長牡蠣CgNatterin-3重組蛋白的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種長牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3重組蛋白的應 用。
【背景技術】：
[0002] 無脊椎動物缺乏適應性免疫系統(adaptive immunity)，因此僅能依靠固有免疫 (innate immunity)抵御病原入侵。固有免疫主要通過抗菌肽/蛋白和吞作用殺傷并清除 病原物，其中對病原物的識別是誘發免疫反應的關鍵步驟。病原在入侵宿主過程中，伴隨其 感染和復制，會產生一系列保守組分，稱為病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，這些PAMPs能夠被宿主免疫細胞表面的模式識別受體 (pattern recognition receptors，PRRs)有效識別，進而誘導一系列的免疫級聯反應。目 前，無脊椎動物中已發現了十余類識別受體，如肽聚糖識別蛋白（PGRP)和Toll樣受體等，它 們通過結合不同的病原相關分子模式完成對各種病原微生物的識別，在誘導細胞因子和炎 癥的產生、抗菌肽的表達、激活酚氧化酶級聯反應和吞噬作用等一系列固有免疫應答中發 揮重要作用。
[0003] 模式識別受體(PRRs)是一類主要表達于固有免疫細胞表面、可識別一種或多種 PAMPs的識別分子。PRRs是固有免疫中感知病原入侵的"前哨"，由數量有限的胚系基因編 碼，進化上十分保守，也表明此類受體對生物體的生存極為重要。其與病原生物表面的病原 相關分子模式(PAMPs)的相互識別和作用是啟動固有免疫應答的關鍵。和適應性免疫中淋 巴細胞受體相比較，PRRs有四個特點：（1)全部由胚系基因編碼；（2)組成性地表達；（3)引起 快速免疫應答；（4)能夠識別各種病原體。模式識別受體的研究一直是近年來免疫學研究的 前沿熱點領域，因此對PRRs分子的發掘和利用有助于我們明確牡蠣免疫系統識別病原物的 機制，揭示牡蠣免疫系統誘發和清除病原物的規律，最終為牡蠣病害防治、藥物研發和良種 選育提供理論基礎。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種長牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3重組蛋白的應用。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用技術方案為：
[0006] 一種長牡^CgNatterin_3基因重組蛋白的應用，所述重組蛋白CgNatterin_3在作 為病原菌識別制劑中的應用。
[0007] 所述長牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的應用，所述長牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3重組蛋 白具有病原相關分子模式結合活性和病原菌識別及凝集活性，可用于開發病原菌識別制 劑。
[0008] 所述長牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的制備：
[0009] (1)以長牡蠣CgNatterin-3編碼區為模板，采用Ρ1和Ρ2引物進行PCR擴增，待用；
[0010] 所述引物？1和?2分別為卩1:5'-厶丁66〇厶6厶6丁666丁厶1'(：-3' ；
[0011] P2:5 '-CTAAATGACTTTATACAG-3 '；
[0012] (2)PCR擴增產物與將pEASY-El載體通過T4連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子；
[0013] (3)將上述構建載體轉入Transetta(DE3)表達菌株中進行誘導培養，而后純化，即 得到CgNatterin-3的重組蛋白。
[0014] 本發明所具有的優點：
[0015] 本發明中的長牡蠣CgNatterin-3為新型模式識別受體，其重組蛋白具有病原相關 分子模式結合活性和病原菌識別及凝集活性。對長牡蠣CgNatterin-3蛋白的研究，有利于 深入揭示長牡蠣固有免疫作用機制，充分挖掘和利用海洋來源基因資源，為海洋經濟養殖 動物的病害防治提供重要物質基礎和理論支持。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明實施例提供的長牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白對病原相關分子模 式具有較強結合活性圖。
