取代影響(l)多肽骨架的結構，例如P-折疊或a-螺旋構象、(2)電荷、(3)疏水性、或(4)靶位點側鏈大小的"非保守"取代可修飾銅氧還蛋白入胞結構域功能。如表2所示，根據共同的側鏈特性將殘基分組。非保守取代需要將這些種類之一中的一個成員交換為另一個種類的。一個種類的氨基酸被不同種類的另一氨基酸取代的非保守取代也在本發明范圍以內，只要所述取代不喪失銅氧還蛋白入胞結構域的活性。導致銅氧還蛋白結構域活性改變的這種交換仍被視為本發明的一部分，只要仍然具有這種活性。Val,Leu,lieLys，Gn，AsnGln，His,Lys,ArgGluSerAsnAspPro,AlaAsn，Gin,Lys,ArgLeu,Val，Met,Ala,Phe，NorleucineNorleucine,lie,Val，Met,Ala:PheArg，Gin,AsnLeu，Phe，lieLeu，Val,Ile，Ala,TyrAlaThrSerTyr，PheTrp,Phe，Thr，SerIle,Leu，Met,Phe,Ala，NorleucineLeu(L)Lys(K)Met(M)Phe(F)Pro"Ser(S)Thr(T)TrpCW)Tyr(Y)Val(V)LGGSAAAA_Lr-ATJTJ.ATSTPLARwpcG表2氨基酸種類<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在另一實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域變體具有與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77顯著的結構相似性。測定銅氧還蛋白和其它蛋白的顯著結構同源性的研究例子包括Toth等(DevelopmentalCell1:82-92(2001))。具體地，銅氧還蛋白入胞結構域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77之間的顯著結構同源性是通過VAST算法確定的(Gibratetal，CurrOpinStructBiol6:377-385(1996);Madejetal，Proteins23:356-3690(1995))。在具體實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77結構對比的VASTp值小于約10_3、小于約10—5或者小于約10—7。在其它實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域變體與銅綠假單胞菌天青蛋白殘基50-77之間的顯著結構同源性可通過DALI算法測定(Holm&Sander,JMol.Biol.233:123-138(1993))。在具體實施方案中，配對結構對比的DALIZ分值至少約3.5、至少約7.0或者至少約10.0。可使用本領域中已知的方法對銅氧還蛋白入胞結構域進行修飾，例如寡核苷酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描與PCR誘變。可對克隆的DNA進行定點誘變(Carter，BiochemJ.237:1-7(1986);ZollerandSmith,MethodsEnzymol.154:329-50(1987))、盒式誘變(cassettemutagenesis)、限制選擇誘變(Wellsetal，Gene34:315-23(1985))或其它已知技術以產生銅氧還蛋白入胞結構域變體核酸。此外，編碼與銅氧還蛋白入胞結構域具有結構相似性的入胞結構域的核苷酸可通過本領域中所熟知的方法合成。另外，野生型蛋白質分子或變體銅氧還蛋白入胞結構域可通過本領域中所熟知的方法合成。編碼銅氧還蛋白入胞結構域及與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域的復合物的核酸另一方面，本發明提供了編碼融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包含與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域，其中所述貨物化合物為蛋白質或肽。本發明的核酸分子可通過組合本領域中已知技術進行制備。例如，可通過化學合成或克隆分別制備編碼銅氧還蛋白入胞結構域和貨物化合物的核酸序列。然后用連接酶將核酸序列順序相連形成感興趣的核酸分子。使用銅氧還蛋白入胞結構域輸送貨物化合物的方法已知許多富精氨酸肽能轉位通過哺乳動物細胞膜并攜帶蛋白質貨物化合物進入此類細胞。Suzuki,T.,etalJ.Biol.Chem.277:2437-43(2002)。例如，HIVTat蛋白的富精氨酸的ll個氨基酸短片段(氨基酸47-51)能夠使貨物蛋白質轉運進入哺乳動物細胞。Schwarze，SR.,etal.TrendsCellBiol.10:290-95(2000)。已經示出增加a-螺旋含量并優化精氨酸殘基位置的合成入胞結構域增強了其作為蛋白轉導結構域的潛力。Ho,A.,etal.CancerRes.61:474-77(2001)。相比之下，wt-天青蛋白只有一個精氨酸殘基。因此在本發明中有理由相信但不能確保其進入模式與Tat蛋白的不同。本發明涵蓋了促進貨物化合物進入細胞的那些銅氧還蛋白片段的應用。可通過任一鑒別那些入胞所需片段的方法確定這些片段。在一種這種方法中，銅氧還蛋白片段與標記物質相連并進行測試以確定銅氧還蛋白片段是否進入細胞。這種方法可用于鑒定上述銅氧還蛋白的適當片段。在本發明的不同實施方案中，所述貨物化合物附著于銅氧還蛋白，例如銅綠假單胞菌的天青蛋白(SEQIDNO:l)("wt-天青蛋白")；藍細菌層理席藻的質體藍素(SEQIDNO:2);氧化亞鐵硫桿菌的鐵硫菌藍蛋白(SEQIDNO:3);或裂環無色桿菌的假天青蛋白(SEQIDNO:4)、丁香假單胞菌的天青蛋白(SEQIDNO:29)、腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白(SEQIDNO:30)、副溶血弧菌的天青蛋白(SEQIDNO:31)、支氣管敗血性包特氏菌的天青蛋白(SEQIDNO:32)、橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素A和B蛋白(SEQIDNO.33和34)或淋病奈瑟氏球菌(SEQIDN0.36)的橙綠曲撓素A和B蛋白，以及其它天青蛋白和天青蛋白樣蛋白。在其它實施方案中，所述貨物與銅氧還蛋白入胞結構域相連。在本發明的不同實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可在體外、離體(exvivo)或體內將貨物化合物輸送進入細胞。例如，可通過將銅氧還蛋白入胞結構域與貨物化合物的復合物加入細胞培養物中如巴氏涂片(papsmear)實現體外輸送。或者，將復合物加入取自患者的樣品如血液、組織或骨髓并將處理后的樣品返回患者體內實現離體輸送。還可通過將所述復合物直接施用給患者實現輸送。本發明的方法可用于治療、預防、診斷或研究目的。本發明所輸送的貨物化合物包括但不限于蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸(包括反義核酸)、染料、微粒和納米粒子、毒素、有機和無機分子、小分子及藥物。在一個實施方案中，可檢測的物質，例如熒光物質，如綠色熒光蛋白；發光物質；酶，如卩-半乳糖苷酶；或者是放射標記或生物素化的蛋白質被輸送進入細胞，從而賦予細胞可檢測的表型。與此相似，還可輸送用可檢測物質例如熒光物質標記的微粒或納米粒子。適當納米粒子的一個例子可見于2002年5月7日授權的美國專利6,383,500，其內容并入本文作參考。許多這種可檢測物質為本領域技術人員所已知。在某些實施方案中，所述貨物化合物是適合X線計算機斷層攝影術(CT)、磁共振成像(MRI)、超聲成像或放射性核素閃爍成像術的可檢測物質。在這些實施方案中，所述貨物化合物施用給患者用于診斷目的。造影劑可作為貨物化合物施用以增強通過X線CT、MR1和超聲獲得的圖像。通過銅氧還蛋白入胞結構域施用靶向腫瘤組織的放射性核素貨物化合物可用于放射性核素閃爍成像術。在某些實施方案中，銅氧還蛋白入胞結構域可含有具有貨物化合物或不具有貨物化合物的放射性核素。在其它實施方案中，所述貨物化合物是發出Y射線或正電子的放射性同位素、磁共振成像造影劑、X線造影劑或超聲造影劑。適用于貨物化合物的超聲造影劑包括但不限于生物相容性氣體微氣泡、液體載體以及表面活性劑微球，在靶部分與微氣泡之間可進一步包含任選的連接部分L。。在本文中，術語液體載體是指水溶液，術語表面活性劑是指可降低溶液界面張力的任何兩性物質。EP0727225A2揭示了適合于形成表面活性劑微球的表面活性劑列表，其內容并入本文參考。術語表面活性劑微球包括納米球、脂質體、囊泡等。生物相容性氣體可以是空氣或碳氟化合物，例如在超聲成像中產生回聲差別進而形成造影的C3-Cs全氟烷。