專利名稱：：凍干的免疫球蛋白制劑和制備方法本申請依據35U.S.C.§119要求2007年6月14日提交的美國臨時申請第60/929,133號和2008年6月12日提交的美國申請序列第12/138,075號的優先權，其完整內容通過引用以其整體明確并入本文。發明領域本發明總體來說涉及免疫球蛋白的藥物制劑領域。具體地，本發明涉及穩定的、凍干的、高濃度免疫球蛋白制劑。本發明舉例說明了重組人源化抗-α-4整聯蛋白抗體那他珠單抗的穩定化的凍干制劑。
背景技術：
：意欲施用于人類的藥物制品可能需要穩定劑以防止藥物在該制品使用之前發生變化。因為蛋白質比傳統有機和無機藥物更大且更復雜(即蛋白質除了擁有復雜三維結構之外還擁有多種官能團)，所以蛋白質的制劑引起了特殊的問題。蛋白質的降解途徑可牽涉化學不穩定性(牽涉通過鍵形成或切割生成新的化學實體而修飾蛋白質的任何過程)或物理不穩定性(蛋白質高級結構的變化)。化學不穩定性可由脫酰胺、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫化物交換造成。物理不穩定性可由例如變性、聚集、沉淀或吸附造成。許多蛋白質制品在非常稀釋或高度濃縮的溶液中尤其不穩定，并且此不穩定性在儲存或運送蛋白質制品時經常增加。因此，蛋白質藥物領域存在的一項主要挑戰是開發兼而保持蛋白質穩定性和活性的制劑。所有抗體包括單克隆抗體在關于其在制劑中的表現和效力方面均彼此不同。例如，單克隆抗體在關于等電點、溶解度和該單克隆抗體聚集的條件方面是彼此不同的。蛋白質在關于其在制劑中的表現和效力方面彼此不同，這使得難以預測制劑是否對特定抗體穩定。蛋白質制劑中的三種常見問題包括蛋白質降解、聚集、脫酰胺和氧化。此外，影響制劑穩定性的許多不同反應可同時發生，使得難以確定哪種反應引起了哪種結果。參見Cleland等人，“TheDevelopmentofStableProteinFormulationsACloseLookatProteinAggregation，Deamidation，andOxidation”(穩定的蛋白質制劑的開發近看蛋白質聚集、脫酰胺和氧化)，CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems，10(4)307-377(1993))。發明概述具體地，本發明涉及穩定的、凍干的、高濃度免疫球蛋白制劑。制備本發明制劑有三個步驟，包括制備水性凍干前制劑、凍干步驟和重建步驟。本發明是針對通過凍干水性制劑制備的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑包含于緩沖劑中的約40mg/ml至約50mg/ml的免疫球蛋白、聚山梨酯和蔗糖。在本發明的一優選實施方案中，水性凍干前制劑包含(a)約30mg/ml至約60mg/ml那他珠單抗；(b)具有約5.5至約6.5的pH的緩沖劑；(c)約20mg/ml至約50mg/ml蔗糖；和(d)約0.02％至約0.08％聚山梨酯。在一更優選實施方案中，水性凍干前(pre-lyopholized)制劑包含(a)約40mg/ml那他珠單抗；約6mM組氨酸，pH約6.0；約41mg/ml蔗糖；和(d)約0.04％聚山梨酯80。凍干的制劑保留免疫球蛋白的穩定性，并防止意欲施用于人類受治療者的免疫球蛋白在最終的產物中形成聚集體和/或顆粒。此凍干的制劑在室溫下穩定至少三個月、優選地6個月和更優選地一年。凍干的制劑還在2-8℃下穩定1年、優選地2年。此凍干的制劑具有小于10分鐘的短重建時間，并且在重建后適于胃腸外施用諸如肌內、皮下、靜脈內或腹膜內注射。凍干的制劑用液體重建為含有約80-160mg/ml免疫球蛋白濃度的澄清溶液。在一優選的實施方案中，重建的制劑包含(i)約80mg/ml至約160mg/ml那他珠單抗；(ii)約18mM組氨酸，pH為約6.0；(iii)約123mg/ml蔗糖；和(iv)約0.12％聚山梨酯80。在一更優選實施方案中，重建的制劑包含約120mg/ml那他珠單抗。本發明的凍干前制劑可使用適當的干燥參數凍干。下列干燥參數是優選的溫度約-25℃和壓力約80mTorr至約120mTorr的第一干燥階段；和約20℃和壓力約80mTorr至120mTorr的第二干燥階段。本發明還提供制備和使用重建的制劑的方法。附圖簡述圖1顯示30℃下高分子量物類的形成。圖2顯示40℃下高分子量物類的形成。圖3顯示30℃下凍干前溶液中低分子量物類的形成。圖4顯示40℃下凍干前溶液中低分子量物類的形成。圖5顯示5℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。圖6顯示30℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。圖7顯示40℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。圖8顯示5℃下凍干的制劑中單體隨時間的損失。圖9顯示30℃下凍干的制劑中單體隨時間的損失。圖10顯示40℃下凍干的制劑中單體隨時間的損失。圖11顯示30℃下各種制劑的低分子量物類的形成。圖12顯示40℃下各種制劑的低分子量物類的形成。圖13顯示40℃下凍干前制劑中高分子量物類的形成。圖14顯示5℃下由于聚集體的形成造成的單體損失。圖15顯示30℃下由于聚集體的形成造成的單體損失。圖16顯示40℃下由于聚集體的形成造成的單體損失。圖17顯示40℃下凍干前樣品中高分子量物類的形成。圖18顯示40℃下凍干前樣品中低分子量物類的形成。圖19顯示40℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。圖20顯示40℃下的重建時間。圖21顯示40℃下凍干樣品中高分子量物類的形成。圖22顯示40℃下凍干樣品中低分子量物類的形成。圖23顯示40℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。圖24A顯示5℃下凍干前樣品中高分子量物類的形成。圖24B顯示5℃下凍干前樣品中低分子量物類的形成。圖24C顯示5℃下凍干前樣品中單體的損失。圖25顯示40℃下凍干樣品中高分子量物類的形成。