碳氟連接的肽制劑的制作方法
【專利說明】碳氣連接的化制劑
[000。本申請是申請日為2011年12月30日，申請號為201180067838. 7,發明名稱為"碳 氣連接的膚制劑"的發明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明設及包含碳氣連接的膚的可藥用制劑、用于制備運類可藥用制劑的制劑、 制備運類制劑的方法W及運類制劑作為疫苗和免疫治療劑的用途。
【背景技術】
[0003] 將合成膚抗原用于疫苗W預防感染性疾病（例如病毒感染、細菌感染、寄生蟲感 染和真菌感染）受到關注。合成膚抗原在免疫治療劑領域一一包括治療感染、刺激對癌細 胞的免疫、下調多膚激素W及控制不恰當的免疫應答例如過敏反應和變態反應一一也受到 關注。
[0004] 實際使用基于膚的疫苗和免疫治療中的一個難點是確保通過有效地遞送膚抗原 至抗原呈遞細胞而誘導免疫應答。如果沒有運種祀向作用，則可能需要難W實施的量的膚， 運不僅在制造上是不經濟的而且也會導致毒性問題。
[0005] 膚遞送的增強可通過專口的遞送載體來實現，例如能夠持續釋放的基于微粒的結 構。另外，已經開發了包含共價連接到遞送增強劑的目的膚的膚衍生物或修飾膚，W改進生 物利用度及呈遞所述膚至特定祀細胞和受體。
[0006] 通過將碳氣鏈共價連接至膚N末端或C末端，或兩者之間的任何位置W產生碳氣 連接的膚（FCP)而構建了被修飾W改善至抗原呈遞細胞的遞送的一類具體膚。碳氣連接的 膚的實例在W02005/099752和W02009/027688中給出，其中提供了在增強對所述膚的免疫 應答中由碳氣連接賦予的優點。
[0007] 疫苗設計者會理解，可能需要多于一種膚W提供更寬的預防或免疫治療效果。運 類多組分產品是合乎需要的，因為它們很可能更有效地激發恰當的免疫應答。
[000引為了制造該性質的藥劑，必須合成、純化、從險當的比例混合所述碳氣連接的膚， 使其無菌并W適于給藥的同質形式提供。

【發明內容】

[0009] 本發明人已發現，碳氣連接的膚經常難溶于水性介質，例如水或憐酸鹽緩沖鹽水， 即使當未連接的膚可溶于水性介質時也如此。他們還發現，碳氣連接的膚中膚組分的長度 和疏水性影響所述碳氣連接的膚的溶解性。尤其地，已發現連接到顯示出更好免疫遺傳性 質的更長、疏水性更強的膚的碳氣載體是尤其不溶的。
[0010] 碳氣連接的膚是雙親性的，并特征性地在極性（質子和非質子）溶劑和非極性溶 劑中形成多分子微團型結構。天然未連接的膚通常不形成運類結構。但是，本發明人已發 現，許多碳氣連接的膚，尤其是具有最佳免疫原性性質的那些，在水性介質和其他溶劑中傾 向于形成大的可見聚集體。運類聚集體的形成在需要產生同質的、可表征的制劑的藥物制 造過程中是不可接受的。
[0011] 已經認識到了該問題，本發明人已經將其解決并設計了一種制備碳氣連接的膚制 劑的方法，其中維持了支持所述碳氣連接的膚的溶解性的超分子結構。發明人開發的配制 方法使得有可能制造包含W前被發現難W配制的免疫原性的碳氣連接的膚的穩定產品，所 述產品可用水性介質容易地復原W獲得可藥用溶液。
[0012] 具體地，發明人已發現，使用酸性溶液可促進微團形成并避免不溶性聚集體的形 成。所述溶解的碳氣連接的膚可通過過濾除菌，而不損失溶液中的碳氣連接的膚。在冷凍 干燥之后，通常在冷凍保護劑的存在下，可將碳氣連接的膚W穩定的形式儲存并溶解于水 性介質中W獲得用于給藥的可藥用溶液。
