專利名稱：骨橋蛋白在牙用制劑中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及牙用制劑。尤其是本發明涉及骨橋蛋白(OPN)用于顯著減少牙釉質上菌斑細菌生長的用途。
背景技術：
存在許多與牙齒護理相關的問題，美容上以及治療上，如牙菌斑的形成，牙菌斑中細菌的生長，齲齒，牙垢(牙石)，牙周病和牙齒的脫礦質。
牙菌斑是累積在口腔中硬組織(牙齒)上的復合生物膜。盡管超過500種的細菌種構成菌斑，但移居遵循軍團模式，初始的定居者粘附在釉質唾液表膜上，接著通過細菌粘附第二次移居。公知大量鏈球菌種屬于早期的定居者。因此重要的是控制這些細菌的粘附。各種粘附素和分子的相互作用成為粘附相互作用的基礎并引起菌斑形成，最終引起疾病如齲齒和牙周病。
牙釉質由羥磷灰石構成。口腔中存在著羥磷灰石之間的天然平衡，一方面，羥磷灰石從牙釉質中溶解出來，另一方面，羥磷灰石從唾液中天然產生的物質在牙齒之上或之中形成。當平衡使得羥磷灰石溶解時，出現生齲齒的情況，稱之為脫礦質。
長期以來已知將氟化物離子引入釉質中來防止其脫礦質。因此，通常將氟化物摻入牙膏中，然而，氟化物會引起氟中毒，尤其是如果患者吞咽牙膏或另一種潔牙劑或口腔衛生產品，例如對于小孩經常是這樣的情況。還可能產生的問題是一些區域的飲用水中具有相當高含量的氟化物。
本專利申請的目的是提出一種固有的乳蛋白-骨橋蛋白加入牙用制劑中來控制或抑制細菌在牙齒表面上生長并由此防止或減少菌斑形成和齲齒的用途。
存在兩個專利描述了奶蛋白部分，即，酪蛋白的水解產物、Ca磷酸肽/CPP和來自奶的酶凝的葡糖巨肽/GMP用于釉質損害的修復的用途，假設它們起供給釉質無定形磷酸鈣的作用。
-WO 03/059304提出了口腔護理組合物，含有氟化物離子源和CPP部分。該制劑穩定了以無定形形式加入口腔制劑中的磷酸鈣，同時穩定了制劑中的氟化物含量。
-WO 00/07454描述了GMP，加入特殊的基于奶的食品制劑中，對大鼠具有防齲齒作用。
與CPP和GMP肽相比，OPN在口腔中引入新的維數(dimension)，通過其潛力在生物活性上影響了口腔微生物在釉質上的附著，并因此影響了齲齒的形成。和CPP和GMP一樣，OPN也具有對唾液中可獲得的用于牙齒修復的無定形磷酸鈣含量的影響。
因此OPN在牙齒護理方面具有幾個功能。
在例如牙膏和漱口水中使用OPN的巨大優勢是，它是牛奶中的天然蛋白質成分并因此只需要有限的臨床測試。

發明內容
現在令人驚訝地顯示口腔制劑中所用的骨橋蛋白減少了細菌在釉質表面上的附著和生長。
本發明關于含有骨橋蛋白的口腔組合物，包括牙膏、漱口水和口香糖以及相關的組合物。
發明詳述體外研究中，使用精細拋光的羥磷灰石(HA)圓盤的牙齒類似物，浸入OPN的稀釋溶液中，在HA表面上形成了OPN的薄膜，用水不能洗掉。當使這樣處理的圓盤接觸人唾液時，令人驚訝地，我們發現OPN膜顯著減少了細菌在類似牙齒表面上的附著和生長，使得顯著降低了菌斑的形成。使用來自一群不同年齡和口腔菌叢患者的唾液樣品進行該試驗。這些結果暗示了OPN在口腔制劑如牙膏和漱口水中的潛在用途，而且還可以作為口香糖的配料。
因此，本發明涉及骨橋蛋白減少牙釉質上菌斑細菌生長的用途和含有骨橋蛋白的牙用制劑。
如在此所用的術語“骨橋蛋白”或“OPN”意思是從奶中獲得的骨橋蛋白，包括天然產生的片段或通過奶中蛋白酶剪切源自OPN的肽，或如從WO 01/49741中所述方法可獲得的基因剪接-、磷酸化-、或糖基化變體。奶可以是任何產奶動物的奶，如奶牛、駱駝、山羊、綿羊、單峰駱駝和美洲駝。然而，由于可獲得性，優選來自牛奶的OPN。所有含量基于天然牛奶OPN，但可以容易地校正為其活性部分或另一來源的OPN的相應含量。也可以用遺傳學方法制得OPN或其衍生物。
