犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫球蛋白制劑，尤其涉及犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑，本發 明還涉及所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法及其在制備預防或治療犬細 小病毒病的藥物或試劑中的用途，屬于免疫球蛋白制劑的制備領域。
【背景技術】
[0002] 犬細小病毒病是由犬細小病毒（canine parvovirus，CPV)感染犬引起的一種急性 傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎和白細胞顯著減少以及心肌炎為主要特征，發病率高， 傳染性強，死亡率高，是危害犬最為嚴重的傳染病之一。目前，犬細小病毒疾病臨床治療藥 物主要是抗病毒藥物和注射干擾素，但是這些藥物效果并不顯著。
[0003] 免疫球蛋白是一類具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白，它普遍存在于 動物的血液、組織液及外分泌液中，其中血清和初乳中的含量最高。免疫球蛋白是機體免疫 系統的重要組成成分，在抗感染和免疫調節中發揮著重要的作物。經靜脈注射吸收后，可迅 速提高受者血液中免疫球蛋白的含量，通過其特異性中和作用及免疫調理等功能，起到預 防和治療各種病毒性、細菌性、真菌性、寄生蟲性等疾病的作用。
[0004] 因此，開發一種針對犬細小病毒的高純度、高濃度、高活性和高效價的特異性免疫 球蛋白制劑，是臨床治療和緊急預防犬細小病毒病的有效手段。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑；
[0006] 本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種所述犬細小病毒特異性免疫球蛋 白制劑的制備方法，該方法所制備的犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑具有高純度、高濃 度和高效價的特點；
[0007] 本發明所要解決的第三個技術問題是提供所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制 劑在制備預防或治療犬細小病毒病的藥物或試劑中的用途。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0009] 本發明首先公開了一種犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑，包括：犬細小病毒 特異性免疫球蛋白；其中，所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白的含量> 30mg/ml，純度 彡97%，內毒素含量< 16IU，針對犬細小病毒的中和抗體效價（TCID5Q/200 μ 1)達到I :400 以上。
[0010] 本發明所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑為pH 4.0左右的液態或凍干劑 型；其中，犬細小病毒特異性免疫球蛋白主要以IgG單體存在。本發明犬細小病毒特異性免 疫球蛋白制劑保存期長，2-8°C可保存2年以上。
[0011] 本發明所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑的使用方法，一般采用直接靜脈推 注或靜脈滴注；使用量較少時，可以直接靜脈推注；使用量較大時，可采用5%葡萄糖注射 液或氯化鈉注射液適當稀釋后進行靜脈滴注；主要用于各品種犬的細小病毒感染疾病的治 療與緊急預防，有效增加患病犬機體免疫力和抗病力。
[0012] 當犬受到細小病毒感染時，盡快靜脈輸注本發明犬細小病毒特異性免疫球蛋白制 劑，可迅速使病犬血液中的犬細小病毒抗體從無或低濃度上升到有保護水平的濃度，迅速 中和和殺滅病犬體內的細小病毒，有效阻止細小病毒對機體的繼續感染和侵害，起到迅速 治療犬細小病毒病的作用。同時，免疫球蛋白自身又具有機體免疫調理作用，激活病犬體內 的免疫細胞吞噬和清除侵入的病原，迅速增強病犬免疫力和抵抗力。
[0013] 本發明進一步公開了一種所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法，包 括以下步驟：（1)制備高免健康犬血漿或血清；（2)低溫乙醇法提取步驟（1)制備的血漿或 血清中的犬細小病毒特異性免疫球蛋白；(3)純化步驟（2)所提取的犬細小病毒特異性免 疫球蛋白；(4)將步驟（3)純化后的犬細小病毒特異性免疫球蛋白進行超濾、濃縮、透析、過 濾除菌，分裝，即得。