[0013] 發明人已發現，對于寬范圍的碳氣連接的膚，乙酸是尤其適合的溶劑，盡管不同膚 的電荷和疏水性具有高度的可變性。因此，乙酸也尤其適用于溶解碳氣連接的膚的混合物。
[0014] 因此，本發明提供了一種適合用于制備可藥用碳氣連接的膚制劑中的水性酸性制 劑，所述制劑包含第一碳氣連接的膚，其中：
[0015] (i)連接到所述碳氣的膚為長度至少20個氨基酸殘基，包含至少50%的疏水性氨 基酸殘基并且具有大于或等于7的等電點；并且
[0016] (ii)所述碳氣連接的膚W直徑小于0. 22ym的微團存在。
[0017] 優選地，所述制劑包含乙酸。所述水性制劑可具有例如5或小于5的抑。
[0018] 所述制劑可包含存W直徑小于0. 22ym的微團存在的一種或多種另外的碳氣連 接的膚。優選地，所述制劑中存在的至少80%的碳氣連接的膚微團具有小于lOOnm的直徑。
[0019] 在一個實施方案中，本發明的制劑不包含運樣的碳氣連接的膚，即其中連接到所 述碳氣的所述膚：（i)具有小于7的等電點；（ii)在所述碳氣遠端的最后15個連續氨基酸 中不包含帶正電的氨基酸；并且/或者（iii)包含含有多于80%的疏水性氨基酸殘基的20 個氨基酸殘基的連續序列。
[0020] 連接到所述碳氣的所述膚通常是衍生自病原體、自體蛋白或腫瘤細胞的免疫原性 膚。本發明的制劑還可包含可藥用載體或稀釋劑和/或佐劑。
[0021] 本發明還提供了：
[0022] -一種獲得可藥用的碳氣連接的膚制劑的方法，所述方法包含：
[0023] (i)將碳氣連接的膚溶解于乙酸；
[0024] (ii)將所述溶解的碳氣連接的膚過濾除菌；和 [00巧](iii)干燥所述過濾除菌的碳氣連接的膚。
[0026] -一種可通過本發明的方法獲得的碳氣連接的膚制劑；
[0027] --種包含6種碳氣連接的膚的可藥用制劑，其中連接到所述碳氣的膚包含SEQ IDN0:l-6中列出的序列，并且其中所述制劑不包含其他碳氣連接的膚；
[0028] --種本發明的可藥用制劑，用于通過療法來治療人體或動物體的方法中；
[0029] - 一種本發明的可藥用制劑，用于治療或預防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥 的方法中；
[0030] -本發明的可藥用制劑在制造用于治療或預防病原體感染、自身免疫性疾病或癌 癥的藥劑中的用途；W及
[0031] - 一種治療或預防病原體感染、自身免疫性疾病或癌癥的方法，所述方法包含向需 要其的個體給予有效量的本發明的可藥用制劑。
【附圖說明】
[0032] 圖1示出了典型的碳氣連接的膚制造過程流程的實例。
[0033] 圖2示出了備選的碳氣連接的膚制造過程流程。
[0034] 圖3的表示出溶于多種溶劑的各個FCP的目視檢查結果。縱滿后目視檢查每種溶 液的澄清度，對于澄清溶液指定"+++"的得分至對于高度渾濁的溶液指定的得分。還 記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，"+++"表示高水平，表示均不存在。表示 溶液變粘稠。
[0035] 圖4的表示出用甘露醇溶液稀釋后溶于每種溶劑中的各個FCP的目視檢查的結 果。目視檢查每種溶液的澄清度，對于澄清溶液指定"+++"的得分至對于高度渾濁的溶液 指定的得分。還記錄了泡沫形成程度和微粒的存在情況，"+++"表示高水平，表示 均不存在。