所述氣體包囊或含在銅氧還蛋白入胞結構域任選通過連接基團附著其上的微球中。附著可以是共價的、離子的或者通過范德華力。此類造影劑的具體例子包括脂質包囊的全氟碳，其具有多種腫瘤新生血管受體結合肽、多肽或肽模擬物。適用作貨物化合物的X線造影劑包括但不限于一或多種原子序號20或以上的、可吸收X線的原子或"重"原子，在銅氧還蛋白入胞結構域和X線吸收原子之間可進一步包含任選的連接部分Ln。X線造影劑中經常使用的重原子是碘。最近揭示了包含金屬螯合物的X線造影劑(例如美國專利5,417，959)以及包含多個金屬離子的多螯合物(polychelate)的X線造影齊U(例如美國專利5,679,810)。更近一些時候還揭示了用作X線造影劑的多核簇狀復合物(multinuclearclustercomplex)(例如美國專利5,804,161、PCTWO91/14460及WO92/17215)。適用作貨物化合物的MRI造影劑包括但不限于一或多種順磁性金屬離子，在銅氧還蛋白入胞結構域和順磁性金屬離子之間可進一步包含任選的連接部分U。順磁性金屬離子以金屬復合物或金屬氧化微粒的形式存在。美國專利5,412,148和5,760,191描述了用于MRI造影劑中順磁性金屬離子螯合劑的例子。美國專利5,801,228、5,567,411及5,281,704描述了用于MRI造影劑的復合一個以上順磁性金屬離子的多螯合劑的例子。美國專利5,520,904描述了包含用于MRI造影劑的順磁性金屬離子的微粒組合物的例子。在另一實施方案中，貨物化合物被輸送來殺傷細胞或阻礙細胞周期進展，所述細胞例如是癌細胞。這種癌細胞可以是例如骨肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞或前列腺癌細胞。例如，所述貨物化合物可以是細胞周期控制蛋白，如p53;細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物，如pl6、p21或p27;自殺蛋白，如胸苷激酶或硝基還原酶；細胞因子或其它免疫調節蛋白，如白介素l、白介素2或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);或者是毒素，如銅綠假單胞菌外毒素A。在其它實施方案中，輸送上述種類化合物之一的生物學活性片段。在另一實施方案中，所述貨物化合物是編碼上述種類化合物之一的核酸。在另一實施方案中，所述貨物化合物是用于治療癌癥的藥物。這種藥物包括例如5-氟尿嘧啶；干擾素a;甲氨蝶呤；他莫昔芬(Tamoxifen);以及長春新堿。上述例子僅用于說明目的，許多其它此類化合物為本領域技術人員所熟知。適用于治療癌癥的貨物化合物包括但不限于垸化劑，如氮芥、垸基磺酸鹽、亞硝脲、氮丙啶及三氮烯(triazene);抗代謝物，例如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物及嘧啶類似物；抗生素，例如蒽環類、博來霉素、絲裂霉素、放線菌素D及普卡霉素(plicamydn);酶，例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉移酶抑制劑；5a-還原酶抑制劑；3型17卩-羥基類固醇脫氫酶抑制劑；激素類藥物，例如糖皮質激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黃體酮及促黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽(octreotideacetate);微管破壞劑，例如ecteinascidins或者其類似物與衍生物；微管穩定劑，例如紫杉烷類(taxane)，例如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉斷TaxotereTM)及其類似物，以及埃坡霉素(epothilone)例如埃坡霉素A-F及其類似物；植物衍生制品，例如長春花生物堿、表鬼臼毒素、紫杉垸類；及拓撲異構酶抑制劑；異戊二烯基轉移酶抑制劑；及混合制劑，例如羥基脲、普魯芐肼、米托坦(mitotan)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、鉑配位復合物，例如順鉑和卡鉑；以及其它用于抗癌和細胞毒性藥物的制劑，例如生物反應修飾劑、生長因子；免疫調節劑和單克隆抗體。本發明化合物也可以與放療和手術聯合使用。這些種類抗癌和細胞毒性藥物的代表性例子包括但不限于鹽酸氮芥、環磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、異環磷酰胺(ifosfamide)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈脲霉素、塞替派、達卡巴嗪、甲氨蝶吟、硫鳥嘌呤、巰嘌呤、氟達拉濱、pentastatin、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、硫酸博來霉素、絲裂霉素C、放線菌素D、番紅(safmcins)、沙加霉素(saframycins)、quinocarcins、discodermolides、長春花新堿、長春花堿、酒石酸脫水長春花堿、鬼臼亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌莫司汀、雌二醇氮芥磷酸鈉、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diyneses、左旋咪唑、aflacon、干擾素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔單抗(rituximab)、BCG、維甲酸、鹽酸依立替康、betamethosone、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺以及托泊替康(topoteca)及其任意類似物或衍生物。以上這些種類的優選成員包括但不限于紫杉醇、順鉑、卡鉑、多柔比星、洋紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基葉酸、絲裂霉素C、ecteinascidin743或pofiromycin、5-氟尿嘧咬、6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼臼脂素或者鬼臼脂素衍生物例如鬼臼亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷或替尼泊苷、美法侖、長春花堿、長春花新堿、白諾西丁、長春地辛及長春素。用作貨物化合物的抗癌和其它細胞毒性藥物的例子包括如下德國專利4138042.8;WO97/19086、WO98/22461、WO98/25929、WO98/38192、WO99/01124、WO99/02224、WO99/02514、WO99/03848、WO99/07692、WO99/27890、WO99/28324、WO99/43653、WO99/54330、WO99/54318、WO99/54319、WO99/65913、WO99/67252、WO99/67253和WO00/00485發現的埃坡霉素衍生物；WO99/24416發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(也見美國專利6,040,321);及WO97/30992和WO98/54966發現的異戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑；以及美國專利6,011,029—般和具體描述的藥物(此美國專利的所述化合物可與任意NHR調節劑(包括但不限于本發明中所述)例如AR調節劑、ER調節劑以及LHRH調節劑或者手術去勢聯用，特別是在治療癌癥中)。當上述其它治療藥物與本發明的化合物用作貨物化合物時，可按照例如Physician'sDeskReference(PDR)指出的量或本領域技術人員決定的量使用。含有銅氧還蛋白入胞結構域的藥物組合物含有與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域的復合物的藥物組合物可通過任何常規方法制備，例如常規混合、溶解、粒化、包被糖衣、乳化、包囊化、封入(entrapping)或凍干方法。所述復合物可以容易地組合本領域中熟知的藥學上可接受的載體。這種載體使制劑能夠以片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸液等形式配制。適當的賦形劑還包括例如充填劑和纖維素制劑。其它賦形劑包括例如調味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑以及其它可接受的添加劑、佐劑或粘合劑。這種組合物可用于例如細胞類型的檢測或成像或用于與細胞死亡有關的病癥的治療或預防。所述組合物以足以預防或治療與細胞死亡抗性有關的病癥的量施用。