圖26A顯示40℃下重建樣品中高分子量物類的形成。圖26B顯示40℃下重建樣品中低分子量物類的形成。圖26C顯示40℃下重建樣品中單體的損失。圖26D顯示重建時間。發明實施方案詳述1.定義如本文所用，術語“免疫球蛋白”包括但不限于抗體和抗體片段(諸如scFv、Fab、Fc、(Fab′)2)和抗體的其他遺傳修飾的部分。取決于它們重鏈的恒定區的氨基酸序列，可將免疫球蛋白指定為不同的類別。有五大類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些中的一些可進一步劃分為亞類(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。術語“抗體”是廣義上的概念，并具體涵蓋單克隆抗體(包括激動劑和拮抗劑抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物和抗體片段(如，Fab、(Fab′)2、scFv和Fv)，只要它們展現所需的生物活性。“抗體”意指包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人類抗體、靈長類源化(primatized)抗體和經由遺傳工程產生的其他抗體。本文所用的術語“單克隆抗體”指從基本均一的抗體群體獲得的抗體，即除了以少量存在的可能的自然發生的修飾或糖基化變體，群體中的各個抗體是相同的。修飾詞“單克隆”表明所述抗體是從基本均一的抗體群體獲得的特征，而不應解釋為需要通過任何特定方法來產生抗體。術語“單克隆抗體”也包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的部分與衍生自特定物種的或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或具有同源性，而所述鏈的剩余部分與衍生自另一物種的或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的對應序列相同或具有同源性，以及此類抗體的片段，只要它們展現所需的生物活性。非人類(如，鼠、兔、牛、馬、豬和類似生物)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其他抗原結合子序列)，所述免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段含有最少量源自非人類免疫球蛋白的序列。術語“那他珠單抗”指也稱作AN100226(抗體代號)的抗體，并且是(商標名；以前的)中的活性成分。術語“那他珠單抗”是美國采用的名稱(USAN)(對藥物物質的官方非專有或通用名稱)。那他珠單抗是重組的人源化抗-α-4整聯蛋白抗體。那他珠單抗是IgG4抗體。通過引用并入本文的美國專利第5,840,299號描述了如何使用常規的合成和分子生物學方法制備重組的人源化抗-α-4整聯蛋白抗體，包括那他珠單抗。術語“凍干”、“凍干的”和“冷凍干燥的”指首先將要干燥的材料冷凍然后在真空環境中通過升華除去冰或冷凍的溶劑的過程。凍干前制劑中可包括一種或多種賦形劑以增強凍干的產品的儲存穩定性。術語“藥物制劑”指采取允許活性成分有效存在的形式，并且不含對所述制劑將要施用的受治療者有毒的其他組分的制品。“藥學可接受”賦形劑(介質、添加劑)是可合理地施用于受治療者哺乳動物以提供有效劑量的所采用的活性成分的那些賦形劑。“重建時間”是用溶液將凍干的制劑再水化為無顆粒的澄清溶液所需的時間。“穩定的”制劑是其中的蛋白質經儲存后基本保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性的制劑。測量蛋白質穩定性的各種分析技術是本領域可得的，并綜述于PeptideandProteinDrugDelivery(肽和蛋白質藥物遞送)，247-301，VincentLee編，MarcelDekker，Inc.，NewYork，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.DrugDeliveryRev.1029-90(1993)。穩定性可在選定的溫度下測量選定的時間段。“穩定的”凍干的免疫球蛋白制劑是在冷藏溫度(2-8℃)下至少12個月、優選地2年和更優選地3年；或在室溫(23-27℃)下至少3個月、優選地6個月和更優選地1年而未觀察到顯著變化的凍干的抗體制劑。穩定性的標準如下所示。如SEC-HPLC所測量的不超過10％的抗體單體被降解。優選地，如SEC-HPLC所測量的不超過5％的抗體單體被降解。再水化的溶液是肉眼分析為無色的或透明至輕微乳光。制劑的濃度、pH和同滲重摩的變化不超過+/-10％。效價在對照的70-130％內并且優選地80-120％內。觀察到不超過10％的剪切(clipping)。優選地，觀察到不超過5％的剪切。形成的聚集不超過10％。優選地，形成的聚集不超過5％。如果免疫球蛋白經肉眼檢查顏色和/或透明度或用紫外線散射、尺寸排阻層析(SEC)和動態光散射測量未顯示聚集、沉淀和/或變性的顯著增加，則它在藥物制劑中“保持了其物理穩定性”。蛋白質構象的變化可通過確定蛋白質四級結構的熒光光譜法和通過確定蛋白質二級結構的FTIR光譜法評估。如果免疫球蛋白未顯示顯著的化學改變，則它在藥物制劑中“保持了其化學穩定性”。化學穩定性可通過檢測并定量蛋白質的化學改變形式來評估。經常改變蛋白質化學結構的降解過程包括水解或剪切(通過諸如尺寸排阻層析和SDS-PAGE等方法評估)、氧化(通過諸如聯合質譜或MALDI/TOF/MS的肽作圖的方法評估)、脫酰胺(通過諸如離子交換層析、毛細管等電聚焦、肽圖譜法、異天冬氨酸測量等方法評估)和異構化(通過測量異天冬氨酸含量、肽圖譜法等評估)。如果在給定的時間免疫球蛋白的生物活性在制備藥物制劑時展現的生物活性的預定范圍內，則所述免疫球蛋白在所述藥物制劑中“保持了其生物活性”。免疫球蛋白的生物活性可通過例如抗原結合測定來確定。術語“等滲的”意指目標制劑與人類血液基本具有相同的滲透壓。等滲制劑通常具有約270-328mOsm的滲透壓。略微低滲的壓力為250-269mOsm，而略微高滲的壓力為328-350mOsm。