[0036] 圖5示出了通過動態光散射值ynamicLi曲tScattering,化巧評估的混合和稀 釋后溶液中碳氣連接的膚的粒度。
[0037] 圖6示出了通過透射電子顯微術（TEM)評估的混合和稀釋后溶液中碳氣連接的膚 顆粒的大小和形狀。
[003引圖7示出了通過DLS評估的在除菌級過濾之前（A)和之后做的碳氣連接的膚顆 粒的W體積表示的大小分布。
[0039] 圖8示出了通過DLS評估的在TrislOmM抑7. 85(A)和水做中復原的碳氣連接 的膚顆粒的W體積表示的大小分布。
[0040] 圖9示出了暴露于50% (v/v)乙酸中24小時的7種碳氣連接的膚的混合物的 RP-HPLC分析的結果。
[0041] 圖10示出了用手搖動后，碳氣連接的膚的經配制混合物和未經配制混合物的照 片。瓶A:經配制的+甘露醇/水；瓶B:經配制的+甘露醇/組氨酸；瓶C:未經配制的+甘 露醇/水；瓶D:未經配制的+甘露醇/組氨酸。
[0042] 圖11示出了縱滿和超聲后的碳氣連接的膚的經配制混合物和未經配制混合物的 照片。瓶A:配制的+甘露醇/水；瓶B:經配制的+甘露醇/組氨酸；瓶C:未經配制的+甘 露醇/水；瓶D:未經配制的+甘露醇/組氨酸。
[0043] 圖12示出了包含6種碳氣連接的流感膚的制劑（FP-01. 1)的透射電子顯微鏡照 片。
[0044] 圖13示出了過濾后的FR01. 1在t。（上圖）和24小時后（下圖）的HPLC譜。
[0045] 圖14示出了在水中復原后FP01. 1的HPLC譜。
[004引圖15示出了在水中復原的經配制的碳氣膚腫01. 1)和未經配制的膚的比較。左 照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0047] 圖16示出了在28mMk組氨酸中復原的經配制的碳氣膚（FP01. 1)與未經配制的 膚的比較。左照片在20分鐘靜置后拍攝，右照片在3分鐘超聲處理后拍攝。
[0048] 圖17示出了大鼠中的體積調整的劑量應答。在測試的所有劑量水平下，FP-01. 1 W劑量依賴的形式誘導了陽性IFN- 丫T細胞應答。
[0049] 圖18示出了使用體外IFN-丫ELISpot測定觀察到的疫苗誘導的T細胞應答。用 6種個體膚（對應于所述疫苗中含有的膚）刺激PBMC18小時。陽性測定響應被定義為陰 性對照孔中斑點數的平均值+所述平均值的2倍標準差。計算了 6種膚的每一個的斑點數 W獲得"長膚的總和"，并表示為每一百萬輸入的PBMC的斑點數。
[0050] 序列說明
[0051] 對應于實施例中使用的膚的序列表如下表所示。
[0052]
[0053]

【具體實施方式】
[0054] 本發明提供了一種配制用于給予人或動物的碳氣連接的膚的方法和可通過本發 明的方法獲得的可藥用的碳氣連接的膚制劑。本發明的方法包含將所述碳氣連接的膚溶于 酸性溶液，優選溶于乙酸的步驟。本發明還提供了水性制劑，所述水性制劑是酸性的并因此 不適用于給予人或動物，但是其對于獲得所述可藥用的制劑是重要的。
[0055] 通常，在配制方法中使用的或者在本發明的水性酸性制劑或可藥用制劑中存在的 至少一種碳氣連接的膚包含至少20個氨基酸殘基的膚，所述膚具有至少50 %的疏水性氨 基酸殘基并具有大于或等于7的等電點。