此處使用的術語"與細胞死亡抗性有關的病癥"指疾病、狀態或不適，其特征由適當的、熟練的醫師或臨床醫師判定的、與同種健康細胞相比至少表現出了細胞壽命延長的趨勢。宿主生物體典型的是哺乳動物，如人或動物。含有銅氧還蛋白入胞結構域的組合物的施用含有銅氧還蛋白入胞結構域的組合物可通過任意適當的途徑例如口服、口腔、吸入、舌下、直腸、陰道、經尿道、鼻腔、局部、經皮(即透皮)或胃腸外(包括靜脈內、肌內、皮下及冠狀動脈內施用)施用。組合物及其藥物制劑可以有效達到其目的的任意量施用。當施用用于治療與細胞死亡抗性有關的病癥時，所述組合物應以治療有效量施用。"治療有效量"是指能夠有效預防被治療患者的現有癥狀的發展或緩解現有癥狀的量。治療有效量的確定在本領域技術人員的能力范圍內。在不同的實施方案中，所述組合物包括載體和賦形劑(包括但不限于緩沖液、碳水化合物、甘露醇、蛋白質、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑)、水、油脂、鹽水、葡萄糖水溶液和甘油溶液，其它藥學上可接受的模擬生理條件所需的輔助物質，例如緩沖劑、張力調節劑、濕潤劑等等。應認識到雖然本領域技術人員熟知的任何適當載體都可用于施用本發明的組合物，但載體類型隨施用方式的不同而有所變化。還可通過熟知的技術將化合物包囊在脂質體內。生物降解微球也可用作本發明組合物的載體，例如美國專利4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5，820，883、5,853,763、5,814,344和5,942,252所示。本文使用的"化合物"包括本發明的肽、氨基酸序列、貨物化合物和復合物。本發明組合物在血流中的半衰期可通過本領域技術人員熟知的某些方法進行延長或優化，所述方法包括但不限于環化肽(Monketal，BioDrugs19(4):261-78，(2005);DeFreestetal，J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))、D,L-肽(非對映異構體)(Futakietal,J.Biol.Chem.Feb23;276(8):5836-40(2001);Papoetal，CancerRes.64(16):5779-86(2004);Milleretal,Biochem.Pharmacol.36(l):169-76，(1987));含有非常見氨基酸的肽(Leeetal,J,Pept.Res.63(2):69-84(2004));以及N端和C端修飾(Labrieetal，Clin.InvestMed.13(5):275-8，(1990))。令人特別感興趣的是d-異構化(取代)以及通過D-取代或L-氨基酸取代進行的肽穩定性修飾。本發明組合物可通過常規的、熟知的滅菌技術進行滅菌或進行無菌過濾。得到的水溶液可包裝備用或凍干，施用前將凍干制品與無菌溶液組合。本發明組合物可通過多種方式施用，包括注射(例如皮內、皮下、肌內、腹膜內等)、吸入、局部施用、栓劑、透皮貼劑或口服。通過注射施用時，組合物可配制成水溶液，優選在生理相容性緩沖液中，例如Hanks溶液、Ringer's溶液或生理鹽水緩沖液。溶液可含有配制劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，組合物還可以是粉末形式，在使用前與適當載體例如滅菌無熱原水混合。吸入施用時，組合物可通過使用適當的噴射劑例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氧化碳或其它適當氣體從加壓包裝或霧化器中以氣溶膠噴霧的形式輸送。使用加壓氣溶膠時，劑量單位可通過提供閥門以輸送一定劑量來確定。膠囊和藥筒(例如用于吸入器和吹入器的明膠)可制成含有蛋白與如乳糖或淀粉等適當粉末基質的粉末混合物。局部施用時，組合物可制成溶液、凝膠、軟膏、乳膏、懸浮液等本領域所熟知的形式。在某些實施方案中，通過透皮貼劑的方式施用。通過栓劑施用時(例如直腸或陰道)，組合物還可制成含有常規栓劑基質的組合物。口服施用時，組合物可以容易地與本領域熟知的藥學上可接受的載體組合配制。可使用固體載體，如甘露醇、乳糖、硬脂酸鎂等；此類載體使得趨化物被制成片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑(slurry)、懸浮液等用于被治療者D服。對于口服固體制劑，例如粉末、膠囊和片劑，適當的賦形劑包括充填劑如糖、纖維素制品、粒化劑及粘合劑。本領域中熟知的其它便捷載體還包括多價載體，例如細菌莢膜多糖、葡聚糖或遺傳工程化的載體。另外，包括所述組合物的緩釋制劑允許組合物釋放延長的時間，如沒有緩釋制劑，組合物將在引發或加強療效前就被患者系統清除和/或降解(例如被蛋白酶)或簡單地水解。精確的制劑、施用途徑和劑量由主治醫師根據患者情況確定。劑量和間隔時間可根據個體情況進行調節以使所述復合物的血漿水平足以維持療效。一般來說，所需的組合物是與藥物載體以混合物施用的，所述藥物載體根據預期施用途徑和標準制藥規范選擇。適宜的劑量當然根據例如所用的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物、宿主、施用方式以及被治療或診斷的病癥的性質和嚴重性而有所不同。但在本發明方法的一個實施方案中，在每日劑量為約0.001到約20mg/kg體重的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物時獲得了令人滿意的人體療效。在一個實施方案中，用于治療人體的指明的每日劑量的范圍為從約0.7mg到約1400mg的含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物，其可方便地施用，例如以每日劑量、每周劑量、每月劑量和/或連續給藥。每日劑量每天可以是1到12次的不連續劑量。或者，所述劑量可以每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周及類似遞增至每31天施用。可使用任意適當的給藥形式包括片劑、敷貼、iv施用等等進行連續、間歇或單次給藥。更具體地，組合物以治療有效量施用。在具體實施方案中，治療有效量為約0.01-20mg/kg體重。在具體實施方案中，劑量水平為約10mg/kg/日、約15mg/kg/日、約20mg/kg/日、約25mg/kg/日、約30mg/kg/曰、約35mg/kg/日、約40mg/kg/日、約45mg/kg/日或者約50mg/kg/日。在某些實施方案中，將含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物導入患者的方法與其它治療癌癥的已知藥物共同施用。這種方法為本領域所熟知。在具體實施方案中，含有銅氧還蛋白入胞結構域的化合物為混合劑的一部分，或與含有或具有其它治療癌癥的藥物共同給藥。這種藥物包括例如本文所列出的藥物，具體為5-氟尿嘧啶、干擾素a、甲氨蝶呤、他莫昔芬及長春新堿。上述例子僅用于說明，還有許多其它此類化合物為本領域技術人員所知。適用于治療癌癥的其它藥物包括但不限于烷化劑，例如氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝脲、氮丙啶及三氮烯；抗代謝物，例如葉酸拮抗劑、嘌呤類似物及嘧啶類似物；抗生素，例如蒽環類抗生素、博來霉素、絲裂霉素、放線菌素D及普卡霉素；酶，例如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白轉移酶抑制劑；5a-還原酶抑制劑；3型'17|3-羥基類固醇脫氫37酶抑制劑；激素類藥物，例如糖皮質激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、黃體酮及促黃體生成素釋放激素拮抗劑、醋酸奧曲肽；微管破壞劑，例如ectdnascidins或者其類似物與衍生物；微管穩定劑，例如紫杉烷類，例如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇(TaxotereTM)及其類似物，埃坡霉素，例如埃坡霉素A-F及其類似物；植物衍生產品，例如長春花生物堿、表鬼臼毒素、紫杉垸類；拓撲異構酶抑制劑；異戊二烯基轉移酶抑制劑；混合制劑，例如羥基脲、丙卡巴肼、米托坦、六甲蜜胺、鉑配位復合物，例如順鉑和卡鉑；以及其它用于抗癌和細胞毒性藥物的制劑，例如生物反應修飾劑、生長因子；免疫調節劑和單克隆抗體。