重組人鈣調磷酸酶b亞基的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及蛋白領域，特別涉及重組人鈣調磷酸酶B亞基的應用。
【背景技術】
[0002] 鈣調磷酸酶(Calcineurin，CN)是目前所知唯--種依賴Ca2VCaM(鈣調素）的蛋白 磷酸酶，由A，B亞基以1:1的比例組成。A亞基(CNA)是催化亞基，B亞基(CNB)是調節亞基。CN 在免疫激活通路中發揮重要作用，示T細胞活化的關鍵沒。CN作為大分子酶蛋白，易失活，不 穩定，而CNB作為該酶的調節亞基，能促進CNA的活性，且相對分子質量小，性質穩定。由研究 表明CNB能刺激T細胞和NK細胞增殖以及增強NK細胞的殺傷活性，增強巨噬細胞吞噬能力等 免疫功能，且重組人1丐調磷酸酶B亞基（Recombinant human Calcineurin B subunit, rhCNB)是開發中的基因工程創新腫瘤藥物。
[0003] 但目前未見rhCNB對肝癌細胞Bel-7402殺傷或抑制作用的相關報道。

【發明內容】

[0004] 有鑒于此，本發明提供重組人鈣調磷酸酶B亞基的應用。本發明采用IVI S Kinetics小動物活體成像系統，研究注射用rhCNB對BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞Bel-7402 原位癌的治療作用，進一步考察受試物注射用rhCNB對特定類型腫瘤細胞的殺傷和(或)抑 制作用，探索受試物產生藥效作用的時效和量效關系，為藥物的有效性和其它毒理學相關 試驗提供依據。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0006] 本發明提供了rhCNB在制備殺傷和/或抑制肝癌細胞Bel-7402的藥物中的應用。 [0007]在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備殺傷和/或抑制肝癌細胞Bel-7402 的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥劑量為不少于I Omg/kg。
[0008] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備殺傷和/或抑制肝癌細胞Bel-7402 的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥劑量為I Omg/kg~160mg/kg。
[0009] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備殺傷和/或抑制肝癌細胞Bel-7402 的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥濃度為0.5mg/mL~2mg/mL。
[0010]在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備殺傷和/或抑制肝癌細胞Bel-7402 的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥方式為靜脈注射給藥;每日給藥1次，連續給藥15日或 者首次給藥劑量為l〇mg/kg，每3日提高1倍劑量遞增給藥，依次為I Omg/kg、20mg/kg、40mg/ kg、80mg/kg、160mg/kg。
[0011] 本發明還提供了rhCNB在制備治療BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞Bel-7402原位癌移 植瘤的藥物中的應用。
[0012] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備治療BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞 Bel-7402原位癌移植瘤的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥劑量為不少于10mg/kg。
[0013] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備治療BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞 Bel-7402原位癌移植瘤的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥劑量為lOmg/kg~160mg/kg。
[0014] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備治療BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞 Bel-7402原位癌移植瘤的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥濃度為0.5mg/mL~2mg/mL。