可使用例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓力計測量滲透壓。術語“緩沖劑”包括在凍干之前使溶液pH保持在可接受范圍內的那些試劑，并可包括組氨酸、琥珀酸鹽(鈉或鉀)、磷酸鹽(鈉或鉀)、Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、檸檬酸鹽(鈉)、葡糖酸鹽和其他有機酸緩沖劑。“張力調節劑”包括可用于控制滲透壓的鹽，諸如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等。此外，冷凍保護劑(cryprotecant)、凍干保護劑和/或膨脹劑，諸如蔗糖、甘露醇、甘氨酸等，可充當張力調節劑。在本發明環境中，“治療有效量”的免疫球蛋白指有效預防或治療所述免疫球蛋白對其治療有效的病癥的量。“病癥”是將從免疫球蛋白治療中受益的任何狀況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動物易受相關病癥的那些病理狀況。優選地，所述病癥是可被識別并結合α-4整聯蛋白的免疫球蛋白諸如那他珠單抗治療和/或預防的病癥。“治療”指治療性治療和預防性或防止性措施兩方面。需要治療者包括已具有病癥者以及需要預防病癥者。“防腐劑”是一種化合物，例如，該化合物可包括在制劑中以顯著降低其中的細菌作用，因而有利于生產多用途的制劑。潛在的防腐劑的實例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基是長鏈化合物)和芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳香醇諸如苯酚、丁醇和苯甲醇，對羥基苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚。術語“患者”或“受治療者”意指包括任何哺乳動物。以治療為目的，“哺乳動物”指分類學上是哺乳動物的任何動物，包括但不限于人類、家畜和農場動物，以及動物園動物、體育場動物或寵物，諸如狗、馬、貓、牛和類似動物。優選地，所述哺乳動物是人類。優選地，在哺乳動物中治療的疾病或狀況是在施用治療有效劑量的那他珠單抗時被調節的疾病或狀況。2.免疫球蛋白制劑本發明的組合物最大限度地減少了聚集體和顆粒的形成，并確保溶解的免疫球蛋白隨時間保持其免疫反應性。所述組合物包含從水性凍干前制劑制備的無菌的、藥學可接受的凍干的制劑，所述水性凍干前制劑包含于具有中性或酸性pH(約5.5至約6.5)的緩沖劑中的免疫球蛋白、蔗糖和聚山梨酯。在一優選的實施方案中，免疫球蛋白以約30至約60mg/ml、更優選地約40至約50mg/ml和甚至更優選地約40mg/ml的濃度存在于凍干前制劑中。優選的免疫球蛋白是IgG抗體、更優選地IgG4抗體、甚至更優選地人源化重組IgG4抗體和最優選地那他珠單抗。在凍干前制劑中使用pH為約5.5至約6.5的緩沖劑。優選地，pH是約6.0。合適的緩沖劑的實例包括組氨酸、琥珀酸鹽(諸如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸緩沖劑。優選的凍干前制劑含有組氨酸，優選地約1至約12mM組氨酸。甚至更優選的凍干前制劑含有約6mM組氨酸。凍干前制劑還包含蔗糖。合適的蔗糖濃度在約20至約50mg/ml范圍中，優選地約41mg/ml。凍干前制劑還包含聚山梨酯，諸如聚山梨酯20或聚山梨酯80(分別即吐溫(Tween)20和吐溫80)和泊洛沙姆(poloxamer)(如泊洛沙姆188)。在一優選的實施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯80。聚山梨酯優選地以約0.02至約0.08％、更優選地約0.04％的重量/體積濃度存在。凍干前制劑中免疫球蛋白與蔗糖的重量比優選地在約2∶1至約0.5∶1范圍中，更優選地約1∶1。免疫球蛋白與蔗糖的摩爾比是約300∶1至約500∶1、優選地約400∶1至500∶1、更優選地約450∶1。可任選地向本發明組合物中添加提供良好的凍干的餅狀物(cake)性質的膨脹劑，諸如絲氨酸、甘氨酸和甘露醇。這些試劑還對制劑的張力有貢獻，并可針對凍融過程提供保護和改善長期穩定性。此外，可向制劑中添加張力調節劑以控制滲透壓。所述制劑還可包含一種或多種防腐劑。優選的凍干前制劑是包含約40mg/ml那他珠單抗、約6mM組氨酸(pH約6)、約0.04％聚山梨酯80和約41mg/ml蔗糖的制劑。將上述凍干前制劑凍干以形成干燥的、穩定的粉末，其可容易地重建為適合施用于人類的無顆粒溶液。凍干是藥品制備中經常使用的用來保存其生物活性的冷凍干燥過程。制備液體組合物，然后將其凍干以形成干燥的餅樣產物。該過程一般牽涉在真空下將先前冷凍的樣品干燥以除去冰，使非水組分保持不變，形成粉狀或餅樣物質。凍干的產物可儲存更長的時間和在更高的溫度下儲存，而不損失生物活性，并可通過添加適當的稀釋劑而容易地重建為無顆粒溶液。適當的稀釋劑可以是生物學可接受并且凍干的粉末在其中完全溶解的任何液體。水尤其是無菌無熱原的水是優選的稀釋劑，因為它不包括可影響抗體穩定性的鹽或其他化合物。凍干的優點是將水含量降低至大大減少各種分子事件的水平，所述分子事件導致長期儲存的產物的不穩定。凍干的產物還更容易抵擋運輸中的物理應力。重建的產物是無顆粒的，因而它可以施用而無需事先過濾。本發明的凍干前制劑可使用適當的冷凍和干燥參數凍干。例如，參數可包括在約10℃至約-10℃保持約10-30分鐘的預冷凍。冷凍參數可包括在-50℃至-70℃冷凍約45分鐘至約75分鐘的時間。另外的冷凍步驟的參數可包括在-40℃至約-60℃冷凍。干燥參數可包括約溫度-10℃至-30℃和壓力約40mTorr至約120mTorr的第一干燥階段；約10℃至約25℃的第二干燥階段，使用約40mTorr至120mTorr的壓力。優選的總循環時間是約60至100小時。優選的凍干循環可包括預冷凍步驟、冷凍步驟、第一干燥步驟和第二干燥步驟。凍干循環的考慮因素包括冷凍溫度、壓力、第一干燥、第二干燥和循環時間。例如，優選的凍干循環參數可以是如下參數首先，預冷凍，在0℃保持15分鐘。對于冷凍，在60分鐘內斜坡下降至-60℃。