牙用制劑可以是任何潔齒劑或口腔衛生關聯的相關產品，如牙粉、牙膠、牙用漱口水、口腔噴霧劑和口香糖。骨橋蛋白(OPN)是酸性的、高度磷酸化的、富含唾液酸的、鈣結合蛋白。每摩爾OPN結合28摩爾磷酸鹽和約50摩爾Ca。等電點約3.0。蛋白質存在于身體的許多組織中并起信號和調節蛋白的作用。它是生物礦化過程中的活性蛋白。通過多種細胞類型包括骨細胞、平滑肌細胞和上皮細胞來表達OPN。
OPN存在于牛奶中。通常濃度為每升20mg。例如從pH4.5的酸乳清通過陰離子色譜可以相對簡單地分離OPN，如專利WO 01/497741A2或WO 02/28413中所述的。可以容易地獲得高達90-95％的純度。
骨橋蛋白的含量通常為每kg牙用制劑約50mg OPN至約1500mg骨橋蛋白。然而，較小含量也具有效果。可以使用較高含量，但是效果不會有實質性的提高。有用的含量是每kg 100-1000mg OPN，優選200-500mg，最優選約350mg。推定較大含量不會獲得更好的結果，因此沒有推薦，因為OPN是相當昂貴的配料。
本發明優選的組合物是已經提及的牙膏、牙膠和牙粉形式。這樣的牙膏和牙膠的組分包括下列的一種或多種牙用磨料(約10％至約50％)、表面活性劑(約0.5％至約10％)、增稠劑(約0.04％至約0.5％)、濕潤劑(約0.1％至約3％)、增香劑(約0.04％至約2％)、甜味劑(0.1％至約3％)、著色劑(約0.01％至約0.5％)和水(2％至45％)。抗齲齒劑含有0.001％至約1％的OPN。抗牙垢劑含有約0.1％至約13％的OPN。
當然，牙粉基本上不含所有的液體組分。
本發明其他的優選組合物是牙用漱口水，包括口腔噴霧劑。這樣的漱口水和口腔噴霧劑的組分通常包括下列的一種或多種水(約45％至約95％)、乙醇(約0％至約25％)、潤濕劑(約0％至約50％)、表面活性劑(約0.01％至約7％)、增香劑(約0.04％至約2％)、甜味劑(約0.1％至約3％)和著色劑(約0.001％至約0.5％)，包括OPN的抗齲齒劑，約0.001％至1％，和抗牙垢劑(約0.1％至約13％)。
第三個方面的應用一般是在各種組成的口香糖制劑中。
具體實施例方式
通過以下的實施例和實驗來進一步說明本發明。
實施例背景該研究的目的是證明兩件事。
OPN以穩定的方式結合于羥磷灰石表面。用水或緩沖液沖洗不能除去薄膜。
OPN影響細菌在牙齒類似表面上的粘附。
該研究中調查研究了OPN體外防止菌斑集結的能力，羥磷灰石(HA)圓盤用作牙釉質的模型。將圓盤浸入OPN溶液中，隨后與唾液一起溫育。在瑞典Malm大學的齒科學系以不同菌斑形成細菌菌株的細菌計數來研究在附著層上的生長。
作為OPN涂覆的HA表面的參照，使用非涂覆的和BSA(牛血清白蛋白)處理的HA圓盤。
如下所述對來自6名捐獻者的充分表征的唾液樣品進行了研究。
材料與方法化學品通過Arla Foods amba制得色譜純度約為95％的骨橋蛋白(OPN)。從Sigma-Aldrich購得牛血清白蛋白(BSA)。從Sigma(St.Louis，MO，USA，L-6026)獲得十二烷基硫酸鈉(SDS)。所有其他化學品是分析級的，且所用的水是Milli-Q質量的。在含有0.01M磷酸鹽和0.05M氯化鈉的pH7的磷酸鹽緩沖液中進行附著層的預處理和吸附實驗。將所有玻璃器皿和移液管等以及緩沖液通過高壓滅菌法滅菌。實驗中所用的蛋白質溶液通過過濾滅菌(截留0.22μm)。
唾液樣品在咀嚼一塊石蠟后收集用于實驗的受刺激唾液。受刺激唾液樣品捐獻者的概要顯示于附錄1中。
在收集前兩小時不允許進食或飲水。
附著層從Swedish Ceramic Institute，Gtebor g購得直徑10mm的羥磷灰石(HA)圓盤。將用于SEM研究的圓盤兩面拋光，使得可以使用超聲波清潔。在開始實驗之前，用溫和的去污劑溶液處理附著層(圓盤)并徹底地在水中漂洗。最后，將它們在乙醇和水中漂洗。在使用前將附著層保存于70％乙醇中，使用時用水沖洗并在氮氣流中干燥。干燥后，將用于橢圓光度法測量中的附著層在低壓殘余氣體中(10-30Pa)等離子體清潔，使用射頻輝光放電裝置(Harrick PDC 3XG，Harrick Scientific Corp.，Ossining，New York)。
