一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫 苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性法氏囊病（Infection bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病毒 (Infection bursal disease virus，IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病，主 要感染3~12周齡的青年雞，該病毒主要在法氏囊的淋巴細胞內增殖，并且對其它免疫器官 造成不同程度的損傷，最終導致雞的法氏囊萎縮而引起雞的免疫抑制。本病在臨床上可以 導致體重減輕、生長緩慢和骨骼肌出血等癥狀，小于3周齡的雞則不會表現出明顯的臨床特 征。但是，在亞臨床感染的雞法氏囊上也會有一些鏡檢病理變化和免疫抑制現象，給養雞業 帶來了巨大的經濟損失。本病可以導致雞本身對其他疾病的抵抗力減弱，并且干擾如新城 疫、馬立克氏病和傳染性支氣管炎等病的疫苗的免疫效果。目前，IBDV疫苗的種類主要包括 活疫苗、滅活疫苗、抗原抗體復合物疫苗、基因工程疫苗等。根據國內外活疫苗的臨床使用 情況來看，活疫苗雖然可以起到一部分保護作用，但是存在自身法氏囊萎縮的情況，從而導 致自身免疫系統的紊亂，另外基因工程疫苗、抗原抗體復合物疫苗同樣存在保護率偏低的 情況。滅活疫苗免疫雞只后可以產生較高的抗體，能夠有效的保護機體，但是目前國內的法 氏囊滅活疫因其免疫效果差或生產成本高，沒有得到廣泛推廣，各大種雞場使用的大多還 是價格昂貴的進口疫苗。新城疫、雞傳染性法氏囊病是造成雛雞高死亡率的兩種重大傳染 病，嚴重制約著養雞業的健康成長。做好這兩種疾病的防疫工作，特別是1日齡雛雞的防疫 工作，是保證養雞業健康發展的前提。因此，開發一種即能用于成雞又能用于雛雞免疫預防 這兩種疾病的安全、有效的疫苗已刻不容緩。針對養雞業上述問題，本項目的提出可以解決 養雞業中成雞與雛雞新城疫、傳染性法氏囊病的免疫預防難題，降低行業內疾病的流行，增 加出欄率，為我國的養雞業保駕護航。
[0003] 水包油包水乳化佐劑具有鋁膠佐劑、水包油佐劑和油包水佐劑的特點，與油包水 乳化佐劑相比，其制備疫苗所需要的抗原濃度大大降低，另外因其具有水包油佐劑的特性， 使得其可以添加水溶性的免疫增強劑、中藥多糖和鎮痛劑(維生素），在疫苗免疫機體時可 以緩解疼痛，減少動物應激，同時免疫增強劑、中藥多糖還具有提高免疫效果，預防疾病等 功能。
[0004] 維生素是機體代謝中必不可少的有機化合物。機體猶如一座極為復雜的化工廠， 不斷地進行著各種生化反應。其反應與酶的催化作用有密切關系。酶要產生活性，必須有輔 酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調節機 體正常代謝的重要物質。
[0005] 黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質，也是自然界藥用植物中的主要活 性成分之一。它是指具有15個碳原子并以C6-C3-C6的方式構成的三環天然有機物，是植物 在長期自然選擇中產生的二級代謝產物，現在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果 蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機體內自由基、抗老化、抗突變、調血脂降血 壓等藥理保健功能，是一類極具開發前景的天然有機抗氧化劑，這些抗氧化活性物質可以 減少和清除機體內自由基，具有預防疾病的作用。
[0006] 法氏囊素(bursin，BS)是從禽類特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius)中分離出來的一種活性三肽物質，其結構為L-LyS-His-Gly-NH2。研究表明，BS 能促進禽類和哺乳動物B淋巴細胞前體的分化、增殖，能提高B細胞系Daudi細胞內第二信使 cAMP和cGMP水平，加快B細胞內DNA轉錄成mRNA的速度，促進B細胞內蛋白質的生成，從而使B 細胞產生和分泌抗體能力加強。
[0007] 本發明基于上述技術背景，提出一種雞傳染性法氏囊復合滅活疫苗的制備方法， 該疫苗由雞傳染性法氏囊抗原加適量含免疫增強劑制成，劑型為水包油包水型。通過該方 法制備的復合滅活疫苗，因其擁有水包油，油包水兩種特性，使得水溶性的維生素、法氏囊 素、中藥黃酮等免疫增強劑與鎮痛劑易于溶解，利于動物機體吸收，免疫時可降低動物應 激，減少動物痛苦，可提高動物福利；同時免疫增強劑可大大提高活疫苗的細胞，產生較高 的中和抗體，大幅提高保護率。

【發明內容】

[0008] 針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種雞傳染性法氏囊病復 合滅活疫苗的制備方法的技術方案。
