一種穩定的CTLA4Ig蛋白制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥領域，更具體地，本發明涉及一種CTLA4分子制劑。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著生命科學技術的迅速發展，蛋白質藥物進入了快速發展期，多種蛋 白質藥物先后獲準上市銷售。最常見的蛋白質藥物給藥途徑為靜脈內（IV)給藥，但是， 對于需要頻繁和長期給藥的產品而言，皮下（SC)給藥途徑更具吸引力，患者使用起來更 為方便。但是，SC注射的藥物溶液的體積比IV輸注的小得多，從而蛋白質必然以更高的 濃度存在。但是高濃度的蛋白質溶液更易發生聚集，聚集會造成許多問題，包括活性蛋白 的生物利用率減少，藥物代謝動力學改變和不想要的免疫原性。（Frokjaer，S.和Otzen， D.E.，Nat.Rev.Drug.Discov.4:298_306(2005)Jiskoot，W.inCrommelin，D.J.A.，EJHP Practicel2 :20-21 (2006))。因此如何防止聚集已經變成高濃度蛋白質藥物配制的重要事 項。
[0003] 目前防止聚集常見策略一是通過添加賦形劑至蛋白質溶液，常使用的穩定劑 包括糖、鹽、游離氨基酸、多元醇、聚乙二醇（PEG)和可以減少蛋白質-蛋白質相互作用 的其他聚合物，如聚山梨酯（polysorbates)或泊洛沙姆（Nema,S. ~A,PDAJournalof PharmaceuticalScienceandTechnology51:166_171(1997))。或者通過加入適當的賦形 齊U(包括凍干保護劑）低壓凍干來防止蛋白質聚集。
[0004] 聚乙烯批咯燒酮（polyvinylpyrrolidone)，也稱PVP、聚（1-乙烯基-2-批咯燒 酮)、聚維酮和Kollidon，是一種非離子型高分子化合物。目前已開發出相對分子質量從數 千至一百萬以上的均聚物、共聚物和交聯聚合物等系列產品，并以其優異獨特的性能獲得 廣泛應用。其中分子量低于30000道爾頓的PVP通過腎小球濾過作用從體循環中移除。 [0005] 目前，PVP已經在制藥工業中廣泛用作片劑包衣助劑并且在眼用和局部用制 品中用作增黏劑。PVP也已經最初作為血漿增容劑用于腸胃外施用并且隨后在可注 射制劑(例如，抗生素、激素、鎮痛藥）中用來產生黏度。這些制劑限于通常小于500 道爾頓的小分子化合物或小蛋白如激素。含有PVP的當前可用藥品包括Bicillin C-R? (Wyeth)，Wyci11in? (Wyeth)和PfiZerpenTM(PfiZer)，它們均含有小分子青霉素G，以 及非常低濃度O0.6%)的PVP。Depo-SubQProveral04?(PharmaciaandUpjohn)含有 5%PVP連同小分子醋酸甲輕孕酮。Bexxar?(GlaxoSmithKline)含有放射性標記的抗⑶20 抗體連同4. 4-6. 6%PVP。在Bexxar的例子中，PVP特異地用作放射防護劑以減少放射性標 記的抗體因所附著放射性同位素而自輻射分解（美國專利號5,961，955和美國專利號6， 338,835)。
[0006] 類風濕性關節炎被認為是一種T細胞介導的自身免疫病，它涉及T淋巴細胞和 抗原呈遞細胞之間的抗原非特異性細胞間相互作用。一般說來，T細胞應答的強度由T細 胞表面分子與其配體之間的相互作用引發的共刺激應答測定（Mueller,etal.，1989Ann. Rev.Immunol. 7 :445-480)。關鍵的共刺激信號由T細胞表面受體⑶28和CTLA4與抗原呈 遞細胞上的其配體，如B7相關分子CD80 (S卩B7-1)和CD86 (即B7-2)之間的相互作用提供 (Linsley,P.andLedbetter,J. 1993Ann.Rev.Immunol. 11 :191-212)。沒有共刺激存在時 T細胞的激活導致無反應性T細胞應答（Schwartz，R.H.，1992Cell71 :1065-1068)，其中免 疫系統變得對刺激無應答。
[0007] 由于類風濕性關節炎被認為是一種T細胞介導的免疫系統疾病，開發治療類風濕 性關節炎的新試劑的一種策略是鑒定通過阻斷內源性CD28或CTLA4和B7之間的相互作用 而阻斷T淋巴細胞和抗原呈遞細胞之間的共刺激信號的分子。可能的分子包括經修飾而以 比野生型CTLA4或⑶28更高的親和力結合B7,從而阻斷共刺激信號的可溶性CTLA4。