這些種類的抗癌和細胞毒性藥物的代表性例子包括但不限于鹽酸氮芥、環磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、異環磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、鏈脲霉素、塞替派、達卡巴嗪、甲氨蝶呤、硫鳥嘌呤、巰嘌吟、氟達拉濱、pentastatin、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、鹽酸阿霉素、柔紅霉素、伊達比星、硫酸博來霉素、絲裂霉素c、放線菌素D、番紅、沙加霉素、quinocarcins、discodermolides、長春花新堿、長春花堿、酒石酸脫水長春花堿、鬼臼亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷、替尼泊苷、紫杉醇、他莫昔芬、雌莫司汀、雌二醇氮芥磷酸鈉、氟他胺、布舍瑞林、亮丙瑞林、蝶啶、diyneses、左旋咪唑、aflacon、干擾素、白介素、阿地白介素、非格司亭、沙格司亭、利妥昔單抗、BCG、維甲酸、鹽酸依立替康、betamethosone、鹽酸吉西他濱、六甲蜜胺以及托泊替康及其任意類似物或衍生物。以上類別的優選成員包括但不限于紫杉醇、順鉑、卡鉑、多柔比星、洋紅霉素、柔紅霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基葉酸、絲裂霉素C、ecteinascidin743或pofiromycin、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼臼脂素或者鬼臼脂素衍生物例如鬼臼亞乙苷、磷酸鬼臼亞乙苷或替尼泊苷、美法侖、長春花堿、長春花新堿、白諾西丁、長春地辛及長春素。用于與本發明組合物共同施用的抗癌和其它細胞毒性藥物的例子包括如下德國專利4138042.8發現的埃坡霉素；WO97/1卯86、WO98/22461、WO98/25929、WO98/38192、WO99/01124、WO99/02224、WO99/02514、WO99/03848、WO99/07692、WO99/278卯、WO99/28324、WO99/43653、WO99/54330、WO99/54318、WO99/54319、WO99/65913、WO99/67252、WO99/67253及WO00/00485;WO99/24416發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(也見美國專利6,040,321);WO97/30992和WO98/54966發現的異戊二烯基轉移酶抑制劑；以及美國專利6,011,029中一般和具體描述的藥物(此美國專利所述化合物可與任意NHR調節劑(包括但不限于本發明中所述)例如AR調節劑、ER調節劑以及LHRH調節劑或者手術治療聯用，特別是在治療癌癥中)。可使用一或多種生理學上可接受的載體，以傳統方式將本發明所用的藥物組合物制成可用于治療的制品，所述載體包含便于組合物加工的賦形劑與輔助成分、抑制或刺激組合物分泌的活性劑或其混合物。編碼銅氧還蛋白入胞結構域或組合入胞結構域與貨物化合物的融合蛋白的核酸分子可插入載體，用作基因治療載體。基因治療載體可通過例如靜脈內注射、局部施用(Nabeletal,U.S.PatentNo.5,328,4701994.USA)或定向注射(stereotacticinjection)(Chenetal.，ProcNatlAcadSciUSAvol.91,pp3054-57(1994))輸送給患者。基因治療載體的藥物制品可包括可接受的稀釋劑或可包含基因輸送載體嵌入其中的緩釋基質。或者，當完整的基因輸送載體例如逆轉錄病毒載體可由重組細胞完整產生時，藥物制品可包括一或多種產生基因輸送系統的細胞。在一個方面，組合物以DNA被輸送，因此復合物是在原位產生的。在一個實施方案中，DNA是"裸露的"，如UImeretal.,Science259:1745-49(1993)禾口Cohen,Science2591691-92(1993)中所述。將DNA包被在載體上(例如可被有效轉運入細胞的生物降解珠)可提高裸露DNA的攝取。在此類方法中，DNA可存在于本領域技術人員熟知的多種輸送系統中的任意一種，所述系統包括核酸表達系統、細菌與病毒表達系統。將DNA整合入這些表達系統的技術為本領域技術人員所熟知。見例如WO90A1092、WO93/24640、WO93/17706及美國專利5,736,524。用于在從生物體到生物體穿梭遺傳物質的載體可分為兩大類克隆載體是復制質粒或噬菌體，并具有在適當宿主細胞中繁殖所非必需的且外源DNA插入其中的區域；外源DNA像載體成分一樣可復制與傳代。表達載體(如質粒、酵母或動物病毒基因組)用來將外源遺傳物質導入宿主細胞或組織，從而轉錄和翻譯外源DNA，例如組合物的DNA。在表達載體中，導入的DNA被可操縱地連接于可向宿主細胞發出信號以轉錄插入DNA的元件例如啟動子。某些啟動子尤其有用，例如控制應答特殊因素的基因轉錄的誘導型啟動子。將組合物多核苷酸可操縱地連接于誘導型啟動子可控制wt-天青蛋白入胞結構域組合物多肽或者片段的表達。典型誘導型啟動子的例子包括對a-干擾素、熱休克、重金屬離子和類固醇例如糖皮質激素(Kaufman，MethodsEnzymol.185:487-511(1990))及四環素應答的啟動子。其它所需的誘導型啟動子包括對于構建體所導入的細胞是內源性的啟動子，在外源提供誘導劑時它們在細胞中是應答的。一般來說，有用的表達載體常為質粒。但其它形式的表達載體例如病毒載體(如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒與腺相關病毒)也可考慮。載體的選擇取決于使用的生物體或細胞，以及載體的所需命運。一般來說，載體包含信號序列、復制起點、標記基因、增強子元件、啟動子以及轉錄終止序列。包含銅氧還蛋白入胞結構域-貨物化合物復合物的試劑盒本發明的另一方面提供了試劑盒，其在包裝或容器內含有一種或多種下列材料(1)包含與貨物化合物相連的銅氧還蛋白入胞結構域的復合物的試劑；(2)含有藥學上可接受的佐劑或賦形劑的試劑；(3)施用器材，例如注射器；(4)施用說明書。在某些實施方案中，在同一容器內也可含有兩份或更多的成分(1)-(4)。提供試劑盒時，組合物的不同成分可包裝在單獨的容器內并在使用前迅速混合。這樣單獨包裝組分有助于長期儲存而不會損失活性成分的功能。試劑盒中的試劑可在任何形式的容器中提供，使不同成分的壽命得以保存且不會被容器材料吸收或改變。例如，密封玻璃安瓿可含有凍干的多肽或多核苷酸，或在如氮氣等中性非反應氣體條件下包裝的緩沖液。安瓿可由任何適當的材料制成，例如玻璃、有機聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或典型用于盛放類似試劑的其它任何材料。適當容器的其它例子包括采用安瓿類似物質制造的普通瓶、包含箔線內襯例如鋁或合金的封袋。其它容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等等。容器可有無菌出口，例如瓶上帶有可被皮下注射針穿過的塞子。其它容器可具有被易移去的膜分為的兩個隔室，膜移去后可使其中的成分混合。可移去的膜可由玻璃、塑料、橡膠等制成。試劑盒中還可提供了說明材料。說明書可印在紙上或其它介質上，禾B/或以電子可讀介質的形式提供，例如軟盤、CD-ROM、DVD-ROM、Zip磁盤、錄像帶、錄音帶、閃存設備等。試劑盒也可能不附帶詳細說明書，而是指導用戶從試劑盒制造商或經銷商指定的網絡站點獲取，或以電子郵件提供。參考以下具體實施例可對本發明有更全面的了解。實施例僅用于說明目的，而非限制本發明的范圍。根據實際情況可考慮形式上的改變或等價替換。雖然本文使用了具體術語，但這些術語是出于描述的需要，而不是為了限定目的。在不偏離本發明精神和范圍的前提下，可對上文所述的本發明進行修改與變更，因此如附加實施方案所示，對本發明只有這樣的限制。實施例實施例1-質粒構建使用校正DNA聚合酶，通過聚合酶鏈反應構建表達谷胱甘肽S-轉移酶(GST)-截短型wt-天青蛋白(azu)衍生物融合蛋白的質粒。圖6顯示不同截短型wt-天青蛋白構建體的示意圖。對于pGST-azu36-128，將擴增的PCR片段導入商品化GST表達載體pGEXSX(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ08855)的BamHl和EcoRl位點。片段擴增以pUC19-azu作為模板，5'-CGGGATCCCCGGCAACCTGCCGAAGAACGTCATGGGC-3'(SEQIDNO:12)及5'-CGGAATTCGCATCACTTCAGGGTCAGGG-3'(SEQIDNO:13)作為引物，其中另外引入的^W7//7和五co//位點分別用下劃線標出。通過QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA92037)引入終止密碼子可逐步進行^M基因的羧基末端截短。對于pGST隱azu36-50、pGST-azu36-77和pGST-azu36-89，分別在Ser51、Ser78和Gly卯引入終止密碼子。以攜帶pGST-azu36-128的質粒作為模板DNA。用于定點誘變的三組寡核苷酸顯示如下。pGST-azu36-50:5'陽GGCCACAACTGGGTACTGTGAACCGCCGCCGACATGCAG-3'(SEQIDNO:14)和5'-CTGCATGTCGGCGGCGGTTCACAGTACCCAGTTGTGGCC-3'(SEQIDNO:15)。