用于治療中樞神經系統疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅細胞生成素的鼻用制劑的制作方法
【專利說明】用于治療中樞神經系統疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅 細胞生成素的鼻用制劑
[00011 本申請是申請號為200680034781.X、申請日為2006年7月27日、發明名稱為"用于 治療中樞神經系統疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅細胞生成素的鼻用制劑"的發明專 利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及生物制藥工業，特別涉及含有低含量(堿性)唾液酸的rhEPO鼻內藥物 的制備，其通過遺傳工程開始于中國倉鼠卵巢細胞，用于治療腦血管、神經變性和精神病學 疾病。
【背景技術】
[0003] 促紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，其分子量在34kDa范圍內；該蛋白質部 分由大約166個氨基酸組成;它產生于腎、肝臟和中樞神經系統的細胞中，并且它參與紅細 胞和其它造血細胞的增殖、分化和成熟。
[0004] 1998年，Sakanaka和合作者報告了在沙土鼠的頸總動脈阻塞(一個全球性的缺血 模型），接著將rhEPO注入側腦室后，rhEPO對抗體內缺血損傷的神經元保護特性。那些作者 觀察到對CA 1海馬神經元的缺血性損傷的減少。
[0005] rhEPO的神經元保護作用可能歸于不同的因素，包括：拮抗谷氨酸誘導的細胞毒 性、增加抗氧化性酶的表達、減少自由基介導的一氧化氮(NO)的形成、使腦血流正常化、影 響神經遞質的釋放、促進新血管發生、抑制興奮性毒素或一氧化氮誘導的細胞凋亡、增加抗 細胞凋亡基因的表達、神經營養作用、降低神經元興奮性、腦抗炎作用、抑制kainato誘導的 細胞凋亡和促炎性細胞因子的產生、血管原性和神經原性作用。此外，rhEPO有助于缺血預 調節。整體而言，這些原因可以證明rhEPO在治療腦血管、神經變性、精神病學疾病中的應 用。
[0006] rhEPO的神經元保護特性能預防神經元死亡或使神經元死亡復原，神經元死亡成 為許多中樞神經系統疾病，例如缺血、神經性創傷和神經變性和神經元炎性疾病的特征性 事件。
[0007] 還描述了神經變性過程促使觸發精神分裂癥的生理病理學。這就是為什么神經元 保護性藥物可以是治療該疾病的有效替代治療。
[0008] -旦將生物暴露于某些病理學條件，例如低血糖癥或強烈的神經元去極化，或由 于線粒體產生氧一反應性物種，rhEPO的表達顯著增加。
[0009] 另一方面，炎癥過程通過不同的機理增加腦損傷，并且它們甚至直接局部抑制EPO 的產生。事實上，即使在腦缺血后內源性產生rhEPO,其表達也顯著地受到炎性細胞因子的 抑制。該抑制降低了 rhEPO的神經元保護能力并證明了 rhEPO的外源性施用對腦血管、神經 變性或精神病學疾病特別有益。
[0010] 此外，眾所周知，rhEPO分子對其受體(receiver)的親和力（并且，因此，對該分子 的生理學反應的有效性)與和它結合的唾液酸百分比反相關。
[0011] 通過靜脈內途徑對腦缺血的鼠模型施用，rhEPO的神經元保護作用[LM Brines and cols,PNAS97( 19) :10526-10531,2000]減少了由缺血引起的損傷50%到75%，并且在 人類中產生類似的效果(W0 0354475)。然而，使用酸性重組人促紅細胞生成素(rhEPO)的臨 床和實驗結果還沒有評估使用該分子對誘導紅細胞生成的潛在負性中期影響，因為已知血 腦屏障（BBB)的低滲透性和CNS中rhEPO受體的低親和性，為了相對長時間獲得有效的藥理 學效果，需要相對大量的rhEPO。在這些條件下，人們冒增加血液粘度和增加溶血栓事件(其 導致大腦缺血）的可能性的風險。已經報道了應用酸性rhEPO的這些負性結果是用該分子治 療的腎炎患者中的并發癥。
[0012] 為了開發出增加 BBB滲透性(其被認為是將物質結合至腦組織中的關鍵步驟)的方 法，已經進行了研究（US 5260308;TO 8901343;US 4801575;US 5442043;JP 57146710和JP 01149718)。這些方法中的許多方法包括形成肽的綴合物的所謂的載體(US 5442043)，或它 們使用嵌合肽(US 48015575)來將物質結合到腦。已經報道過包含促紅細胞生成素的脂質 體的制劑（JP 08231417)。已報道了關于神經節苷脂的使用鼻內途徑使分子達到CNS(US 4639437)，以及關于神經元治療藥通過鼻粘膜對它們的吸收并隨后通過神經嗅覺途徑將它 們輸送到達腦(EP 504263)。