[0008] ⑶28和CTLA4的可溶形式已經通過融合⑶28和CTLA4的可變區（V)樣細胞外 結構域與免疫球蛋白（Ig)恒定區，得到⑶28Ig和CTLA4Ig而構建。CTLA4Ig的核苷酸 和氨基酸序列見圖1，該蛋白氨基酸序列從+1位的甲硫氨酸或從-1位的丙氨酸開始，以 +357位的賴氨酸終止。CTLA4Ig相對于⑶28Ig，與⑶80陽性和⑶86陽性細胞的結合更強 (Linsley，P.，et al.，1994Immunityl :793-80)。已經發現許多T細胞依賴性免疫應答被 CTLA4Ig在體內和體外阻斷（Linsley，P.，et al.，1991b，supra ;Linsley，P.，et al.，1992a Science257:792-795；Linsley,P., et al. ,1992b J.Exp. Med. 176 :1595-1604；Lenschow, D.J. , et al. 1992Science257 :789-792 ;Tan, P. , et al. ,1992J. Exp. Med. 177 :165-173 ; Turka,L A.,1992Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :11102-11105)〇
[0009] 目如尚需要開發一種有效減少1?濃度蛋白質如CTLA4分子聚集的穩定制劑，該制 劑即使在常溫下也能具有較好的穩定性，從而保證制劑的生物利用度。

【發明內容】

[0010] 我們的研發人員經過大量的實驗，研究出一種穩定的高濃度可溶性CTLA4分子制 齊U，該制劑包括聚乙烯吡咯烷酮，該制劑可有效減少高濃度CTLA4分子制劑中CTLA4分子的 聚集。
[0011] 在一些實施方案中，所述高濃度可溶性CTLA4分子制劑，優選包含50mg/ml至 250mg/ml濃度范圍的可溶性CTLA4分子和1%至20%具有2000至54000道爾頓分子量范圍 的聚乙烯吡咯烷酮，更優選1%至4%具有27000至32000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯 燒酮。優選地，CTLA4分子濃度是lOOmg/ml至150mg/ml，更優選125mg/ml;
[0012] 在一些實施方案中，所述高濃度可溶性CTLA4分子制劑，所述制劑其還包含糖，至 少一種緩沖劑，和無菌注射用水，其中所述制劑的PH范圍為6-8。所述糖可選自蔗糖、乳糖、 麥芽糖、甘露醇和海藻糖及其混合物，優選蔗糖，更優選為170mg/ml含量的蔗糖。緩沖劑可 選自：包括但不限于，甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等，優選至少IOmM量的磷酸鈉，其中磷酸 鈉可以是二氫鹽和一氫鹽的混合物。
[0013] 在一些優選實施方案中，所述高濃度可溶性CTLA4分子制劑，其進一步包含表面 活性劑，表面活性劑可選自：包括但不限于聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80);泊洛沙姆 (例如泊洛沙姆188);山梨坦酯及其衍生物；Triton;十二烷基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；十二烷 基、十四烷基、亞油酰-或硬脂酰-磺基甜菜堿；十二烷基、十四烷基、亞油酰或硬脂酰-肌 氨酸；亞油酰_、十四烷基或十六烷基-甜菜堿；月桂酰胺丙基_、椰油酰胺丙基_、亞油酰胺 丙基_、肉豆蘧酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)； 肉豆蘧酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油酰基牛磺酸鈉或 甲基油醜基牛橫酸二納；和MONAQUAT? 系列（MonaIndustries,Inc.，Paterson,N.J.);聚 乙二醇，聚丙醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。優選為8mg/ml 量的帕洛沙姆188。