pGST-azu36-77:5'-CCTGAAGCCCGACGACTGACGTGTCATCGCCCACACC-3'(SEQIDNO:16)和5'誦GGTGTGGGCGATGACACGTCAGTCGTCGGGCTTCAGG-3'(SEQIDNO:17)。pGST-azu36-89:5'-CCAAGCTGATCGGCTCGTGAGAGAAGGACTCGGTGACC-3'(SEQIDNO:18)和5'-GGTCACCGAGTCCTTCTCTCACGAGCCGATCAGCTTGG-3(SEQIDNO:19)。以pGST-azu36-77作為模板DNA，通過PCR制備質粒pGST-azu50-77和pGST-azu67-77。使用正向引物5'-CGGGATCCTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGG畫3'(SEQIDNO:20)和5'-CGGGATCCCCGGCCTGGACAAGGATTACCTGAAGCCCG-3(SEQIDNO:21)獲取PCR擴增片段azu50-77和azu67-77，其中另外引入的BamHI位點用下劃線標出。這兩種情況中使用的反向引物均為5'-CGGAATTCGCATCACTTCAGGGTCAGGG-3'(SEQIDNO:22)。使用下列寡核苷酸將攜帶gst-azu50-77的質粒用于Gly67引入終止密碼子來產生pGST-azu50-66:5'-GACGGCATGGCTTCCTGACTGGACAAGGATTACC隱3'(SEQIDNO:23)和5'-GGTAATCCTTGTCCAGTCAGGAAGCCATGCCGTC隱3'(SEQIDNO:24)。編碼綠色熒光蛋白的綠色熒光蛋白基因(gfi))同樣通過PCR擴增。所使用的正向和反向引物是5'-CGGGATCCCCATGGTGAGCAAGGGCG-3'(SEQIDNO:25)和5'-CGGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'(SEQIDNO:26)，在每個寡核苷酸的5'端均含有BamHI和EcoRI位點。將得到的PCR片段與pGEXSX載體連接，產生pGST-GFP。以pGST-azu50-77作為模板，5'-CCGCTCGAGCCTGAGCACCGCCGCCATGCAGGG-3'(SEQIDNO:27)和5'-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCAGTCGTCGGGCTTCAGGTAATCC-3'(SEQIDNO:28)作為引物，通過PCR擴增azu50-77基因以制備攜帶gst-gfp-azu50-77的質粒DNA，其中引入的^7wI禾BMfI位點分別用下劃線標出。將純化的azu50-77片段導入pGST-GFP的Xho1和Not1獨特限制性酶切位點。43實施例2-蛋白純化如Yamada，T.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.101，pp.4770-75(2004)和共有未決美國專利申請10〃20，603所述制備和純化wt-天青蛋白和M44KM64E天青蛋白突變體，所述文獻內容并入本文參考。簡言之，按照Kukimotoetal,FEBSLett,vol.394,pp87-90(1996)所述方法通過PCR擴增wt-天青蛋白基因。以銅綠假單胞菌株PAOl的基因組DNA作為模板DNA進行PCR。545bp的DNA擴增片段經Hindlll和Pstl消化后插入pUC19的相應位點，使天青蛋白基因位于lac啟動子下游以產生表達質粒pUC19-azuA。E.colJM109用作天青蛋白基因表達的宿主菌株。重組大腸桿菌菌株在含有50ng/ml氨芐青霉素、O.lmMIPTG以及0.5mMCuS04的2YT培養基中37"C培養16小時，以產生天青蛋白。制備M44KM64E天青蛋白突變體時，用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla,CA)進行天青蛋白基因的定點誘變。通過DNA測序驗證突變。質粒DNApET9a來自KazuhikoSasaki博士(CentralResearchInstituteofElectricPowerIndustry,Chiba，Japan),其攜帶編碼氧化亞鐵硫桿菌銅氧還蛋白鐵硫菌藍蛋白的基因。采用經修改的Sasaki,K.，etal.Biosci.Biotechnol.Biochem.,vol.67，pp.1039-47(2003)所述方法從攜帶基因的大腸桿菌BL21(DE3)中分離鐵硫菌藍蛋白。簡言之，使用乙酸緩沖液(pH4.0)和CM-Sepharose(SigmaChemicals,St.Louis,MO63178)代替P-丙氨酸緩沖液(pH4.0)禾QTSK誦gelCM-650柱(TosohBioscience,LLC，Montgomeryville,PA18936)。其它兩種純化的銅氧還蛋白-層理席藻質體藍素和裂環無色桿菌假天青蛋白分別來自BeatrixG.Schlarb-Ridley博士(UniversityofCambridge,UK)禾口ChristopherDennison博士(UniversityofNewcastleUponTyne，UK)。如下純化所有重組GST-融合衍生物大腸桿菌BL21作為宿主菌株。以0.4mMIPTG誘導L肉湯中處于對數生長期早期的細菌后，用PBS通過谷胱甘肽Sepharose4B親和層析法和Sephadex75凝膠過濾柱(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ08855)從細胞提取物中純化GST-融合蛋白。按照制造商說明分離以ALEXAFLUOR(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR97402)標記的純化蛋白，wt天青蛋白和GST-衍生物或其它銅氧還蛋白。通過凝膠過濾柱除去未結合的游離熒光化學物。實施例3-細胞培養如Yamada,T.etal.Infect.Immun.vol.70,pp.7054-62(2002);Goto,M.,etalMol.Microbiol,vol,47，pp.549-59(2003)禾口Yamada,T"etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USAvol.99，pp.14098-103(2002)所述培養J774禾BUISO-Mel陽2細胞(購自FrederickCancerResearchandDevelopmentCenter,Frederick,Maryland,USA)，其內容并入本文參考。人正常成纖維細胞(DepartmentofSurgicalOncology,UniversityofIllinois(UIC)，Chicago的原種培養物)在具有含2mML-谷氨酰胺、O.lmMMEM必需氨基酸并添加10%熱滅活胎牛血清、100單位/ml青霉素和100昭/ml鏈霉素的Eagle's鹽的MEM中培養。如Punjetal.Oncogene23:2367-78(2004)所述培養MCF-7和MOF-10F細胞。實施例4-J774、UISO-Md-2和成纖維細胞的共培養與共聚焦顯微術J774、UISO-Mel-2和成纖維細胞在各自蓋玻片上培養。孵育過夜后，用新鮮培養基洗細胞，將這三株細胞系置于培養皿上，培養皿中含有200嗎/ml綴合了ALEXAFLUOR568的wt-天青蛋白。然后細胞在5%C02中37。C孵育0.5或3.5小時。制備顯微鏡樣品時，細胞在蓋玻片上37t培養過夜。蛋白處理前，將細胞置于37t:或4t:2小時。將預熱至37-C或預冷至4'C的新鮮培養基與紅色熒光(以ALEXAFLUOR568標記)銅氧還蛋白或GST-融合衍生物混合，并與細胞孵育。用PBS洗細胞，-20匸甲醇固定5分鐘。用PBS洗兩次后加入封片培養基，封片培養基含1.5嗎/ml的4'，6-二脒基-2-苯基B引哚(DAPI)用于染核(VECTASHILD，Vector,Burlingame，CA)，然后用共聚焦顯微鏡攝影。實施例5-銅氧還蛋白進入J774細胞如實施例4那樣將wt-天青蛋白及其突變體變體M44KM64E、質體藍素、假天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白與J774細胞孵育，用共聚焦顯微鏡觀察細胞。在這些實驗中，銅氧還蛋白綴合了ALEXAFLUOR568而發出紅色熒光，將200pg/ml銅氧還蛋白與J774細胞在37'C孵育1小時，在另一實驗中，6至7pM野生型天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白與J774細胞在37"C孵育1小時。細胞核被DAPI染成藍色。設一不加蛋白的對照。在所有實驗中都觀察到了銅氧還蛋白進入J774細胞的胞質溶膠。