[0013] 存在幾個涉及rhEPO液體制劑保護的專利，下面列出其中最具有代表性的專利： [0014]液體制劑，其中使用的有效成分是rhEPO并且其中在任何情況下，蛋白質以可注射 的形式提供（例如：CIP0-2041989;CIP0-2353553)。這種給藥方式表明使用的rhEPO為酸類 型，就是說，超過40%的分子為唾液酸所覆蓋，否則它將被肝臟酶滅活，并且它在臨床上不 會有效。
[0015] 專利CIP0-2074820使用鼻內途徑來施用蛋白質。在該情況下，環糊精用作制劑的 成分，并且同樣追求rhEPO的全身性吸收，以至于蛋白質也是酸性的。
[0016] 存在涉及使用生物粘附劑增加蛋白質在鼻腔內的停留時間的科學出版物 Polireddy D和cols，[International Journal of Pharmaceutics(127):115-133,1996]； 然而，沒有關于在含有rhEPO的制劑中使用生物粘附劑的報道。
[0017] 專利CIP0-2353553證明了外源性施用rhEPO用于治療大腦缺血，但與以前的情況 完全一樣，該研究是蛋白質直接或者間有效地進入血流以便有效，以至于我們同樣地在存 在含有高含量唾液酸的rhEPO。
[0018] 專利CIP0-2408685覆蓋了rhEPO的不同制劑，但在這種情況下，打算讓它們用于治 療貧血，所以它是酸性rhEPO,因為堿性rhEPO不能促進紅細胞的增殖、分化和成熟。
[0019] 專利CIP0-2437333詳細說明了保護的制劑是起源于α促紅細胞生成素，也就是起 源于酸性rhEPO。
[0020] 在以前披露和文獻中修訂的所有情況中，提到的是酸性rhEPO,而我們正在申請的 專利打算保護起源于堿性rhEPO的液體制劑。

【發明內容】

[0021 ]在rhEPO的生產過程中，獲得有不同含量唾液酸的糖蛋白。小于40%的其分子被 (堿性)唾液酸保護的蛋白質正常被清除，因為它通過全身途徑而不具有生物學活性。含有 低含量唾液酸的這種堿性rhEPO代表了全部產生的rhEPO的70%。令人意外地是，我們已發 現鼻內施用堿性rhEPO能夠比酸性rhEPO具有更高的治療價值;本發明的結果使得能利用 rhEPO的堿性同工型，其當時沒有被回收而且容易獲得。這代表了很大的經濟優勢，因為它 允許回收在當時組成rhEPO生產的廢物。
[0022]在初級衛生保健系統水平，在能走的基礎上，該制劑可以用來治療和/或預防中樞 神經系統疾病，包括腦血管，神經變性和精神疾病。建議的溶液的優勢包括使用具有低含量 唾液酸的rhEPO用于允許在較小劑量下有更大保護作用的治療目標。實現了治療藥快速到 達作用部位，而這對在存在腦缺氧的情況下，獲得滿意的治療效果是關鍵的。在腦血管疾病 的特殊情況下，在級聯缺血的一些過程發生之前，在急性期從治療干預開始是必要的。這稱 為治療窗口期。
[0023]鼻內施用堿性rhEPO消除了誘導紅細胞生成的危險。紅細胞濃度的增加將增加血 液粘度，從而使阻塞或出血事件后再灌注危險，以至于腦血流將減少并因此將阻礙氧和養 分到達腦組織。
[0024] 鼻內途徑比其它施用形式有更大的優勢，允許快速到達腦；它比靜脈內或腦室內 途徑的侵入性更小，并且一定百分比的rhEPO能到達腦脊液而不必首先傳到血流，這避免首 過肝臟步驟代謝，從而防止了它隨后失活。鼻內應用不是創傷性的并且消除了外科手術危 險和其它由創傷性途徑產生的可能并發癥。它構成了在不損害BBB的條件下到達腦的可替 代性途徑。使用血管途徑的可替代性的施用途徑保證了分子經通過組織液的擴散，到達中 樞神經系統的很少或無血液灌注的區域。
[0025] 考慮到鼻內施用的主要限制之一是快速纖毛-誘導的粘液清除，本發明采取了使 用生物粘附性聚合物的策略，該生物粘附性聚合物增加了rhEPO在鼻腔內的停留時間。在制 劑的開發過程中，為了獲得具有物理、化學和微生物學穩定性(該穩定性自始至終保持其治 療特性）的制劑，也混合了其它的輔助性物質或賦形劑，例如防腐劑、張力活性劑、pH調節 劑、等滲劑和蛋白質穩定劑，所述自始至終保持其治療特性。
[0026] 使用的rhEPO在其分子中包含小于40%的唾液酸(就是堿性rhEPO)，其濃度在0.5 到2mg/mL的范圍內。因此，提供的制劑為液體、無色、透明制劑，無機械雜質，表觀粘度在10 至lj250mPas的范圍內。使用了濃度0.4到0.9%的羥丙基甲基纖維素(HPMC)，0.2到0.8 %的羥 丙基纖維素(HPC)，0.25到0.5%的甲基纖維素(MC)作為生物粘附性聚合物。
[0027]主要