[0017] 圖2為本發明實施例提供的長牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白具有結合和凝集細 菌及真菌的活性圖。
【具體實施方式】：
[0018] 下面的實驗例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。
[0019] 本發明利用體外重組表達技術獲得了長牡·〇8Να??θ；Γ；?η-3重組蛋白（Genbank號 為:EKC36293.1)，公開了所述長牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的病原相關分子模式結合 活性、病原菌識別及凝集活性。利用本發明獲得的重組蛋白可用于開發病原菌識別制劑。 [00 20] 實施例1:長牡基因編碼區的體外原核重組表達，包括下列步驟： [0021 ] 1、重組載體的構建
[0022]本發明中采用的重組表達載體為北京全式金公司的PEASY-E1原核表達載體。通過 PCR技術，使用基因特異性引物PI ( 5 ' - ATGGCAGAGTGGGTATC-3 '）和P2 ( 5 ' -CTAAATGACTTTATACAG-3 '）。擴增長牡蠣CgNatterin-3基因的編碼區片段。反應條件為:首先 94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環:94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進 行32個循環，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產物純化回收，與pEASY-El載體連接。轉化后菌落 PCR篩選并測序，提取陽性克隆質粒，完成載體的構建。
[0023] 2、重組蛋白的表達
[0024] 以Transetta(DE3)為重組表達宿主菌株，將上述構建的重組載體轉化到表達宿主 菌株中，挑取單克隆，提取質粒，測序驗證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于5mL LB液體培養 基中，37°C震蕩搖床中培養12~16小時，然后以l:100(v/v)的比例接種200mL LB液體培養 基中，37°C培養至0D600:0.5~0.7。加入IPTG，使終濃度達到0.5mM mL-1，16°C繼續培養20小 時。4°C，6000rpm，離心10min，收集菌體，于-20°C凍存備用。取lmL菌液離心，棄去上清后，加 入80yL水和20yL 5 X蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮沸10分鐘，SDS-PAGE檢測表達產物。 [0025] 3、重組蛋白的純化
[0026]將上述所得大腸桿菌總蛋白采用甘露糖親和層析柱純化獲得重組蛋白，并透析除 鹽。
[0027] 具體操作步驟如下：
[0028] 甘露糖親和層析柱純化獲得重組蛋白
[0029] (1)甘露糖親和層析柱，1 X 10cm，柱床體積為7mL;
[0030] (2)用TBS緩沖液（20mM Tris-base，150mM NaCl，pH 7.2)，平衡3~5個床體積，流 速為lmL min-S
[0031 ] (3)將菌體重懸于了85緩沖液（2〇111]\11^8^^86，15〇111]\1他(：14!17.2)中，超聲破 碎，并用〇. 45μπι濾膜過濾細胞裂解液，上樣，流速為lmL mirT1;
[0032] (4)TBS緩沖液l(20mM Tris-base，150mM NaCl，pH 7.2)洗 10個床體積，流速為lmL min-1;
[0033] (5)TBS緩沖液2(20mM Tris-base，150mM NaCl，200mM甘露糖，pH 7.2)洗脫，流速 為lmL mirT1，收集洗脫液，SDS-PAGE分離蛋白并進行考馬斯亮藍染色，檢測融合蛋白的純化 效果。
[0034] (6)將純化蛋白加入透析袋(3kDa孔徑）中，置于雙蒸水中透析，每次透析4小時或 過夜，共透析4次，即得到長牡蠣CgNatter in-3基因重組蛋白。