在類似實驗中，橙綠曲撓素A和B優先進入MCF7癌細胞，而不是非癌對照細胞。實施例6-wt-天青蛋白和鐵硫菌藍蛋白進入不同類型細胞與MCF-7細胞相比，wt-天青蛋白對MCF-10F細胞表現出了較低的細胞毒性活性。PunjetatOncogene23:2367-2378(2004)。如實施例5所述處理并觀察J774、腹膜巨噬細胞、肥大細胞、人乳腺癌MCF-7及人正常上皮細胞MCF-10F(原種培養物來自DepartmentofSurgicalOncology,UniversityofIllinoisatChicago(UIC)，Chicago),并領!l試wt-天青蛋白是否能進入上述細胞。在45mm孵育期間，wt-天青蛋白被J774細胞內在化。但其被腹膜巨噬細胞或肥大細胞內在化的效率很低。即使孵育6小時后，此類細胞仍僅示出有限的進入。相似地，wt-天青蛋白能夠有效進入乳腺癌細胞MCF-7，但其在正常乳腺細胞MCF-10F中示出非常低的入胞比率。綴合了Alexafluor⑧的天青蛋白有效進入UISOMel-2禾卩MCF-7癌細胞，但在正常乳腺細胞MCF10A1中則不是。而綴合了Alexafluor⑤的鐵硫菌藍蛋白不但進入UISO-Mel-2和MCF-7癌細胞的胞質溶膠也進入正常MCF10A1細胞。與鐵硫菌藍蛋白在癌細胞中均勻分布在胞質溶膠內不同，在MCF10A1細胞中，大多鐵硫菌藍蛋白被隔離在核周圍的核周隙內。實施例7-wt-天青蛋白介導的細胞毒性和生長抑制為了進一步評價wt-天青蛋白進入不同細胞的特異性，我們測定37'C孵育30分鐘與3.5小時后，綴合了Alexafluor的wt-天青蛋白進入J774、UISO-Mel-2和正常成纖維細胞的情況。觀察到wt-天青蛋白在30mm內迅速進入J774和UISO-Mel-2細胞；相同時間內只有極少量的wt-天青蛋白進入成纖維細胞的胞質溶膠。'孵育3.5小時后，在成纖維細胞中只發現了少量wt-天青蛋白。如Yamada，T"etal.Infect.Immun.70:7054-62(2002),Goto,M.，etal.Mol.Microbiol47:549-59(2003)和2003年11月24日提交的共有未決美國專利申請10〃20，603所述，進行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-溴化四唑)(MTT)法測定wt-天青蛋白的細胞毒性，所述文獻內容并入參考。圖l(b)顯示在24小時孵育期間，僅在J774細胞和UISO-Mel-2細胞中觀察到了顯著的wt-天青蛋白介導的細胞毒性。M44KM64E天青蛋白突變體在J774細胞中表現出非常輕微的凋亡誘導活性，但在lmg/ml濃度時可顯著抑制(約95%)G1期到S期的細胞周期進展。如Hiraoka，Y.etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.101:6427-32(2004)和Yamada,T.etalProc.Natl.Acad.Sci.USA101:4770-75(2004)所述，用流式細胞術分析細胞周期進展，所述文獻內容并入參考。圖l(a)顯示以500嗎/ml或lmg/ml的M44KM64E天青蛋白突變體處理成纖維細胞時，細胞周期進展的抑制程度為約20%。實施例8-wt-天青蛋白微注射成纖維細胞和MCF-10F細胞如Punj，V.，etal,Oncogene23:2367-78(2004)所述方法，將wt-天青蛋白微注射入成纖維細胞和MCF-10F細胞。檢査細胞的凋亡誘導情況，凋亡引起核DNA固縮和碎裂。在用wt-天青蛋白孵育5小時后的微注射的單細胞中可觀察到顯著的核DNA(以DAPI染成藍色)固縮和碎裂，但用天青蛋白孵育30分鐘則沒有觀察到此現象。實施例9-37"C時wt-天青蛋白融合衍生物的內在化如實施例1所述制備并純化一系列在N端或C端截短的wt-天青蛋白的GST融合蛋白(圖2(a)和2(b))。采用實施例5所述方法，用綴合了ALEXAFLUOR568的wt-天青蛋白、GST和GST-azu融合衍生物檢測37r孵育1小時后J774細胞中的內在化。核用DAPI染成'i!^:^^fii。wt-天青蛋白被內在化時，GST仍保留在細胞外周，未被內在化。GST-azu36-128和GST-azu36-89及GST-azu36-77也被內在化。然而進一步的截短還證明GST-azu50-77被內在化，而GST-azu36-50的內在化效率非常低并似乎在表面形成團。實施例10~4°(3時天青蛋白融合衍生物的內在化4匸孵育時，檢測了wt-天青蛋白和GST-azu融合衍生物在J774細胞中的內在化。4"C孵育1小時，在J774細胞中wt-天青蛋白的內在化被嚴重損害。用GST-azu36-128和GST-azu36-89也觀察到了相4以的損害。較短的GST-azu36-7、GST-azu50-77、GST-azu50-66和GST-azu67-77在4°C時也證明了內在化的嚴重損害。實施例11-GST-GFP-azu50-77融合蛋白在J774細胞和黑素瘤細胞UISO-MeI-2中的能量依賴性內在化將GST與GFP融合制備GST-GFP融合衍生物。另外，將azu50-77與GST-GFP融合蛋白(Mr53kDa)融合(圖3(a))。用SDS-PAGE檢測純化的GST、GST-GFP和GST-GFP-azu50-77融合衍生物的遷移率(圖3(b))。通過考馬斯藍染色及用抗天青蛋白抗體通過Western印跡進行檢測(圖3(c))。用不同濃度的GST-GFP處理的J774細胞的流式細胞術測定顯示這個蛋白結合J774細胞。用濃度增大的GST-GFP-azu50-77融合蛋白處理的J774細胞的流式細胞術分選顯示與GST-GFP單獨處理相比熒光顯著減弱(圖4)。應注意的是GFP在哺乳動物細胞中的內在化已知會導致熒光喪失。用200pg/ml的GST-GFP-azu50-77融合蛋白處理J774細胞時并在37'C孵育更長時間，熒光減弱也是明顯的。為確定GST-GFP和GST-GFP-azu50-77的結合與內在化特征是否存在不同，用GST-GFP和GST-GFP-azu50-77在37。C和4""C孵育J774和UISO-Mel-2細胞。使用共聚焦顯微術定位綠色熒光。在J774細胞中，GST-GFP融合蛋白在37"C和4'C均結合表面而未被內在化。相反，GST-GFP-azu50-77在37。C被內在化，而在4"C未被內在化。在UISO-Mel-2細胞中，GST-GFP融合蛋白在37'C和4。C均保留在表面。相反，類似于J774細胞，GST-GFP-azu50-77融合蛋白在37。C被內在化，而在4i:未被內在化。實施例12-wt-天青蛋白通過細胞膜穿透和胞吞機制進入哺乳動物細胞如果Wt-天青蛋白入胞僅依賴于受體介導的胞吞作用，那么其入胞可通過質子團(protonophore)carbonylcyanidem-chlor叩hrnylhydrazone(CCCP，一種線粒體能量生成解偶聯劑)或者以未標記天青蛋白或其它阻斷受體的銅氧還蛋白預先孵育而阻斷。以10倍以上濃度的銅氧還蛋白在4°C孵育J774和UISO-Mel-2細胞2小時，充分洗滌細胞以除去銅氧還蛋白，然后用綴合了ALEXAFLUOR568的天青蛋白在37°。孵育1小時。在未經銅氧還蛋白處理的細胞中用一樣多的內在化的天青蛋白。也測試了細胞松弛素D(購自Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo63195)的作用，其是一種已知的受體介導胞吞作用的抑制劑，其破壞細胞微絲網絡，也測試了布雷菲德菌素A(購自Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo63195)的作用，其已知破壞高爾基體并抑制經典的囊泡介導的分泌。20pM濃度的CCCP如0.25至0.5pM的細胞松弛素D—樣顯著降低了UISO-MeI-2細胞對天青蛋白的攝取。而布雷菲德菌素A則沒有明顯作用。實施例13-GST-PEDIII-azu50-77融合衍生物進入UISO-Mel-2細胞如Hwang,J.etal,Cell48:129-36(1987);Reiter，Y.andPastan,I"TrendsBiotechnol16:513-20(1998)所述構建銅綠假單胞菌外毒素A結構域III(PEDIII)的GST融合蛋白。這個GST-PEDIII融合衍生物含有外毒素A的氨基酸381-613。PEDIII已知具有ADP-核糖基轉移酶活性，能夠通過抑制真核延伸因子2而抑制真核細胞中細胞蛋白質合成。采用針對GST-GFP-azu50-77所述的PCR法將azu50-77序列引入到GST-PEDIII融合蛋白的羧基末端(圖5(a))。通過谷胱甘肽-Sepharose4B柱層析法將這兩種融合蛋白(GST-PEDIII和GST-PEDIII-azu50-77)純化為52和54kDa的蛋白質(圖5(b))。然后UISO-Md-2細胞和正常成纖維細胞(FBT)用不同濃度的這些蛋白在37。