[0015] 在本發明的一些具體實施方案中，rhCNB在制備治療BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞 Bel-7402原位癌移植瘤的藥物中的應用中所述rhCNB的給藥方式為靜脈注射給藥;每日給 藥1次，連續給藥15日或者首次給藥劑量為10mg/kg，每3日提高1倍劑量遞增給藥，依次為 IOmg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg。
[0016] 在實驗期間，除陽性對照注射用順鉑高劑量給藥組動物以外，其余動物的一般癥 狀觀察和體重與溶媒對照組比較無明顯差異。連續給藥6~15次過程中，注射用rhCNB各劑 量給藥對腫瘤細胞增殖的控制與溶媒對照組比較均具有不同程度的統計學意義。
[0017]停止給藥后第7日檢測結果顯示：與溶媒對照組比較，G給藥組對腫瘤細胞增殖的 控制均具有顯著統計學意義，？〈〇.〇1，〇24給藥組具有統計學意義，？〈0.05。
[0018] 連續給藥6次后，注射用rhCNB 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg劑量給藥組對人肝癌細 胞Bel-7402實體瘤的生長均具有較好的抑制作用。在此后的給藥過程中檢測結果顯示，高、 中和遞增劑量組效果優于低劑量給藥組，治療效果與注射用重組人白介素-2、羥喜樹堿陽 性對照相當。末次給藥后d7檢測結果表明，高劑量組對腫瘤細胞增殖的控制效果最佳(p 〈0.01)，優于其它劑量組和陽性對照組，羥喜樹堿給藥組和遞增劑量組對腫瘤細胞增殖的 控制效果相當(P〈 0.05)。
【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0020] 圖1示實驗各組腫瘤生物發光檢測數據(f);其中橫坐標"1~7"分別表示"給藥 前、首次給藥后(13、(16、(19、(112、(115和末次給藥后恢復期(17"；"6-注射用^^_高劑量組 (40mg/kg)" "Z-注射用rhCNB中劑量組（20mg/kg)"、"D-注射用rhCNB低劑量組（IOmg/ kg)"、DZ-注射用rhCNB劑量遞增組（10mg/kg420mg/kg440mg/kg480mg/kg4l60mg/kg， 10mg/kg為初始劑量，連續給藥3d提高一個劑量，以此類推)"；縱坐標為生物發光檢測強度； [0021 ]圖2示活體成像圖；
[0022]圖3示實驗組剖檢圖；
[0023]圖4示陽性對照組剖檢圖。
【具體實施方式】
[0024]本發明公開了重組人鈣調磷酸酶B亞基的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內 容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員 來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施 例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和 應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0025]本發明依據"細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則"和"抗腫瘤藥物藥效 學指導原則"，采用IVIS Kinetics小動物活體成像系統，動態分析注射用rhCNB對BALB/c裸 小鼠荷人肝癌細胞Bel-7402原位癌的治療作用。首先建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌細胞Bel-7402 皮下移植瘤模型 ，然后建立 BALB/c 裸小鼠 荷人肝癌細胞 Bel-7402 原位移植瘤模型 。取 建模成功的裸小鼠90只，按生物發光數值平均分為9個給藥組，包括:注射用rhCNB高劑量組 (給藥劑量為40mg/kg，給藥濃度為2mg/mL)、注射用rhCNB中劑量組(給藥劑量為20mg/kg，給 藥濃度為lmg/mL)、注射用rhCNB低劑量組(給藥劑量為10mg/kg，給藥濃度為0.5mg/mL)、注 射用rhCNB劑量遞增組（首次給藥劑量為10mg/kg，每3日提高1倍劑量，依次為10mg/kg、 20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg)、陽性對照注射用重組人白介素-2給藥組(給藥劑量 為16.4萬IU/kg，給藥濃度為8200IU/mL)、陽性對照注射用順鉑高劑量給藥組(5mg/kg，給藥 濃度為〇. 25mg/mL)、陽性對照注射用順鉑低劑量給藥組（lmg/kg，給藥濃度為0.05mg/mL)、 陽性對照注射用羥喜樹堿給藥組(2mg/kg，給藥濃度為0.1mg/mL)和溶媒對照組。實驗各組 每日給藥1次，除陽性對照注射用順鉑高劑量給藥組連續給藥5日外，其余各組連續給藥15 日。每次給藥前和給藥后對動物進行一般癥狀觀察。首次給藥前（當日）、首次給藥后每隔3 日和末次給藥后第7日分別用Caliper IVIS Kinetics小動物活體成像系統檢測1次，每次 檢測前對動物體重進行稱量。末次檢測結束后處死動物，大體剖檢，取出腫瘤接種器官(包 括腫瘤組織），進行病理檢查和細胞凋亡的免疫組化檢測。
[0026]結果在實驗期間，除陽性對照注射用順鉑高劑量給藥組動物以外