[0014] 在一些實施方案中，其中所述可溶性CTLA4分子優選具有野生型序列的CTLA4分 子和/或在CTLA4的細胞外結構域具有一個或多個突變的可溶性CTLA4分子。該藥物組合 物可以包含可溶性CTLA4蛋白分子和/或核酸分子，和/或編碼這些分子的載體。在優選 實施方案中，所述可溶性CTLA4分子是以圖1所示（SEQIDNos: 1-2)的+1位的甲硫氨酸 或-1位的丙氨酸開始，以+357位的賴氨酸終止的CTLA4Ig;更優選的實施方案中，所述可 溶性CTLA4分子是以圖1所示的+1位的甲硫氨酸開始，以+357位的賴氨酸終止的CTLA4Ig。
[0015] 本發明的制劑可有效防止CTLA4分子在長期儲存過程中發生聚集，為我們提供了 一種具有更好的穩定性的CTLA4分子蛋白制劑，即使在常溫下也能具有較好的穩定性，保 證制劑合理的保質期。
[0016] 本發明的制劑，其可用于治療人的炎性疾病，如類風濕關節炎、強直性脊柱炎、銀 屑病等。優選地作為注射用水性溶液而被使用，可以根據需要稀釋成一定濃度的水性溶液 靜脈注射使用，或者更優選的充裝在預充式注射器中通過皮下注射使用。
【附圖說明】
[0017] 圖I:CTLA4Ig序列；
【具體實施方式】
[0018] 下面的實施例是為了舉例說明本發明并幫助本領域技術人員進行和使用本發明。 這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。
[0019] 可溶性CTLA4分子可以參照ZL01812229. 9中公開的方法制備得到，制劑可參照 CN200680053051. 4中公開的制備方法制得，也可以按照ZL200610147281. 9中公開的制備 方法制得。PVP購自上海舉微國際貿易有限公司，其它未標注來源的其它材料均是通過公開 的商業途徑購買得到。
[0020] 實施例IPVP分子量對可溶性CTLA4分子蛋白制劑的影響
[0021] 研究25°C含有不同分子量PVP的可溶性CTLA4分子蛋白制劑的穩定性。所述制劑 除PVP外還含有其它的按照在表1中所給出的詳情的賦形劑。
[0022] 表1 :含不同分子量PVP的可溶性CTLA4分子蛋白制劑
【主權項】
1. 一種穩定的高濃度CTLA4分子藥物制劑，其包含50mg/ml至250mg/ml濃度范圍的可 溶性CTLA4分子和1%至20%具有2000至54000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯烷酮。
2. 根據權利要求1所述制劑，其包含lOOmg/ml至150mg/ml濃度范圍的可溶性CTLA4 分子和1%至4%具有27000至32000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯烷酮。
3. 根據權利要求3所述的制劑，其包含125mg/ml的可溶性CTLA4分子和4%具有27000 至32000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯烷酮。
4. 根據權利要求1-3任一所述的制劑，其中所述可溶性CTLA4分子的氨基酸序列如圖 1所示，從+1位的甲硫氨酸或從-1位的丙氨酸開始，以+357位的賴氨酸終止。
5. 根據權利要求1-3任一所述的制劑，其還包含糖，至少一種緩沖劑，和無菌注射用 水，其中所述制劑的PH范圍為6-8。
6. 根據權利要求5所述的制劑，其中緩沖劑為至少IOmM量的磷酸鈉。
7. 根據權利要求5所述的制劑，其中所述糖為蔗糖，含量為170mg/ml。
8. 根據權利要求5所述的制劑，其進一步包含表面活性劑。
9. 根據權利要求8所述的制劑，其中表面活性劑為含量8mg/ml的帕洛沙姆188。
10. 權利要求9所述的制劑在制備治療炎性疾病的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種穩定的高濃度CTLA4分子藥物制劑，其包含50mg/ml至250mg/ml濃度范圍的可溶性CTLA4分子和1%至20%具有2000至54000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯烷酮，優選1%至4%具有27000至32000道爾頓分子量范圍的聚乙烯吡咯烷酮。本發明的制劑可有效減少高濃度CTLA4分子蛋白的聚集。
【IPC分類】A61P19-02, A61P29-00, A61K38-17, A61P17-06, A61K47-32
【公開號】CN104740639
【申請號】CN201310751951
【發明人】翟志慧, 黎健榮
【申請人】上海中信國健藥業股份有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2013年12月31日