C孵育24小時，如實施例7所述用MTT分析檢測細胞死亡程度。GST-PEDIII表現出低細胞毒性，而GST-PEDIII-azu50-77融合蛋白由于能有效進入UISO-Md-2細胞而具有高細胞毒性(圖5(c))。相反，融合蛋白對于成纖維細胞則表現出低水平的細胞毒性。實施例14-wt-天青蛋白中a-螺旋去穩定對于其內在化進入UISO-Mel-2細胞無實質影響為檢測a-螺旋是否在天青蛋白入胞中發揮作用，三種螺旋去穩定的脯氨酸殘基被引入wt-天青蛋白的54、61和70位(圖6)，并檢測全長A54PT61PK70P天青蛋白突變體進入UISO-Mel-2細胞的情況。還構建了這些位點的單突變體和雙突變體并檢測入胞情況。采用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)通過定點誘變天青蛋白基因來制備A54PT61PK70P天青蛋白突變體。用200jig/ml突變體在37匸孵育UISO-Mel-2細胞1小時，然后通過共聚焦顯微鏡定位熒光。在這所有情況中，綴合了ALEXAFLUOR568的天青蛋白突變體都進入了UISO-Mel-2細胞。相似地，在檢測GST-GFP-azu50-77融合蛋白與A54PT61PK70Pzau三突變體變體進入UISO-Md-2細胞的情況時，沒有觀察到顯著區別。實施例15-GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合衍生物進入UISO-Mel-2細胞如實施例13構建銅綠假單胞菌外毒素A結構域m(PEDIII)的GST融合蛋白。采用針對GST-GFP-azu50-77所述PCR法將全長鐵硫菌藍蛋白序列引入到GST-PEDIII融合蛋白羧基末端。通過谷胱甘肽-Sepharose4B柱層析法純化該融合蛋白。然后用不同濃度的融合蛋白在37"C孵育UISO-Md-2細胞和FBT細胞24小時，如實施例7所述用MTT分析檢測細胞死亡程度。GST-PEDIII-鐵硫菌藍蛋白融合蛋白對UISO-Md-2細胞表現出高細胞毒性(圖7)。相反，融合蛋白對FBT細胞僅表現出低水平的細胞毒性。實施例16-天青蛋白與GST-Azu55-77競爭進入J774細胞用未標記的天青蛋白在存在7jliM綴合了Alexafluor的GST-azu50-77時在37'C進行競爭實驗。在存在7、14、56|iM未標記天青蛋白時，不用綴合了Alexafluor⑧的天青蛋白、用綴合了Alexafluor的GST-azu50-77(7iaM)和用綴合了Alexafluor的GST-azu50-77(7pM)在37"C孵育J774細胞1小時，然后檢測GST-azu50-77的入胞情況。結果清楚地顯示，與7pM標記的GST-azu50-77單獨使用相比，遞增量的未標記天青蛋白(7、14和56pM)的存在與7|iM標記的GST-azu50-77競爭入胞逐漸增強。相反，相似濃度(6、12和48^M)的未標記鐵硫菌藍蛋白在存在標記的GST-azu50-77時使用時，對GST-azu50-77入胞的影響則非常小。實施例17-天青蛋白蛋白轉導結構域(PTD)與其它銅氧還蛋白的序列和結構比較天青蛋白與鐵硫菌藍蛋白在azu50-77區域的序列相同性低于20%，某些其它銅氧還蛋白也是這樣(DeRienzoetal,ProteinScience9:1439-1454,2000;Murphyetal,J.Mol.Biol.315:859-871，2002)。采用VAST算法對天青蛋白與銅氧還蛋白家族的某些成員之間的結構分析顯示天青蛋白50-77區域與橙綠曲撓素B蛋白(來自綠色嗜熱光合細菌橙色綠屈撓菌的銅氧還蛋白蛋白)的相應區域之間具有顯著的相同性(Bondetal,J.Mol.Biol.306:47-67，2001)。銅氧還蛋白家族的其它成員與天青蛋白的其它區域顯示出結構相似性，但與天青蛋白的52PTD，即氨基酸50-77缺乏顯著的相同性(圖8(a))。事實上，與結構儲存在蛋白質數據庫中的其它蛋白相比，azuPTD與其它蛋白之間的結構相似性非常低。采用CLUSTALX比對程序，對銅綠假單胞菌PTD區域的殘基與其它病原體的細菌天青蛋白已知序列進行多氨基酸序列比對(HigginsandSharp,id.1988)。盡管顯示致植物病的丁香假單胞菌天青蛋白與銅綠假單胞菌天青蛋白的PTD區域具有高度相同性，來自腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白樣蛋白(GotschlichandSeiff,FEMSMicrobiolLett.43:253-255(1987);Kawulaetal，Mol.Microbiol.1:179-185(1987);Cannon,Clin.Microbiol.Rev.2國.S1-S4(1989))也與銅綠假單胞菌天青蛋白的PTD區域具有顯著相同性，與副溶血弧菌和支氣管敗血性包特氏菌的天青蛋白也如此(圖8(b))。基序序列D-G-X-X-X-X-X-D-X-X-Y-X-K-X-X-D(SEQIDNO:35)發現在所有這些天青蛋白中都是保守的。實施例18-腦膜炎奈瑟氏球菌Laz蛋白(HS-天青蛋白)在腦腫瘤細胞系LH229中誘導細胞死亡腦膜炎奈瑟氏球菌(Nm)通過能夠散布進血流、穿透血腦屏障，可能通過跨細胞途徑穿過腦上皮細胞并侵入腦脊膜而導致腦脊髓膜炎。銅綠假單胞菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的天青蛋白結構相似，具有高度氨基酸序列同源性(>50%)。此外，腦膜炎奈瑟氏球菌天青蛋白是一更長多肽Laz(SEQIDNO:30)的一部分，其在其N端具有稱為H.8的表面肽，H.8存在于腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜(Cannon，J.G.,Clin.Microbiol.Rev.vol.2,pp.51-54(1989))。表面暴露的H.8抗原表位還攜帶了脂化信號。完整的腦膜炎奈瑟氏球菌H8外膜蛋白保留在腦膜炎奈瑟氏球菌細胞的外表面。淋病奈瑟氏球菌Laz蛋白與腦膜炎奈瑟氏球菌Laz蛋白非常相似。將淋病奈瑟氏球菌laz基因克隆到大腸桿菌中并將大腸桿菌中的laz基因超表達以產生Laz蛋白(圖13)。然后用MTT法檢測純化的銅綠假單胞菌天青蛋白和純化的淋病奈瑟氏球菌Laz蛋白在腦腫瘤細胞系LH229中誘導細胞死亡的能力(Yamada，T.,etal.,CellCyclevol.3pp.1182-1187(2004))。銅綠假單胞菌天青蛋白在大腸桿菌中表達時位于周質，而Laz蛋白在大腸桿菌中表達時則發現位于大腸桿菌外膜。此外，天青蛋白在24小時內對腦腫瘤細胞具有非常低的細胞毒性，而Laz表現出高細胞毒性，在24小時內引起90%腦腫瘤細胞死亡(表3)。天青蛋白在48小時內示出增加的細胞毒性(表4)。該實驗表明銅綠假單胞菌天青蛋白和淋病奈瑟氏球菌H8-天青蛋白(Laz,SEQIDNO:36)可用于體外和體內診斷和/或治療腦腫瘤。如果Laz蛋白在體內減少了腦腫瘤生長，那么該蛋白的整體或部分可用作本發明的"銅氧還蛋白入胞結構域"來將貨物分子(包括熒光或放射標記或腫瘤殺傷藥物/毒素)轉運進入腦內及腦腫瘤細胞內，進行診斷或治療。表3.孵育24小時后銅綠假單胞菌天青蛋白和淋病奈瑟氏球菌Laz對腦癌細胞系LH229的細胞毒性。_<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表4.孵育48小時后銅綠假單胞菌天青蛋白和淋病奈瑟氏球菌Laz對腦癌細胞系LH229的細胞毒性。__蛋白質細胞毒性(％)STDEV銅綠假單胞菌天青蛋白00.000.00淋病奈瑟氏球菌Laz00.000.00銅綠假單胞菌天青蛋白2511.651.07淋病奈瑟氏球菌Laz2520.044.25銅綠假單胞菌天青蛋白508.552.51淋病奈瑟氏球菌Laz5025.521.80銅綠假單胞菌天青蛋白10016.192.60淋病奈瑟氏球菌Laz10039.720.92銅綠假單胞菌天青蛋白20016.301.91淋病奈瑟氏球菌Laz20087.011.21銅綠假單胞菌天青蛋白40061.9619.15淋病奈瑟氏球菌Laz40098.750.96銅綠假單胞菌天青蛋白■82.715.91淋病奈瑟氏球菌Laz80099.930.12實施例19-淋病奈瑟氏球菌Laz蛋白對腦腫瘤細胞的細胞毒性構建一些編碼包括銅綠假單胞菌天青蛋白、淋病奈瑟氏球菌Laz(SEQIDNO:36)及融合蛋白的蛋白構建體的質粒，在MTT法中用腦腫瘤細胞系測試所述蛋白。被測試的蛋白構建體包括單獨的淋病奈瑟氏球菌LazH.8區域、單獨的銅綠假單胞菌天青蛋白、單獨的淋病奈瑟氏球菌天青蛋白以及圖10顯示的構建體。將編碼這些蛋白構建體的質粒轉化入大腸桿菌或其它適當的表達系統，使蛋白構建體表達并純化所得蛋白。腦腫瘤細胞系包括NL229和CCF-STTG1。實驗結果表明Laz基因的H.8區域和/或天青蛋白區域對于蛋白構建體對腦腫瘤細胞的細胞毒性是必需的。該實驗還檢測了與H.8區域區域融合后其它天青蛋白是否會對腦腫瘤細胞具有更大的細胞毒性。