在-60℃保持60分鐘。在另外的冷凍步驟中，斜坡下降至-50℃并保持30分鐘。對于第一干燥，在45分鐘內斜坡上升至-15℃并將壓力降低至50mTorr。在-15℃和50mT壓力下保持54小時。對于第二干燥，在35分鐘內斜坡上升至20℃并保持24小時。總循環時間是82小時。此凍干的產物保留了免疫球蛋白的免疫活性的穩定性，并防止意欲施用于人類受治療者的免疫球蛋白在最終產物中發生物理和化學降解。使用時將凍干的產物在稀釋劑(如，無菌的水或鹽水)中再水化以產生無顆粒溶液。甚至在將凍干的餅狀物在環境溫度長期儲存之后，重建的抗體溶液仍是無顆粒的。重建的溶液可胃腸外優選地肌內或皮下施用于受治療者。凍干的產物的一個重要特性是重建時間或再水化產物所花的時間。為了實現非常快速和完全的再水化，餅狀物具有高度多孔的結構是重要的。餅狀物結構是許多參數的函數，所述參數包括蛋白質濃度、賦形劑類型和濃度以及凍干循環的過程參數。一般而言，重建時間隨蛋白質濃度增加而增加，因此，短的重建時間是開發高濃度凍干的抗體制劑的重要目標。長的重建時間可由于使蛋白質暴露于更濃縮的溶液更長時間而減損產物品質。此外，在使用者方面，產物在其完全再水化之前是不能施用的。這是為了確保產物是無顆粒的、施用了正確的劑量且其無菌性不受影響。因此，快速的再水化，諸如再水化時間少于十分鐘，為患者和醫生提供更多方便。在凍干的產物中，可通過在目標蛋白濃度下凍干制劑并用與起始灌裝體積的體積相同的體積重建產物來獲得所需的劑量。也可通過凍干更大體積的稀釋制劑并用較少的體積重建來獲得所需的劑量。例如，如果所需的產品劑量是1mL制劑中的100mg蛋白質，則可用下列液體配置凍干制劑1mL100mg/mL、2mL50mg/ml或4mL25mg/mL蛋白質制劑。在所有情況下，最終產物可用1mL稀釋劑重建以獲得100mg/mL的目標蛋白質濃度。不過，由于降低了凍干前制劑中的蛋白質濃度，灌裝體積成比例增加。這相應增加了凍干循環的長度(尤其是第一干燥時間)，并因此顯著增加了產物的成本。例如，如果1mL灌裝體積(在小瓶中1mm高度)的冷凍材料花費大約1小時來升華其中的游離水，那么10mL灌裝體積(10mm高度)的冷凍產物將花費大約10小時的第一干燥時間。因此，具有濃縮的凍干前制劑(免疫球蛋白濃度為約40mg/ml至約50mg/ml)是有利的，以使凍干過程更加有效。本發明提供高度濃縮的凍干前免疫球蛋白制劑(約40mg/ml至約50mg/ml)，其被有效率地和有效力地凍干成保留免疫球蛋白的生物、物理和化學穩定性的干燥制劑。所述干燥制劑可在室溫下穩定儲存至少3個月、優選地6個月。所述干燥制劑可在小于十分鐘的短時間內重建為含有約80mg/ml至約160mg/ml免疫球蛋白的無顆粒溶液。此類高度濃縮的抗體溶液能夠用于胃腸外施用諸如靜脈內、肌內、腹膜內或皮下注射。優選的重建的產物包含約80mg/ml至約160mg/ml那他珠單抗、更優選地約120mg/ml那他珠單抗；約123mg/ml蔗糖；約0.12％聚山梨酯80；和約18mM組氨酸，約pH6.0。3.分析方法用于評估產物穩定性的方法包括尺寸排阻層析(SEC)、動態光散射測試(DLS)、差示掃描量熱法(DSC)、異天冬氨酸定量、效價、340nm下的UV、UV光譜法和FTIR。SEC(J.Pharm.Scien.，831645-1650，(1994)；Pharm.Res.，11485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.，151928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.，141133-1140(1986))測量產物中的單體百分比，并給出可溶性聚集體量的信息。可通過抗體結合其抗原的能力測量其效價或生物特性(bioidentity)。抗體與其抗原的特異性結合可通過本領域技術人員已知的任何方法定量，所述方法例如免疫測定，諸如ELISA(酶聯免疫吸附測定)。這些(there)方法僅僅是本領域技術人員公知的評估產物穩定性的方法的示例。例如，340nm下UV測量340nm的散射光強度并給出關于可溶聚集體和不溶聚集體的量的信息。UV光譜法測量278nm下的吸光度并給出蛋白質濃度的信息。FTIR(Eur.J.Pharm.Biopharm.，45231(1998)；Pharm.Res.，121250(1995)；J.Pharm.Scien.，851290(1996)；J.Pharm.Scien.，871069(1998))測量酰胺一區的IR譜圖并給出蛋白質二級結構的信息。特定的分析方法還列舉于以上文獻的實驗部分。4.重建的制劑的使用本發明的重建的免疫球蛋白制劑可根據已知的方法施用于需要用所述免疫球蛋白治療的哺乳動物。這些方法可包括但不限于作為快速濃注或通過持續一段時間的連續輸注的靜脈內施用，通過肌內、腹膜內、腦脊內(intracerobrospinal)、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口腔、局部或吸入路徑。在優選的實施方案中，免疫球蛋白制劑通過肌內或皮下施用而施用于哺乳動物。典型的每日劑量范圍可為約1μg/kg至約200mg/kg受治療者體重或更多、更優選地約0.01mg/kg至約150mg/kg受治療者體重、更優選地約0.1mg/kg至約100mg/kg受治療者體重、更優選地約1mg/kg至約75mg/kg受治療者體重和最優選地約3mg/kg至約6mg/kg受治療者體重。通常，醫生將施用免疫球蛋白直至達到實現所需的效應的劑量。此療法的進度可容易地使用常規方法和測定來監測。免疫球蛋白的適當劑量將取決于例如治療的狀況、狀況的嚴重度和進程、所述免疫球蛋白的施用是用于預防還是治療目的、先前的治療、患者的臨床史和對免疫球蛋白的響應、所用的免疫球蛋白的類型和主治醫生的判斷。通常，醫生將施用免疫球蛋白直至達到實現所需效應的劑量。此療法的進度可容易地使用常規測定監測。免疫球蛋白適合一次或在一系列治療中施用于患者，并可在診斷之后的任何時間施用于患者。免疫球蛋白可作為單一治療或聯合在治療相關狀況中有用的其他藥物或療法施用。如本文所用，當兩種(或多種)藥劑同時施用或以使所述藥劑同時期起作用的方式獨立施用時，即說它們是組合施用。