細菌膜形成將附著層表面在蛋白溶液中37℃預溫育1小時。然后用緩沖液沖洗附著層并在37℃溫育40小時。在實驗中的預處理和溫育過程中進行攪拌。溫育后，用緩沖液沖洗HA圓盤。
橢圓光度法OPN與唾液蛋白在HA附著層上的相互作用后進行橢圓光度法，其是測量在表面反射時光偏振改變的光學方法(3)。所用的儀器是Rudolph薄膜偏振光橢圓計，436型(Rudolph Research，Fairfield，N.J.)，配備濾光至4015的氙燈，并在Landgren和Jnsson(1993)所述的裝置中操作。為了測定赤裸附著層的橢圓對稱角，Δ和Ψ，確立強度最小的位置。根據吸附時Δ和Ψ的改變，按照McCrackin等(4)計算吸附蛋白膜的厚度和折射率，假定表面為均勻的膜。按照Cuypers等(5)計算吸附質量，Γ(mg/m2)。如這些作者所示的，在低表面覆蓋度時，可以比膜厚度和折射率更精確地測定吸附質量，且在此已經呈現了這個推理。所用的摩爾量和摩爾折射率之間的比率值和微分比容的值各自為4.1g/m l和0.75ml/g。這些值通常用于蛋白質并且之前已經用于許多關于唾液成分吸附的研究中(參考文獻(6，7))。將如以上附著層部分中所述制得的表面放入含有緩沖液的偏振光橢圓計的比色杯中。將比色杯在37℃恒溫，除非另外指出，并用磁攪拌器攪拌溶液。當橢圓對稱角穩定時，將唾液加入至終濃度10％(v/v)。測量吸附1小時，接著用12ml/分鐘的連續的緩沖液流沖洗比色杯5分鐘。然后接著脫附另外的25分鐘。這是薄膜形成的標準程序。為了獲得薄膜粘結性的測量，實驗的特點是最后添加SDS。在標準實驗中，加入17mM的濃度(兩次水中的cmc和大約九次緩沖液中的cmc)，此后加入SDS，然后用緩沖液最終沖洗5分鐘。
微生物學分析的方法培養基用于微生物分離的基礎瓊脂培養基是血液瓊脂(8)、MitisSalivarius瓊脂(MSA，Difco Lab.)、Mitis Salivarius-桿菌肽(MSB)瓊脂(9)、根據Nickerson的假絲酵母選擇性瓊脂(Merck)、Mac Conkey瓊脂(Difco Lab)和葡萄球菌培養基110(Difco Lab)。
唾液樣品的培養程序將唾液樣品運送至常規的VMG II(生存力保存)培養基中，收集24小時內渦旋混合，稀釋并接種于血液、MSA和MSB瓊脂上。將血液瓊脂在厭氧室(氮氣中10％氫氣、10％二氧化碳)中培養4天，MSA瓊脂在5％二氧化碳的大氣中培養2天。借助于立體顯微鏡計數瓊脂平板上菌落形成單位(CFU)的總數。
從圓盤上除去微生物使用1秒鐘10個脈沖，通過在帶有微尖的Sonics Vibracell中的超聲處理除去附著于圓盤上的微生物。通過沒有觀察到微生物的生長證實了通過超聲處理來除去細胞是有效的。
脫附樣品的培養程序將脫附樣品渦旋混合、稀釋并接種到以下的培養基中血液瓊脂、MSA、假絲酵母選擇性瓊脂、Mac Conkey瓊脂和葡萄球菌培養基110。將血液瓊脂在厭氧室(氮氣中10％氫氣、10％二氧化碳)中培養5天，MSA在5％二氧化碳的大氣中培養2天，假絲酵母選擇性瓊脂、MacConkey瓊脂和葡萄球菌培養基110需氧培養2天。借助立體顯微鏡計數瓊脂上CFU的總數。分析MSA上的CFU，特別注意不同菌落類型的形態學、大小和數量。將每個形態類型的代表性菌落的細胞革蘭氏染色并接種于血液瓊脂上用于之后的鑒定。為了將來的表征，將生長于MSA上的分離物保存于-79℃脫脂奶(蒸餾水中10％的脫脂奶粉，w/v；Oxoid Lab.L31，Hampshire，UK)中。