結果顯示H.8區域能夠通過將附著的天青蛋白轉運進入腦癌細胞而使此種銅氧還蛋白對腦癌細胞是細胞毒性。因此，H.8可作為一種轉運結構域將貨物分子轉運進入腦癌細胞。有用的貨物包括本領域中熟知以及本文列出的癌治療與診斷劑。實施例20-癌癥患者的治療一項關于銅氧還蛋白入胞結構域-外毒素A結構域III融合蛋白(研究藥物(StudyDrug))的MI期臨床試驗將在癌癥患者中開展。具體來說，銅氧還蛋白入胞結構域是銅綠假單胞菌的50-67氨基酸區域，貨物是銅綠假單胞菌外毒素A結構域m，組成融合蛋白"PEDIII-azu50-67"。如實施例13所述構建該融合蛋白。49名成人患者患有組織學確診的乳腺癌、結腸癌和黑素瘤，并且經目前可用的FDA批準化療藥物與方案適當治療后出現臨床和放射學進展或復發，將這些患者招募進入一項施用研究藥物的開放性標記前瞻性研究中。為符合該研究的招募條件，所有患者在經過批準的化療期結束后都表現出了可測量腫瘤體積的增大。腫瘤持續轉移和/或腫瘤大小或體積持續增大的證據必須經組織學確認。組織學證據可通過細針抽吸(FNA)活檢獲取。按照InstitutionalReviewBoardoftheUniversityofIllinois,Chicago和FDA的要求取得所有患者的知情同意后制定治療計劃。患者在治療期間不能發作其它惡性腫瘤等疾病，不能有惡性腫瘤、血質不調、胰島素依賴性糖尿病或其它嚴重心血管疾病等可能干擾治療效果適當評價的既往疾病史。開始治療前對患者進行基線血液檢查(全血細胞計數[CBC]和血清生化指標)包括肝功能檢查(LFT)。所有入選患者在試驗期間不能同時接受任何癌癥化療。每天通過靜脈內注射藥學上可接受的研究藥物制品12周施用研究藥物，觀察受試者的任何劑量限制毒性。共設7個劑量水平，開始為10mg/kg/天，以5mg/kg/天遞增，直到最大劑量50mg/kg/天。在7名晚期可測量癌癥(乳腺癌、結腸癌和黑素瘤)患者中記錄每種劑量水平的效力。通過測定可測量腫瘤的二維大小(a和b)對反應做出評價。1)靶轉移性腫瘤完全消失被認為是完全反應(CR);2)縮小75%被認為是優秀部分反應(PR);3)治療后大小縮小50y。是良好反應(PR);4)大小縮小25。/。被認為是穩定疾病(SD);及5)<25M被認為是無反應(NR)。表現出疾病進展的患者將中斷治療，但隨后將進行另外12周的治療。耙轉移性腫瘤完全消失和大小上的任何縮小表明天青蛋白治療對于治療癌癥是有效的。其它表明天青蛋白治療是有效的指標是新發轉移性腫瘤的發生率降低以及腫瘤相關血管發生的減少。在不偏離本發明范圍和精神的前提下，對所述例子和發明系統進行的不同修飾與變更對于本領域精神人員是顯而易見的。雖然已結合具體實施方案對本發明進行了描述，但是應了解請求保護的發明不應過分局限于這些具體實施方案。事實上，對所述進行本發明實施方式作出的對于相關領域專業人員來說顯而易見的不同修飾應在下列權利要求書的范圍內。權利要求1.一種肽，其由與少于全長的野生型銅氧還蛋白或H.8外膜蛋白具有至少約90％的氨基酸序列相同性的序列組成，并且其能促進相連的分子進入哺乳動物癌細胞。2.權利要求1的肽，其中銅氧還蛋白選自由天青蛋白、質體藍素、鐵硫菌藍蛋白、假天青蛋白、橙綠曲撓素和天青蛋白樣蛋白組成的組中。3.權利要求1的肽，其中所述肽來自一種生物體，該生物體選自由銅綠假單胞菌(i^ewcfowow(xyaen/g/wwa)、層理席藻(//zorw/(i/Mm/am/woswm)、氧"(七亞鐵硫桿菌(77'o6ac/〃i^ybroox/6faw)、裂環無色木干菌(爿c/2廠0m06ac&rc_yc/oc/aW&s)、丁香假單胞菌(/^ewcfowowass,/"ga)、月鹵膜炎奈瑟氏球菌(iVe/^en'a附e"/"gWtfo)、畐lj溶血弧菌(脅/o/腦/ze謹o(y"面)、支氣管敗血性包特氏菌(5o*e〃a6rawc/^—ca)、百日咳桿菌(Bo油fe〃a戸f脇h)、橙色綠屈撓菌(C72/ora,;cwsawra""'acws)禾口淋病奈瑟氏球菌(iVe/Me〃'ago"orr/2oeae)組成的組中。4.權利要求1的肽，其中銅氧還蛋白選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36和SEQIDNO:43組成的組中。5.權利要求1的肽，其長度為至少約10個殘基且不超過約50個殘基。'6.權利要求l的肽，其包含與選自SEQEDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47和SEQIDNO:47組成的組中的序列具有至少約90%的氨基酸序列相同性的序列。7.權利要求6的肽，其包含選自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47和SEQIDNO:47組成的組中的序列。8.權利要求6的肽，其由選自由SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47和SEQIDNO:47組成的組中的序列組成。9.權利要求1的肽，其包含選自DGXXXXXDXXYXKXXD和DGXXXXDXXYXKXXD組成的組中的序列；其中D是天冬氨酸，G是甘氨酸，Y是酪氨酸，K是賴氨酸及X是任意氨基酸。10.—種肽，其與銅綠假單胞菌天青蛋白的50-77氨基酸區域具有顯著的結構同源性，并且其能促進相連的分子進入哺乳動物癌細胞。11.一種復合物，其包含貨物化合物和肽或其片段，其中所述肽與銅氧還蛋白具有至少約90%的序列相同性，其中所述肽或者其片段與貨物化合物相連，且其中所述肽能促進所述貨物化合物進入哺乳動物癌細胞。12.權利要求11的復合物，其中所述肽是權利要求1的肽。13.權利要求11的復合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白質、脂蛋白、多肽、肽、多糖、核酸、染料、微粒、納米粒子、毒素和藥物組成的組中。14.權利要求13的復合物，其中所述貨物化合物選自由蛋白質與肽組成的組中，且其中所述肽與所述貨物化合物相連形成融合蛋白。15.權利要求ll的復合物，其中所述貨物化合物是毒素。16.權利要求15的復合物，其中所述毒素是銅綠假單胞菌外毒素A或者其片段。17.權利要求11的復合物，其中所述貨物化合物是可檢測的物質。18.權利要求17的復合物，其中所述可撿測的物質可通過選自熒光測定法、顯微鏡檢術、X線CT、MRI和超聲組成的組中選出的方法進行檢測。19.一種藥物組合物，其包含權利要求11的復合物和藥學上適當的載體。20.—種方法，包括以權利要求11的復合物接觸一或多個細胞。21.權利要求20的方法，其中所述一或多個細胞來源于癌癥患者，并且進一步包括將所述一或多個細胞重新導入患者體內。22.權利要求20的方法，其中所述細胞是癌細胞。23.權利要求22的方法，其中所述細胞是選自由骨肉瘤細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、淋巴瘤細胞、白血病細胞、軟組織肉瘤細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、黑素瘤細胞、腦腫瘤細胞和前列腺癌細胞組成的組中的癌細胞。24.—種治療癌癥患者的方法，其中給所述患者施用治療有效量的權利要求ll的復合物。25.權利要求24的方法，其中施用所述復合物的方式選自靜脈內、局部、皮下、肌內和腫瘤內施用。26.權利要求24的方法，其中所述復合物與另一癌癥治療方法聯合施用。27.—種成像患者癌癥的方法，其中給所述患者施用權利要求17的復合物，并檢測所述貨物化合物的定位。28.權利要求27的方法，其中所述貨物化合物是X線造影劑，并通過X線CT檢測所述貨物化合物的定位。29.權利要求27的方法，其中所述貨物化合物是核磁共振成像造影劑，并通過MRI檢測所述貨物化合物的定位。30.權利要求27的方法，其中所述貨物化合物是超聲造影劑，并通過超聲成像檢測所述貨物化合物的定位。31.—種診斷癌癥的方法，其中將權利要求17的復合物與細胞接觸，并檢測所述貨物分子的定位。32.—種試劑盒，其包含一種試劑，該試劑包含權利要求11的復合物。33.權利要求32的試劑盒，其還包含一種試劑，該試劑包含藥學可接受的佐劑或賦形劑。34.權利要求32的試劑盒，其還包含用于施用所述試劑的載體。35.權利要求1的肽，其中對所述肽的結構進行修飾以延長或優化所述肽在血流中的半衰期。36.—種核酸分子，其編碼權利要求1或10的肽或權利要求14的復合物。全文摘要本發明揭示了將貨物化合物(cargocompound)輸送進入癌細胞的方法與材料。貨物化合物的輸送是通過使用衍生自銅氧還蛋白的蛋白轉導結構域完成的。本發明還揭示了治療癌癥與診斷癌癥的方法。文檔編號C07K14/82GK101437842SQ200580041524公開日2009年5月20日申請日期2005年10月6日優先權日2004年10月7日發明者塔帕斯·達斯古普塔,山田亨,阿南達·查克拉博蒂,阿塞尼奧·菲亞略申請人:阿南達·查克拉博蒂;塔帕斯·達斯古普塔;山田亨;阿塞尼奧·菲亞略