例如，本發明的那他珠單抗制劑可與其他治療劑或物理療法組合施用以治療類風濕性關節炎、多發性硬化(MS)、克隆氏病和α-4介導的其他疾病。本發明進一步通過下列實施例說明，其不應被解釋為將本發明限制于其中描述的特定程序的范圍。實施例實施例1在食蟹猴中對那他珠單抗的高濃度重建的凍干制劑和液體制劑進行了比較研究。研究的結果顯示那他珠單抗的重建的凍干制劑產生與液體制劑非常相似的預期的藥物代謝動力學(pharmakokinetic)和藥效學圖譜。評估了那他珠單抗的高濃度液體制劑和重建的凍干制劑以比較它們的相應的藥物代謝動力學/藥效學圖譜、相對生物利用度以及皮下(SC)和肌內(IM)給藥后的局部耐受能力。液體(150mg/mL)和重建的凍干的(120mg/mL)高濃度制劑二者在第1天各自通過血管外路徑施用，并在第36天評估它們的藥物代謝動力學/藥效學圖譜。還在第1天施用單次30mg劑量的商業的液體那他珠單抗以確定所述高濃度制劑的相對生物利用度。SC和IM給藥組的動物在第36天施用第二注射，并在第39天對注射部位進行活檢以評估局部耐受能力。測試品商業的液體那他珠單抗、液體高濃度那他珠單抗和凍干的高濃度那他珠單抗由BiogenIdec供應。重建的凍干的那他珠單抗重建液、注射用無菌水作為水性溶液供應。在每個給藥日使用貯存測試品的新鮮小瓶，并將對其進行配制以產生適當濃度的給藥溶液。將三十只未經受過實驗的食蟹猴(15只雄性和15只雌性)分配到如下面的表1中所示的五個給藥組表1*商業的液體那他珠單抗；**液體高濃度那他珠單抗；***重建的凍干的高濃度那他珠單抗IV＝靜脈內；SC＝皮下；IM＝肌內；M/F＝雄性/雌性在所有組中觀察到與實驗前基線值相比，外周血淋巴細胞(和在較小程度上，嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和未分類的細胞)的藥理學相關增加，并將其視為測試品的預期藥效學作用。與較低IV劑量的商業的制劑(通常第8天至第15天)相比，接受較高SC和IM劑量的那他珠單抗的個體動物中受影響的白細胞的水平的增加一般持續更長時間(如，第8天至第36天)。然而，不存在響應幅度或持續時間作為測試品的液體還是凍干的高濃度制劑、性別或施用路徑的函數的一致的或明顯的差異。商業的液體IV劑量組最快達到平均Tmax，且對于高濃度制劑，IM組比SC組更快。當與商業的液體IV劑量組相比時，平均Cmax值小于各路徑的比例劑量，并且在血管外施用時，其在高濃度制劑中是一致的。平均t1/2值在所有劑量組中是一致的，而與路徑無關。平均AUClast和AUCinf二者均大于SC和IM劑量組中的比例劑量而與制劑無關，表明完全的吸收(即相對生物利用度為100％)，并且當血管外施用時，這在制劑之間也非常一致。與所有劑量組中中存在的研究前基線相比，觀察到循環淋巴細胞計數和在較小程度上嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和未分類的細胞計數的預期的測試品相關的增加。這些結果與α4-整聯蛋白飽和圖譜一致，并且歸因于那他珠單抗的藥理學作用。受影響的白細胞計數增加的持續時間是劑量依賴性的，并且通常是液體高濃度那他珠單抗治療組和凍干的高濃度那他珠單抗治療組(如，第8天至第36天)與接受靜脈內商業的液體制劑的組(通常第8天至第15天)相比更高。未觀察到相對于那他珠單抗的高濃度液體制劑和重建的凍干制劑之間的這些白細胞群體變化的一致性差異，或認為與施用路徑(皮下或肌內注射)或動物的性別相關的任何差異。總而言之，在食蟹猴中，以120mg劑量(重建的凍干制劑)皮下和肌內注射后的重建的凍干的高濃度那他珠單抗制劑是良好耐受的，并且產生預期的藥理學相關的外周血淋巴細胞計數的增加，該增加與商業的液體制劑的單次30mg靜脈內劑量后的相當，但持續時間略長。實施例那他珠單抗目前是作為1至2小時時間段的IV輸注遞送的。這要求患者訪問醫院或專門的輸注中心。為了使那他珠單抗的遞送更加方便，需要皮下施用。開發較低濃度的大量(bulk)藥物物質的凍干制劑是有利的，所述凍干制劑之后可以較高濃度重建。這里描述的研究設計為篩選各種起始和最終蛋白質濃度對使用蔗糖作為賦形劑的穩定性的效應(研究A)。本研究的第二部分設計為篩選其他公知的凍干保護劑和賦形劑對蛋白質穩定性的效應(研究B)。還進行了檢查就灌裝體積和重建體積方面而言具有合適的制備能力的溶液的工作。在研究A中，制備了四種制劑以檢查起始和最終蛋白質濃度對凍干前散裝物(bulk)和凍干的餅狀物的實時和加速的穩定性的效應。所有四種凍干前制劑展現充分的穩定性以用作凍干前散裝物，其在5℃下保持時間達6個月。兩種凍干制劑展現充分的制劑特性和穩定性，考慮將其作為進一步制劑開發的候選物。這些制劑中的一種由起始濃度為40mg/mL而重建濃度為100mg/mL的重量比為1∶1的蛋白質與蔗糖組成。第二種候選制劑含有50mg/mL起始濃度和重建濃度為200mg/mL的重量比為2∶1的蛋白質與蔗糖。兩種制劑均含有組氨酸緩沖劑和聚山梨酯80。此外，制備了與現有的那他珠單抗(TysabriTM)制劑具有相同的賦形劑圖譜的高濃度液體制劑。在5℃下，此制劑展示了對聚集體形成的充分穩定性，以將其考慮作進一步開發的候選物，雖然脫酰胺速率要快于凍干制劑中的速率。在加速溫度下，此制劑顯示形成低分子量降解產物的傾向，而在凍干制劑中未觀察到相同程度。實驗設計材料這些研究中使用的那他珠單抗是從BiogenIdec供應的、2003年2月生產的那他珠單抗制備的。在用于這些制劑研究之前，此材料已進行配制并裝入小瓶，因此，需要匯集該材料并除去聚山梨酯80。簡要而言，這是通過滲濾至低離子強度、高pH(10mMtris、10mMNaCl、pH8.5)緩沖液中實現的。在這些條件下將所述材料結合于DEAE-瓊脂糖凝膠柱，然后用10mM磷酸鈉、140mMNaCl在pH6下洗脫。然后在進一步配制之前，將柱洗脫物滲濾至6mM組氨酸、pH6，并濃縮至70至100mg/mL。化學品和試劑除了注明的之外，此研究中使用的所有化學品和試劑均購自VWR，并且是ACS級或更好的。方便時使用USP級試劑作為賦形劑。聚山梨酯80購自Sigma(目錄號P6474)，并且是植物來源和低過氧化物的。