葡萄球菌分離物的鑒定革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的成鏈的球菌被認為是葡萄球菌，且基于之前所述的特征將這些分離物鑒定至種和亞種水平(10)。
結果和討論蛋白質相互作用的研究為了研究OPN和HA以及OPN和唾液之間的相互作用，進行了橢圓光度法研究。

圖1中，顯示了吸附溫度的影響。從該圖中可以看出OPN在HA表面上的吸附幾乎是瞬時發生的。在較高溫度(37℃)吸附較大量的OPN，盡管，在37℃沖洗導致一些脫附至每m21mg的穩定表面負載。為了模擬刷牙的化學效果，將SDS加入比色杯中5分鐘，接著用緩沖液沖洗。該清潔步驟后，在兩個溫度下吸附量不存在顯著差異。
獲得的結果表明OPN提供了穩定的HA圓盤表面覆蓋度，盡管在水沖洗和SDS處理后獲得的膜厚度的減小。
細菌膜形成通過溫和超聲處理脫附的顯示于表1和2中的細菌計數顯示出分別用濃度0.1mg/ml和1mg/ml的OPN溶液處理的HA圓盤對細菌粘附的顯著效果，對于所有的唾液捐獻者以在血液瓊脂和MSA瓊脂平板上的總計數表示。用BSA或唾液處理的HA圓盤在表面上呈現更多的細菌。OPN涂覆圓盤上的微生物總計數比對照圓盤(唾液或BSA涂覆的)上的低10至1000倍。受刺激的唾液樣品呈現高度不同的微生物組成，被認為是唾液微生物菌叢的常見特征。感興趣的發現是移居在OPN涂覆圓盤上的葡萄球菌顯著少于對照圓盤上的。
表1不同預處理后在受刺激唾液中培養的兩面拋光的整個圓盤的細菌分析。厭氧培養的血液瓊脂平板上的總計數(CFU)。

表2不同預處理后在受刺激唾液中培養的兩面拋光的整個圓盤的細菌分析。兼性厭氧培養的Mitis Salivarious瓊脂(MSA)上的總計數。

總結結果顯示OPN預處理的HA圓盤在受刺激的唾液中培養后對細菌數量的明顯影響。在用于浸泡牙齒類似物的所研究的0.1-1mg/ml的OPN溶液中，抗粘附效果看起來幾乎與濃度無關。對于單層覆蓋，需要小量的OPN。
有趣的是注意到與對照圓盤相比較，OPN涂覆的圓盤上葡萄球菌粘附顯著減少。
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權利要求
1.骨橋蛋白用于減少或防止牙釉質上菌斑細菌生長的用途。
2.根據權利要求1的骨橋蛋白的用途，用于減少或預防齲齒。
3.根據權利要求1的骨橋蛋白的用途，用于減少或預防牙石。
4.根據權利要求1的骨橋蛋白的用途，用于減少或預防牙周病。
5.根據權利要求1的骨橋蛋白的用途，用于減少或預防牙齒的脫礦質。
6.含有骨橋蛋白的牙用制劑。
7.根據權利要求6的牙用制劑，呈牙膏、牙粉、牙膠、牙用漱口水、口腔噴霧劑或口香糖的形式存在。
8.根據權利要求7的牙用制劑，每kg制劑含有約5mg的骨橋蛋白至約1500mg的骨橋蛋白。
9.根據權利要求8的牙用制劑，每kg制劑含有約100mg的骨橋蛋白至約1000mg的骨橋蛋白。
10.根據權利要求9的牙用制劑，每kg制劑含有約200mg的骨橋蛋白至約500mg的骨橋蛋白。
11.根據權利要求10的牙用制劑，每kg制劑含有約350mg的骨橋蛋白。
12.骨橋蛋白用于制造治療或預防齲齒、牙石或牙周病的藥物組合物的用途。
13.防止或抑制牙釉質上菌斑細菌生長的方法，其是通過將有效量的骨橋蛋白給藥于口腔中。
14.治療或防止齲齒、牙石或牙周病的方法，其是通過給需要這樣治療的患者口服有效量的骨橋蛋白。
全文摘要
骨橋蛋白用于減少牙釉質上菌斑細菌生長的用途和含有骨橋蛋白的牙用制劑。
文檔編號A61Q11/00GK1889922SQ200480035670
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月1日 優先權日2003年12月1日
發明者H·伯靈, E·S·索蘭森, H·貝特爾森, A·S·約恩森, G·格拉沃霍爾特 申請人:阿爾拉食品公司