[0009] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于包括以下工 藝步驟： 1) 病毒增殖 (1) DF-I細胞的傳代 取培養24-48小時以內，細胞形態良好，分布均勻且長滿單層的細胞瓶，棄去細胞培養 液，向細胞培養瓶中加入胰蛋白酶溶液消化;倒掉細胞消化液，然后向細胞瓶內加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12細胞生長液，用吸管輕吹細胞表面，使細胞脫落并分散均勻，然后加入 細胞生長液按1:3-4傳代； (2) 接種 待24-48小時細胞長成單層后進行換液和接毒，取生產用毒種，按細胞維持液量的1%接 種已長成良好單層的DF-I細胞，置37°C繼續培養，細胞維持液為含2%胎牛血清的DMEM/F12 溶液； (3) 收獲 接毒后24-48小時，待細胞病變達到75%以上時收獲細胞液； 2) 雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗制備 將步驟1)中得到的病毒液進行無菌檢驗、病毒含量測定，檢驗合格后進行甲醛滅活，滅 活檢驗合格后，在每1000 ml滅活檢驗合格的雞傳染性法氏囊病病毒抗原液中加入1~2份免 疫增強劑混合均勻，每份免疫增強劑含有中藥黃酮10~20g、維生素組合3~6g和法氏囊素 10~20mg，然后與桑米特家畜水包油包水佐劑按體積比3: 2進行乳化分裝制成雞傳染性法 氏囊病復合滅活疫苗，上述的中藥黃酮由菊花10~30份、生地10~30份、蔓荊子20~40份、 龍膽草10~20份、黃芩10~30份、土茯苓20~30份和玄參10~30份構成的中藥組合物中提 取得到。
[0010] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥 黃酮通過以下步驟制得： a、 按菊花10~30份，生地10~30份，蔓荊子20~40份，龍膽草10~20份，黃苳10~30份， 土茯苓20~30份，玄參10~30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原 料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一 次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； c、 將b中上清進行醇沉，上清即得粗制中藥黃酮； d、 將c中粗制中藥黃酮進行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進 行減壓真空濃縮，如此三次后，最后經0.22um濾膜過濾除菌，然后經冷凍真空干燥即得到中 藥黃酮。
[0011] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的法氏 囊素通過以下步驟制得:將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7.2滅菌冷PBS洗凈，按1:1 比例加入PH7.2滅菌冷I 3BS，在組織勻漿機中進行高速勻漿，勻漿液中加入占2.5%重量的胰 蛋白酶，反復凍融3次，12000rpm離心20min，棄沉淀，上清用1000 da截留分子量的超濾膜進 行超濾，膜下液經〇. 22um濾膜過濾除菌，濾過液即為法氏囊素粗提液，粗提液經冷凍真空干 燥得到法氏囊素。
[0012] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生 素組合中含有維生素 D 20~40%、維生素 E 30~60%和維生素 B2 10~30%。
[0013] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的維生 素組合中含有維生素 D 25~35%、維生素 E 35~55%和維生素 B2 15~30%。
[0014] 所述的一種雞傳染性法氏囊病復合滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的中藥 黃酮由菊花15~25份、生地15~25份、蔓荊子25~35份、龍膽草12~18份、黃芩15~25份、土 茯苓22~26份和玄參15~25份構成的中藥組合物中提取得到。
[0015] 本發明中桑米特家畜水包油包水佐劑由珠海國年生物科技有限公司生產銷售。
[0016] 本發明具有以下有益效果： 1.本發明采用了新的疫苗佐劑，所制備的疫苗具有油包水、水包油雙重特性，兼具了疫 苗的緩釋作用以及水溶性免疫增強劑、中藥黃酮、鎮痛劑等共同作用的優點。
[0017] 2.本發明采用了有效的免疫增強劑，大幅度提高了機體的免疫力，提高滅活疫苗 細胞免疫能力，刺激機體產生高效的中和抗體，提高了機體預防疾病的能力。
【具體實施方式】
[0018] 為了使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解， 這些實施例僅用于說明本發明而不用于限止本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實 驗方法，通常按常規實驗方法進行。
[0019] 實施例1雞傳染性法氏囊病病毒懸液制備 (I)DF-I細胞的傳代 取培養24-48小時以內，細胞形態良好，分布均勻且長滿單層的細胞瓶，棄去細胞培養 液，向細胞培養瓶中加入適量胰蛋白酶溶液消化;倒掉細胞消化液，然后向細胞瓶內加入含 10%胎牛血清的DMEM/F12細胞生長液，用吸管輕吹細胞表面，使細胞脫落并分散均勻，然后 加入細胞生長液