研究A的制劑下列制劑是通過將賦形劑和活性劑的貯存溶液稀釋至如表2研究A制劑參數所示的期望濃度而制備的。所有制劑在pH6下配制。表2研究A制劑參數。縮寫Ab＝抗體，his＝組氨酸，PS80＝聚山梨酯80研究B的制劑下列制劑是通過將賦形劑和活性劑的貯存溶液稀釋至如表3研究B制劑參數所示的期望濃度而制備的。所有制劑為pH6。表3研究B制劑參數。縮寫Ab＝抗體，his＝組氨酸，PS80＝聚山梨酯80方法制劑的制備將溶液過濾滅菌并按所示灌裝于無菌玻璃小瓶。用于凍干前分析的所有樣品和3944-18L以0.5mL灌裝于2cc小瓶、加塞并加蓋。要凍干的配方物(formulas)以下列體積灌裝于5ccKimble小瓶制劑3944-18A-2.5mL，制劑3944-18B-1.25mL，制劑3944-18C-2mL，制劑3944-18D-1.5mL。研究B的所有制劑以2mL灌裝于5ccKimble小瓶。凍干循環對于研究A，將小瓶在-20℃下冷凍。周末時冷凍干燥機發生故障，溫度降至-70℃。重啟凍干循環的隨后嘗試使溫度在再冷凍之前升至3-4℃。重啟冷凍干燥機，繼續所述循環。第一干燥在-20℃下以100mTorr真空執行20小時。然后在100mTorr下將溫度在3小時內斜坡上升至20℃并保持30小時，以進行第二干燥。對于研究B，將小瓶在-50℃下冷凍2小時以確保均勻的冷凍。然后在100mTorr真空下于20min內將溫度升至-40℃。然后在100mTorr真空下于20分鐘內將溫度斜坡上升至-25℃，并且第一干燥持續20小時。在100mTorr下于10小時內將架溫度緩慢地斜坡上升至20℃，以開始第二干燥，然后在20℃保持4小時。研究設置將凍干前液體、高濃度液體對照和凍干的餅狀物的小瓶置于5、30和40℃下。在2、4、8和12周時測定儲存在40℃下的樣品。在3、6、9和12周時測定儲存在30℃下的樣品。在4、8和12周時測定儲存在5℃下的樣品。對于一些制劑，在6個月和1年時分析30℃和5℃下的其他小瓶。在凍干前和凍干后的零時測定所有制劑。測定樣品通過以下方法測定。并非在所有時間點執行所有測定。除凍干前樣品的零時外，對每種測定取樣兩小瓶。肉眼檢查外觀肉眼檢查所有樣品并記錄其外觀。檢查凍干的餅狀物的顏色、均勻性、強度和回熔跡象。檢查液體和重建樣品的顏色、透明度和顆粒的存在。殘留水分和重建時間使用KarlFischer在零時測定凍干的餅狀物的殘留水分(BOP000-01290)。通過添加適當體積的DI水、然后輕輕渦旋來測量重建時間。記錄餅狀物完全溶解的時間(EOP000-01292)。濃度測量了所有樣品的濃度。使用那他珠單抗安慰劑將樣品稀釋至1mg/mL。使用Varian300Bio分光光度計和1cm光程比色杯以200nm/分鐘掃描400至240nm的UV吸光度。記錄最大λ下的吸光度，并通過將該值除以1.498(那他珠單抗的吸光系數)和調節適當的稀釋度而確定濃度。濁度使用10mm小體積比色杯(StarnaCellsInc.目錄號16.160-Q-10\Z20)測量純樣品的300至400nm的吸收。報告在360nm下記錄的值。尺寸排阻層析使用修飾的BiogenSOP22d.505確定單體、高分子量物類、二聚體和低分子量物類的量。將樣品上樣至凈(neat)柱并調節上樣體積以允許柱上有大約400μg質量。將參考材料上樣的質量也調節至相當水平。記錄215和280nm二者下的檢測，不過215nm下的主峰超出范圍，所以使用280nm的跡線進行此處報告的計算。陽離子交換層析執行了陽離子交換層析。由于層析系統的差異，稍微修改了梯度以使主峰在9至12分鐘洗脫。因為使用的系統是雙泵，所以僅在每組分析后執行高鹽洗滌。沒有證據表明在高鹽洗液中有以晚保留時間洗脫的任何峰。因為每種樣品后不執行高鹽洗滌，所以再平衡時間縮短至7分鐘。效價通過VCAM溶解產物測定(AAM001-00965)和Jurkat細胞測定(AAM001-00700)分析所選樣品的效價。研究A的結果此研究設計為用于檢查初始蛋白質濃度和最終蛋白質濃度二者對凍干的餅狀物參數、重建時間和穩定性的效應的篩選研究。初步研究顯示，蔗糖向那他珠單抗提供充分的短期凍干保護劑性質，而甘露醇則不。為此，使用蔗糖作為凍干保護劑執行初步篩選。早期研究還顯示那他珠單抗的最優pH是pH6。磷酸鹽、檸檬酸鹽和組氨酸緩沖劑是此pH下最常用的緩沖劑。由于冷凍后的pH變化，磷酸鹽緩沖劑對于在蛋白質的凍干中使用不是最優的。檸檬酸鹽緩沖劑已牽涉一些皮下制劑中的注射疼痛。因此，選擇組氨酸作為優選的緩沖劑物類。初始濃度固定為6mM，以便于制備制劑和保持重建后的最終濃度在30mM或低于30mM。對于研究3A，凍干前溶液中的聚山梨酯80濃度保持在0.02％，因為已顯示這可向蛋白質提供充分的保護，并且還保持最終濃度在0.1％或低于0.1％。蔗糖濃度選擇為保持蛋白質與糖的1∶1至2∶1的重量比，并仍保持最終溶液是接近等滲的。凍干前制劑和液體制劑附錄中的表格含有所有制劑的所有記錄結果。經肉眼檢查，所有制劑顯示無色和透明至乳光，沒有任何可見的顆粒。如所預期的，乳光在某種程度上隨蛋白質濃度增加而增加。在分析的變化范圍內，沒有樣品顯示蛋白質濃度的變化，并且也沒有觀察到這種趨勢。如360nm下的吸光度所測量的，在研究的5℃下6個月或30℃下12周內，濁度未顯示變化。對于40、50和75mg/mL下的樣品，40℃凍干前樣品顯示濁度隨時間的輕微增加。20mg/mL凍干前樣品和高濃度液體未展示40℃樣品中的這種趨勢。監測了所有制劑的二聚體、高分子量聚集體和低分子量物類的形成。制成表格的結果顯示于附錄的表格中。圖1和2顯示30℃和40℃下的高分子量物類形成。在5℃下，儲存6個月的任何制劑中的高分子量物類水平沒有變化。5℃數據顯示在這里。30℃的結果(圖1)未顯示儲存12周后任何凍干前制劑的高分子量物類形成的趨勢。高濃度液體制劑于30℃下儲存6個月后顯示高分子量物類的明確增加。在40℃下，對于凍干前制劑，高分子量物類的形成直到儲存4周后才顯示開始。然后高分子量物類的量持續增加。高離子強度的高濃度液體制劑顯示較低的高分子量物類起始百分比，但是在40℃下的3個月研究中，其量顯示以恒定速率增加。圖3和4顯示凍干前溶液中30℃和40℃下的低分子量物類形成。30℃下的3個月儲存過程中，低分子量物類的水平僅有非常小的變化，但是觀察到明確的上升趨勢。