[0035]實施例2:長牡蠣CgNatterin-3原核重組蛋白的病原相關分子模式結合活性分析 [0036]長牡蠣CgNatterin-3結合病原相關分子模式的酶聯免疫吸附實驗(ELISA):將病 原相關分子模式脂多糖，肽聚糖，甘露聚糖和β-l，3-葡聚糖分別包被至96孔板(20yg/孔），4 °C過夜，后加入3%BSA于室溫封閉1小時。將CgNatterin-3蛋白溶于PBS緩沖液中，向每孔加 入不同濃度重組CgNatterin-3蛋白（10 · 00，5 · 00，2 · 50，1 · 25，0 · 63，0 · 32和0 · 16μΜ)，室溫孵 育1小時。PBSTUBS，0.1 % Tween-20)洗3次，加入大鼠來源的能夠識別CgNatterin-3蛋白的 抗體進行孵育，室溫1小時，PBST(roS，0.1 %TWeen-20)洗3次，后用辣根過氧化物酶標記二 抗進行孵育，室溫1小時，PBST洗3次。加入辣根過氧化物酶底物進行反應，15分鐘后，加入2M 濃硫酸終止反應，酶標儀檢測每孔反應液在450nm處吸光值(參見圖1)。
[0037]結果如圖1所示，酶聯免疫吸附實驗表明，CgNatterin-3對脂多糖、肽聚糖、甘露聚 糖和β-1，3-葡聚糖具有較高的結合活性。其中A是CgNatterin-3與脂多糖結合解離常數1.2 X 10-6M;B是CgNatterin-3與肽聚糖結合解離常數2.1 X 10-7M;C是CgNatterin-3與甘露聚 糖結合解離常數4.5 X 1(T8M;D是CgNatterin-3與β-l，3-葡聚糖結合解離常數1.6 X 10-7Μ。 [0038]實施例3:長牡^CgNatterin-3結合和凝集細菌及真菌的活性分析
[0039] 將培養的燦爛弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，耶羅維亞酵母和 畢赤酵母進行離心收集，4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗滌菌體3次，并將菌體重懸于含有 FITC(終濃度0. lmg mL-〇的0.01M NaHC03溶液中，避光孵育1小時。PBS洗滌3次，然后將菌重 懸于PBS中。CgNatterin-3與不同菌體分別室溫孵育1小時。PBS洗滌3次，加入大鼠來源的能 夠識別CgNatterin-3蛋白的抗體，室溫孵育1小時。PBS洗滌3次，加入綠色熒光標記二抗，室 溫孵育1小時。PBS洗滌3次，分別用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測CgNatterin-3對不同菌的 凝集和結合效果(參見圖2)。
[0040] 結果如圖2顯示，CgNatterin-3能夠顯著性結合并凝集燦爛弧菌、大腸桿菌、金黃 色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，耶羅維亞酵母和畢赤酵母。其中，A表示CgNatterin-3能夠凝集 革蘭氏陰性菌燦爛弧菌、大腸桿菌，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，真菌耶 羅維亞酵母和畢赤酵母。B表示CgNatterin-3能夠結合革蘭氏陰性菌燦爛弧菌、大腸桿菌，
【主權項】
1. 一種長牡·〇8ΝΒ??θ；Γ；?η-3基因重組蛋白的應用，其特征在于：所述重組蛋白 CgNa 11 er i η-3在作為病原菌識別制劑中的應用。2. 按權利要求1所述的長牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的應用，其特征在于:所述長 牡·〇8Να??θ；τ;?η-3基因重組蛋白的制備： (1)以長牡蠣CgNatterin-3編碼區為模板，采用Ρ1和Ρ2引物進行PCR擴增，待用； 所述引物P1 和P2分別為PI:5'-ATGGCAGAGTGGGTATC-3' ； P2:5 '-CTAAATGACTTTATACAG-3 '； (2 )PCR擴增產物與將pEASY-El載體通過T4連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子； (3)將上述構建載體轉入TranSetta(DE3)表達菌株中進行誘導培養，而后純化，即得到 CgNatterin-3的重組蛋白。
【專利摘要】本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種長牡蠣CgNatterin-3重組蛋白的應用。本發明利用體外重組表達技術獲得了長牡蠣CgNatterin-3重組蛋白，公開了所述長牡蠣CgNatterin-3基因重組蛋白的病原相關分子模式結合活性、病原菌識別及凝集活性。利用本發明獲得的重組蛋白可用于開發病原菌識別制劑。
【IPC分類】G01N33/569, C12N15/70, G01N33/68
【公開號】CN105510598
【申請號】CN201511025559
【發明人】王玲玲, 姜帥, 黃萌萌, 宋小瑞, 賈志浩, 宋林生
【申請人】中國科學院海洋研究所
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月31日