[0014] 其中，步驟（1)所述制備高免健康犬血漿或血清，包括以下步驟：選取健康犬，接 種犬細小病毒疫苗，2周后按照同樣方法加強免疫；免疫后10-14天，采集抗體效價不低于 I :1280的犬血漿或血清。
[0015] 經中國農業部合法批準的多種犬細小病毒疫苗均適用于本發明，按照使用說明使 用即可。
[0016] 步驟（2)所述低溫乙醇法包括：（a)將血漿或血清融化，降溫至0°C，調整pH至 7. 5-7. 8 ;優選為使用pH為4. 0的醋酸緩沖液調整pH ;按照g/100ml計，加入預冷乙醇，優 選為預冷-15°C - -20°C的53. 3%乙醇至終濃度9-12%，離心，收集上清液；
[0017] (b)調整上清液的pH至3. 5-4. 4 ;按照g/100ml計，加入乙醇至終濃度15-25%， 靜置過夜，離心，收集沉淀；
[0018] (c)向步驟（b)所得沉淀中加入10倍體積的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸調整pH至5. 1-5. 5,攪拌4-6小時，靜置過夜，獲得溶解液（I );
[0019] (d)將步驟（C)所獲得的溶解液（I )用連續離心機離心，收集上清液，過濾，得濾 液；用〇· 5mol/L Na2HPO4和0· 5mol/L醋酸調整濾液的pH至4. 0-5. 5 ;然后，按照g/100ml 計，加入乙醇至終濃度20-25%，攪拌3-5小時，靜置過夜，獲得溶解液（II );
[0020] (e)將步驟（d)獲得的溶解液（II )離心，得到上清液；將上清液調pH至5. 5-6. 4， 然后按照g/l〇〇ml計，加入乙醇至終濃度23-25%，靜置過夜，離心，收集沉淀，即得。
[0021] 優選的，步驟（2)所述低溫乙醇法包括：（a)將血漿或血清融化，降溫至0°C，調整 pH至7. 5 ;按照g/100ml計，加入預冷乙醇（_15°C - -20°C的53. 3%乙醇）至終濃度10%， 離心，收集上清液；
[0022] (b)調整上清液的pH至4. 0 ;按照g/100ml計，加入乙醇至終濃度20%，靜置過夜， 離心，收集沉淀；
[0023] (c)向步驟（b)所得沉淀中加入10倍體積的0°C注射用水，用0· 5mol/L Na2HPO4 和0. 5mol/L醋酸調整pH至5. 5,攪拌4小時，靜置過夜，獲得溶解液（I );
[0024] (d)將步驟（c)所獲得的溶解液（I )用連續離心機離心，收集上清液，用0· 45um 濾板過濾，得濾液；用0. 5mol/L Na2HPOjP 0. 5mol/L醋酸調整濾液的pH至5. 0 ;然后，按照 g/100ml計，加入乙醇至終濃度20%，攪拌4小時，靜置過夜，獲得溶解液（II );
[0025] (e)將步驟（d)獲得的溶解液（II )離心，得到上清液；將上清液調pH至6. 0,然 后按照g/lOOml計，加入乙醇至終濃度25%，靜置過夜，離心，收集沉淀，即得。
[0026] 本發明對上述低溫乙醇法中調整pH值所用的試劑沒有特殊限定。
[0027] 為了能夠獲得純度更高、蛋白含量更高、內毒素含量更低以及抗體活性更好的免 疫球蛋白，本發明對傳統的低溫乙醇法分離和提取血漿或血清中的免疫球蛋白的方法進 行了優化。結果表明，采用優化后的低溫乙醇法所制備的犬細小病毒特異性免疫球蛋白制 劑的犬細小病毒特異性免疫球蛋白濃度為32mg/ml，蛋白質純度為97%，內毒素含量小于 16IU;中和抗體效價的測定結果表明，采用優化后的低溫乙醇法所制備的犬細小病毒特異 性免疫球蛋白TCID 5Q/200 μ 1 = 1/431，即I :431的犬細小病毒特異性免疫球蛋白可保護 50%細胞不產生病變。而調整低溫乙醇法中的pH或乙醇終濃度，所制備的犬細小病毒特 異性免疫球蛋白的蛋白質濃度均低于20mg/ml，蛋白質純度為90%左右，內毒素含量高于 32IU ;所制備的犬細小病毒特異性免疫球蛋白TCID5(l/200 μ I = 1 :286-325,抗犬細小病毒 的中和抗體效價明顯降低。
[0028] 綜上，采用優化后的低溫乙醇法所制備的犬細小病毒特異性免疫球蛋白的濃度、 蛋白質純度更高，內毒素含量明顯降低；抗犬細小病毒的中和抗體效價顯著提高。
[0029] 本發明所述犬細小病毒特異性免疫球蛋白制劑的制備方法，步驟（3)所述純化 采用離子交換層析法；優選為，采用DEAE-Sepharose-FF凝膠柱。具體步驟包括：（1)用 0. 5mol/L NaOH溶液調蛋白液pH至6. 6 ; (2)用磷酸鹽緩沖液平衡凝膠柱；（3)上樣蛋白液， 待IgG蛋白峰剛出現收集穿透蛋白液；(4)上樣完成后用磷酸鹽緩沖液沖洗，待IgG峰下降 至最高峰的約2/3處，用醋酸鹽緩沖液沖洗層析柱，收集