在6個月時，僅測定了高濃度液體。在該時間，已存在可觀量的低分子量物類，幾乎6％。40℃下的儲存過程中，有低分子量物類形成的明確趨勢。此溫度下的形成率顯示某種濃度依賴性，因為較高濃度樣品顯示更快的形成。另外，30℃和40℃下的低分子量物類形成顯示以更快速率領先于高分子量物類的形成，使得這成為液體樣品中的重要降解途徑。對于在5℃下儲存的樣品，6個月時間段內的低分子量物類百分比的變化非常小。此數據顯示于附錄中，但是沒有在這里制成圖表。所有凍干前制劑從大約0.6-0.9％的初始水平升至6個月的0.15％。即使在5℃下儲存6個月，高濃度液體未顯示任何低分子量物類。圖5、6和7顯示在各種溫度下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。在2-8℃下，單體百分比幾乎沒有變化。這將表明，在2-8℃下儲存6個月，這些制劑中的任一種作為凍干前制劑具有適當的穩定性高濃度液體制劑在2-8℃下也未顯示變化。30℃樣品顯示單體的非常輕微的減少。此變化是由于形成低分子量物類。這也表明，這些制劑的任一種在室溫下將展現充分的穩定性以允許加工。在6個月時，高濃度液體顯示伴隨低分子量物類增加的單體的損失。在40℃下測試的三個月時間段內，所有制劑顯示單體的損失。損失速率顯示與蛋白質濃度粗略相關，100mg/mL液體制劑和75mg/mL凍干前制劑顯示最快的損失速率。對由于低分子量物類形成造成的降解機制的進一步研究可提供對此降解路徑的更好穩定。通過陽離子交換層析分析所選的樣品。在所有情況下，結果顯示隨基于時間和溫度的儲存的向更酸性物類的變化(脫酰胺)。各種凍干前制劑之間沒有差異。因為脫酰胺一般受pH、離子強度和某些緩沖劑物類的影響，所以可預期到此結果。在5℃下，高濃度液體制劑的降解與凍干前制劑沒有顯著不同。然而，其在30℃和40℃兩種溫度下均顯示顯著更快的降解。這最有可能是由于高離子強度和磷酸鹽緩沖劑的存在。凍干制劑表5-12顯示作為凍干制劑在5℃、30℃和40℃下儲存的樣品的穩定性的結果。所有制劑在40℃儲存12周、30℃和5℃儲存6個月。此外，在于30℃和5℃下1年后分析制劑3944-18B和3944-18C。在初始時間點分析制劑的殘留水分。殘留水分比所需的高，很可能是由于凍干循環中經歷的問題。這些樣品的殘留水分在5-6％范圍內。測量了重建的時間，其與起始和最終蛋白質濃度直接相關。從75mg/mL蛋白質溶液凍干的餅狀物耗費平均15-20分鐘重建。從50mg/mL凍干的樣品耗費平均6-7分鐘、從40mg/mL的耗費5-6分鐘，且從20mg/mL的耗費4-5分鐘。這些值是變化的，但是未顯示關于儲存時間或溫度的任何趨勢。檢查了重建的小瓶的外觀。所有樣品為透明至乳光、無色且沒有顆粒。在30℃下儲存1年的兩種制劑顯示一些輕微的黃色。濁度測量為360nm下的吸光度的函數。當在40℃下儲存12周時間段時，所有制劑顯示濁度的上升。當在30℃下儲存多達12個月時，所有制劑顯示濁度的較不明顯的上升。當在5℃下儲存達一年時，除制劑3944-18C外，所有制劑顯示濁度的輕微上升。(參見附錄E-H中的表格)。未觀察到手動灌裝和材料重建本身的正常變化之外的蛋白質濃度的變化。通過尺寸排阻層析分析了重建的樣品的低分子量和高分子量降解產物二者的形成。低分子量降解在一些時間點是明顯的，但是未觀察到形成的趨勢。任何樣品中所有時間點的量都低于0.2％，認為這是通過BiogenIdec的測定的檢測限。降解的主要途徑是通過形成二聚體和更高階聚集體。單體隨時間的損失顯示于圖8、9和10。在40℃儲存下，有一些單體損失，損失最快的是制劑3944-18D和3944-18C。制劑39944-18B和3944-18A顯示的向下的趨勢要不顯著得多。在30℃下觀察到了相似級別的趨勢，3944-18D和3944-18C顯示更快的單體損失。在5℃下3944-18A和3944-18D儲存6個月以及3944-18B和3944-18C儲存達一年，沒有制劑顯示單體的損失。通過陽離子交換層析分析所選的樣品。制劑之間未顯示任何差異。在5℃下，有從71％主峰至66％主峰的轉換。酸性峰的百分比隨時間保持得相當恒定，但是堿性峰的百分比隨時間增加，從初始時間點的8-10％增加至一年后的14-15％。30℃和40℃樣品展現相似的趨勢，堿性峰百分比達到30℃下一年后的18-19％和40℃下3個月后的22-26％。需要另外的實驗來表征此反應途徑和確定降解物類的來源。研究B的結果制劑的選擇研究B設置為研究除蔗糖外的賦形劑對那他珠單抗穩定性的效應并驗證研究A中觀察到的結果。基于研究A的結果，確定40-50mg/mL的起始濃度對于良好的餅狀物形成和重建特性是最優的。蛋白質與蔗糖的比值固定為2∶1重量比，初始濃度為50mg/mL，重建濃度目標為200mg/mL。此外，檢查了起始濃度為40mg/mL和目標重建濃度為160mg/mL的一種制劑。此制劑還具有1.6∶1重量比的蛋白質與蔗糖的比值。制劑3976-4C含有與研究A中的3944-18C相同的制劑。研究A中檢查了凍干前溶液的穩定性，所以B中不予以重復。文獻報道表明向高濃度的蛋白質溶液添加低水平的氯化鈉可幫助降低這些溶液的粘性。制劑3976-4G具有向凍干前配方中添加的15mMNaCl以檢查NaCl的效應。聚山梨酯20(PS20)經常代替聚山梨酯80(PS80)用于蛋白質制劑中。在制劑3976-4H中，0.02％PS80取代為等量的PS20。在制劑3976-4I中，等量的海藻糖取代了蔗糖。凍干前的制劑分析了凍干前制劑的外觀。無論儲存溫度如何，沒有觀察到任何溶液的外觀發生顯著的變化。它們全部是無色和輕微乳光且沒有顆粒出現。沒有任何制劑的蛋白質濃度發生變化。測量了所有時間點的濁度。對于制劑3976-4G，初始濁度測量值很高，但在隨后的時間點保持得相當恒定。未在任何制劑中觀察到濁度的變化趨勢，雖然3976-4G的測量值在所有溫度下持續高于其他制劑。監測了由于二聚體和高分子量聚集體的形成和由于低分子量片段的單體損失。如先前觀察的，在5℃下多達3個月，沒有任何樣品的單體百分比具有變化。還分析了在5℃下6個月的制劑3976-4K，并且沒有顯示單體百分比的變化。圖11和12分別顯示30℃和40℃下各種制劑的低分子量物類形成。