[0056] 本發明的制劑可包含，或者本發明的配制方法可使用，至少一種碳氣連接的膚，其 中所述膚包含至少約20個氨基酸，其中至少約50%的氨基酸是疏水性的。所述制劑中存在 的其他碳氣連接的膚可W短于20個氨基酸并且/或者可具有少于50 %的疏水性殘基。
[0057] 本發明的制劑可含有包含至少7個氨基酸至最高達約100個氨基酸，例如約9至 約50個氨基酸，優選約15至約45個氨基酸，更優選約20至約40個氨基酸，例如約25至 約38,例如30、31、32、33、34、35、36或37個氨基酸的序列的碳氣連接的膚。
[0058] 本發明的制劑可包含至少一種碳氣連接的膚，其中所述膚中至少50%的氨基酸是 疏水性的。通常，約50%至約80%，例如約70%或約75%的殘基是疏水性的。下限可W為 48%或49%。優選地，所述膚包含約55%至約60%或約65%的疏水性殘基。當所述制劑 包含另外的碳氣連接的膚時，所述另外的碳氣連接的膚可具有少于50%的疏水性。例如， 另外的碳氣連接的膚的膚組分可包含約30%至約70%的疏水性殘基，例如約40%，例如約 45%、50%、55%、60%或65%的疏水性殘基。色氨酸（W)、酪氨酸燈)、異亮氨酸（I)、苯丙 氨酸（巧、亮氨酸化)、鄉氨酸（V)、甲硫氨酸（M)、精氨酸（A)、脯氨酸（P)、甘氨酸（G)和半 脫氨酸（C)為疏水性氨基酸。在一個優選實施方案中，所述制劑中存在的膚都不包含其中 多于80%的殘基為疏水性的具有20或更多個氨基酸殘基的連續序列。
[0059] 所述一種或多種另外的碳氣連接的膚可包含運樣的膚：長度為至少20個氨基酸 殘基；包含至少50 %的疏水性氨基酸殘基；并且/或者具有大于或等于7的等電點。所述 第一碳氣連接的膚和/或一種或多種另外的碳氣連接的膚可包含運樣的膚：在所述碳氣遠 端最后的15個連續氨基酸中包含帶正電的氨基酸；并且/或者不包含含有多于80%疏水 性氨基酸殘基的20個氨基酸殘基的連續序列。
[0060] 在一個實施方案中，本發明制劑中的膚都不具有小于7的等電點，在碳氣遠端的 最后15個連續氨基酸中不包含帶正電的氨基酸，并且/或者包含含有多于80%疏水性氨基 酸殘基的20個氨基酸殘基的連續序列。
[0061] 在本發明的制劑中所述碳氣連接的膚通常W直徑小于0. 22ym的微團存在。所述 微團通常具有約15至約200皿，通常約20皿至約100皿，例如約20皿至約30皿或約30皿 至約50皿的直徑。然而，可存在一些更大的微團。通常，不多于20%，例如約10%至約 15%的聚集體具有大于lOOnm的直徑。優選地，所述碳氣連接的膚微團的至少80%具有小 于100皿的直徑。微團大小可通過任何合適的方法測定，例如通過動態光散射值L巧或使 用透射電子顯微術（TEM)。
[0062] 通過將所述碳氣連接的膚溶于酸性溶液可有助于微團的形成。例如，如本文所述， 可將所述碳氣連接的膚溶于乙酸。用于制備可藥用制劑的本發明的水性制劑可W是酸性 的，具有例如5或更小的抑。
[0063] 本發明的可藥用制劑可W是干燥形式例如凍干形式。本發明的可藥用制劑可W為 水溶液，例如通過將凍干物或其他干燥的制劑溶于水性介質形成的溶液。所述水溶液通常 是抑中性的。
[0064] 在本發明的水性（液體）制劑中，所述溶液通常是澄清的，沒有可見的聚集體。尤 其地，在通過縱滿和超聲處理擾動后，所述溶液中沒有可見微粒。運對所述酸