預防乳腺癌復發的疫苗的制作方法
【專利說明】預防乳腺癌復發的疫苗
[0001 ]本申請為2009年12月9日提交的、發明名稱為"預防乳腺癌復發的疫苗"的PCT申請 ?0'/1^2009/067264的分案申請，所述?(：1'申請進入中國國家階段的日期為2011年6月10日， 申請號為 200980149494.7。
[0002] 序列表
[0003] 本申請包含通過EFS-Web遞交且通過參考以其整體并入本文的序列表。所述于 2009年12月7日生成的ASCII拷貝被命名為HMJ106PCT. txt，并且其大小為11，473bytes。
[0004] 政府權益
[0005] 本發明部分由政府資助完成。政府對本發明具有一定的權利。
[0006] 相關申請的交叉引用
[0007] 本申請主張2008年12月10日遞交的美國臨時專利申請號61/121,220的權益，其全 部公開內容在此通過引用作為參考。
[0008] 背景
[0009] 乳腺癌(BCa)是女性最常見的癌癥診斷并且是女性中與癌癥相關死亡的第二主導 因素 （Ries LAG等人（編）SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003,National Cancer Institute，BetheSda，MD)。過去20年間在乳腺癌治療中的主要進展使得無疾病生存(DFS) 率顯著提高。例如，已經將利用對腫瘤相關抗原有反應性的抗體療法用于阻斷特定的細胞 過程以減緩疾病進展或者預防疾病復發。盡管近來在乳腺癌治療上有所進展，但是相當數 量的患者最終將死于復發疾病。疫苗由于易于給藥，以及因為他們在感染性疾病中觀察到 的高成功率而是預防、減緩或者抑制復發疾病的發展的引人注意的模型。構建癌癥疫苗的 基本原理在理論上是直接的。然而實踐中，有效的實體瘤癌癥疫苗的開發僅存有限的成功。 例如，一個嘗試給予針對轉移性黑色素瘤的肽疫苗的小組僅觀察到2.6%的客觀反應率 (objective response)(Rosenberg SA 等人，（2004)Nat.Med.l0:909-15)〇
[0010] 對于這一低成功率存在許多可能的解釋（Campoli M等人，（2005)Cancer Treat. Res. 123:61-88)。例如，即使抗原與特定類型的腫瘤細胞特異性結合，但該腫瘤細胞 可以僅表達低水平的抗原，或者它可以位于隱蔽位點或者屏蔽免疫檢測。此外，在腫瘤生長 時，它們經常通過使抗原脫落而改變它們的抗原譜。同樣影響該低成功率的事實是腫瘤細 胞可以表達非常低水平產生免疫應答所需的MHC蛋白以及其它的共刺激蛋白。
[0011] 在晚期癌癥患者中存在其它面臨針對腫瘤接種疫苗嘗試的問題。此種患者趨于具 有較大的原發和轉移性腫瘤，并且腫瘤內部的細胞由于血流量差而可能不易接近。這與疫 苗策略趨于對惡性血液病治療更成功的觀察相一致(Radford KJ等人，（2005)Pathology 37:534-50;以及Molldrem JJ(2006)Biol.Bone Marrow Transplant.l2:13_8)。此外，當腫 瘤變成轉移性的，它們可以產生將免疫抑制因子釋放到它們的微環境中的能力(Campoli， 2005;以及Kortylewski M等人，（2005)Nature Med· 11:1314-21)。轉移性腫瘤也已經與外 周血淋巴細胞的數量減少以及樹突細胞功能障礙相關聯(Gillanders TC等人，（2006) Breast Diseases:A Year Book and Quarterly 17:26-8)。
[0012] 雖然這些因素中的一些或全部可以造成難于開發有效的預防性或治療性疫苗，但 是主要的潛在挑戰是多數腫瘤抗原是自體抗原或者與自體抗原具有高度的同源性，并且因 此認為其從屬于嚴格的免疫耐受中。因此很明顯，許多基于肽的癌癥疫苗(具有或沒有免疫 刺激輔助物）由于低免疫原性以及缺乏特異性而在臨床實踐上可能注定僅有有限的成功。
[0013] 在動物實驗和乳腺癌患者的臨床檢測中，基于單抗原的原型乳腺癌疫苗已經略有 小成地誘導了可測量的免疫應答。然而，所觀察到的免疫應答沒有轉化成對于通過標準療 法(例如，手術、放射性療法和化療)所緩解的疾病復發的臨床上顯著的保護性免疫。
[0014] HER2/neu是許多上皮惡性腫瘤中表達的原癌基因 （Slamon DJ等人，（1989) Science 244:707-12) AEI^/neu是表皮生長因子受體家族的成員并且編碼參與調節細胞 生長及繁殖的185kd酪氨酸激酶受體(Popescu NC等人（1989)Genomics 4:362-366;Yarden Y等人(2001)Nat Rev Mol Cell Bio 2:127-137·)。在25-30%的浸潤性乳腺癌(BCa)中發 現了 HER2/neu的過表達和/或擴增并且這與更具攻擊性的腫瘤以及更差的臨床結果相關 聯。（Slamon DJ等人Science( 1987)235:177-182;Slamon DJ等人Science( 1989)244:707-12;Toikkanen S等人J Clin0ncol(1992)10:1044-1048;Pritchard KI等人（2006) N.Engl.J.Med.354:2103-11.)
[0015] 主要通過免疫組織化學（IHC)和熒光原位雜交(FISH)兩種檢測來進行HER2/neu狀 態的確定。IHC檢測HER2/neu蛋白的過表達并且以0至3+(0 =陰性，Γ =低表達，2+=中度，和 3+ =過表達）的半定量標度來報告。另一方面FISH檢測HER2/neu基因的擴增(過量拷貝）并 且以HER2/neu基因拷貝數與17號染色體基因拷貝數的比來表示，如果FISH 2 2.0個拷貝，那 么解釋為"過表達"。（Hicks DG等人Hum Pathol(2005)36:250-261.)IHC和FISH的一致率約 90%。（Jacobs等人J Clin Oncol(1999) 17:1533-1541.)將FISH認為是金標準，因為回顧性 分析揭示了它是曲妥珠單抗(Tz)應答的較佳預測；它是更加客觀且可再現的。（Press MF等 人J Clin 0ncol(2002)14:3095-3105;Bartlett J等人J Pathol(2003)199:411-417; Wolff AC等人J Clin 0ncol(2007)25:118-145.)
[0016] 對HER2/neu作為原癌基因的鑒定和量化帶來了基于體液或抗體的被動免疫治療， 包括曲妥珠單抗（H.erc.ejJ.tiW^Genentech Inc. ,South San Francisco,CA)的使用。曲妥 珠單抗是結合HER2/neu蛋白的胞外近膜結構域的重組人化單克隆抗體。（Plosker GL等人 Drugs (2006)66:449-475 ·)對HER2/neu過表達（IHC 3+或者FISH 2 2 · 0)、結陽性(NP)以及轉 移性BCa患者指示使用Tz(Vogel CL等人J Clin 0ncol(2002)20:719-726;Piccart-Gebhart MJ等人N Engl J Med(2005)353:1659-1672)且其在具有低至中度HER2/neu表達 的患者中顯示出非常有限的活性。CHerceptinI (曲妥珠單抗），prescription product insert，Genentech Inc，South San Francisco,CA:2000年9月修訂·）
[0017] 研究的另一種免疫治療形式是靶向對于諸如HER2/neu的腫瘤相關抗原上的表位 的細胞免疫應答的接種疫苗和主動免疫治療。HER2/neu是若干可以刺激免疫系統以識別并 殺死表達HER2/neu的癌細胞的免疫原性肽的來源。（Fisk B等人J Exp Med( 1995) 181: 2109-2117.)兩種此類太被命名為E75和GP2A75和GP2都是9氨基酸肽，它們是人白細胞抗 原（HLA)-A2-限制的并且刺激CTL識別和裂解表達HER2/neu的癌細胞(Fisk B等人J Exp Med(1995)181:2109-2117;Peoples GE等人Proc Natl Acad Sci USA(1995)92:432-436)〇
[0018] E75衍生自HER2/neu蛋白質的胞外結構域，并且對應于HER2/neu氨基酸序列的氨 基酸369-377(KIFGSLAFL)(SEQIDN0:3)，其在美國專利No.6,514,942中表示為SEQID NO: 11，所述專利以其整體通過參考并入本文。全長HER2/neu蛋白質序列如下所示，并且在 美國專利No.5,869,445中表示為SEQ ID NO:2,所述專利以其整體通過參考并入本文：
[0019] MKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFL
[0020] QDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGA
[0021 ] SPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILffKDIFHKNNQLALTLIDTNRSR
[0022] ACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPK
[0023] HSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFFSMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLST
[0024] DVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEF
[0025] AGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDL
[0026] SVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTV
[0027] PWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQ
[0028] ECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFC
[0029] VarcpsgvkpdlsympiiWkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqraspltsi
[0030] ISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQM [0031 ] RILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIffIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDE
[0032] AYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQ
[0033] IAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPI
[0034] KffMALESILRRRFTHQSDVffSYGVTVffELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQP
[0035] PICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDS
[0036] TFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLT
[0037] LGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTV
[0038] PLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPG
[0039] KNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPP
[0040] STFKGTPTAENPEYLGLDVPV(SEQ ID NO：I)
[00411嘗試了利用E75作為抗癌疫苗，例如，在過量表達HER2/neu蛋白質的患有晚期癌癥 患者中作為與不同免疫佐劑組合的單肽疫苗(Zaks TZ等人，（1998)Cance