如先前觀察的，在40℃下，所有制劑中都有低分子量物類的顯著形成，3976-4K中的形成率稍微低些，其具有較低的蛋白質濃度。這些結果與研究A中觀察到的那些相當。另外，賦形劑看來對此反應沒有影響。在30℃下，低分子量物類有輕微的上升。此比率也與先前在研究3A中觀察到的在12周后達到0.2至0.4％相當。在40℃下，除3976-4H外的所有制劑中的高分子量物類有輕微的增加，3976-4H含有PS20(圖13)。在其他溫度下，沒有任何制劑的高分子量具有變化。看來所有制劑對于聚集體的形成都是穩定的，并且主要的降解途徑是在升高的溫度下形成低分子量物類。這些制劑中的任一種對于進一步開發用作凍干前散裝藥物都是充分穩定的。在初始時間點對所有制劑執行陽離子交換層析，但在5℃儲存下6個月后僅對3976-4K執行。如研究A中觀察到的，儲存后有向更酸性物類的變化。此降解是由pH和溫度驅動的。凍干制劑在初始時間點分析了所有樣品的水分、餅狀物外觀和重建時間。所有餅狀物的餅狀物外觀都是可接受的。水分水平比研究A中略低，通常在3％至4％之間，制劑3976-4I例外，其具有5.4％水分。所有時間點和溫度下所有樣品的重建時間通常是可接受的并且低于10分鐘，少量例外耗費10至14分鐘。制劑3976-4K顯示更快的重建時間，其具有最低的起始蛋白質濃度。重建后，在所有溫度下，除3976-4I和3976-4G外的所有樣品保持無色和輕微乳光至乳光多達12周。在40℃和12周，3976-4I為非常的乳光。從30℃下的6周以及5℃和40℃下的8周開始，3976-4G為非常的乳光。添加NaCl看起來的確降低制劑的粘性，如重建過程中較少的起泡和泡沫形成的趨勢所觀察到的，不過，它還顯示溶液乳光的顯著增加。分析了在5℃下6個月和1年的制劑3976-4C。在5℃下一年后，3976-4C顯示輕微的黃色。分析了在5℃和30℃下6個月和1年的制劑3976-4K。在30℃下儲存6個月后，制劑3976-4K顯示輕微的黃色，但是在5℃下1年后則沒有。通過尺寸排阻層析分析了在40℃下多達3個月的樣品。在5℃和30℃下，分析了多達3個月的樣品，然后在一年時間點進行分析。此外，還在6個月時分析制劑3976-4C和3976-4K。在所有樣品中，低分子量物類的量低于0.2％。降解的主要途徑是由于形成二聚體和高分子量物類。圖14、15和16顯示每種溫度下由于形成聚集體造成的單體損失。很明顯在所有溫度下，制劑3976-4I中的單體損失都快于其他制劑，制劑3976-4I含有海藻糖。含有PS20和NaCl的制劑顯示與含有蔗糖和PS80的制劑相當的降解。在所有溫度下，制劑3976-4K顯示最慢的單體損失。此制劑具有較低的起始蛋白質濃度、較低的重建濃度和較高的蔗糖與蛋白質的比值。通過陽離子交換層析分析所選的樣品。此測定的結果在一定程度上是變化的，但是在5℃下所有制劑顯示對電荷分布的變化是穩定的。在40℃下，所有制劑顯示主峰的減少和酸性及堿性物類二者的增加。還在來自制劑3976-4K的樣品中觀察到了此趨勢，該樣品在30℃下儲存1年后進行分析。在8周時間點，在VCAM溶解產物和Jurkat細胞測定中分析了在5℃和40℃下儲存的制劑3976-4K的效價。結果顯示在表中。表4效價測定結果用于開發那他珠單抗的高濃度凍干制劑的形成篩選研究結論凍干前的散裝制劑在高濃度液體制劑中，在5℃下多達6個月時沒有單體損失，然而存在酸性物類的增加，這可能是由于脫酰胺造成的。對于30℃下6個月和40℃下3個月，此制劑顯示通過高分子量和低分子量降解物類二者的形成的單體損失。如果不經進一步的優化，當前制劑中的高蛋白質濃度液體可能不展現充分的長期穩定性以用作合適的商業制劑。在5℃下儲存3至6個月時，沒有凍干前制劑顯示任何顯著的單體損失。這些制劑的脫酰胺的量的變化與在高濃度液體中觀察到的相當。在30℃下儲存多達3個月，制劑顯示很小或未顯示二聚體和高分子量聚集體的增加，然而形成的低分子量片段化物類的量增加。在40℃下，低分子量物類的增加快于高分子量物類的增加。低分子量物類的增加速率顯示與蛋白質濃度相關。一般而言，含有50mg/mL或更低的蛋白質濃度以及組氨酸、蔗糖和PS80的制劑看起來展示用于凍干前散裝物的充分的穩定性。凍干制劑在所有溫度和時間點下，從50mg/mL或更低濃度凍干并重建為100至200mg/mL的制劑顯示良好的餅狀物形成和可接受的重建時間。在5℃下多達一年，含有組氨酸、蔗糖和PS80的制劑沒有單體損失。這些制劑中的一些在儲存一年后顯示堿性物類的輕微增加；然而，鑒于測定的變化性，此增加難以進行定量。在升高的溫度下蛋白質降解的主要路徑是形成二聚體和高分子量聚集體。添加NaCl降低了粘性，但造成溶液濁度的增加。用PS20取代PS80顯示對穩定性沒有效應，而用海藻糖取代蔗糖增加聚集體的形成速率。含有蔗糖、組氨酸和聚山梨酯80以及那他珠單抗的凍干制劑展示充分的穩定性以移至臨床前和早期臨床研究中。將執行另外的研究以優化起始蛋白質濃度、蔗糖與蛋白質的比值、重建的蛋白質濃度和凍干循環。此外，還將檢查重建的樣品的穩定性。實施例3如下文證明的，具有略微不同的初始蛋白質濃度的三種制劑成功進行了凍干并在于5℃儲存6個月時顯示優秀的穩定性。這些制劑在40℃下儲存8周的穩定性與先前觀察到的穩定性相當。凍干前制劑在5℃下儲存6個月和重建的溶液在5℃或25℃下儲存一周的穩定性也是優秀的。40mg/mL的起始濃度比其他制劑顯示略微更好的穩定性和更好的重建特性。不過，此制劑的重建確實允許150mg/mL下1mL的可遞送劑量。材料下表列出了材料和它們的來源。表22表23那他珠單抗用于此研究的那他珠單抗與研究3A和研究3B中使用的相同(AQS-2190)。用于這些研究的那他珠單抗是從BiogenIdec供應的那他珠單抗制備的。在用于此制劑研究之前，除去此材料(其已進行配制并裝入小瓶)中包括的聚山梨酯80。簡要而言，將材料滲濾至低離子強度、高pH(10mMtris、10mMNaCl、pH＝8.5)緩沖液。在這些條件下將所述材料結合于DEAE-瓊脂糖凝膠柱，然后用10mM磷酸鈉、140mMNaCl在pH6下洗脫。然后在進一步配制之前，將柱洗脫物滲濾至6mM組氨酸、pH6，并濃縮至70至100mg/mL。化學品和試劑除了注明的之外，此研究中使用的所有化學品和試劑均購自VWR，并且是ACS級或更好的。方便時使用USP級試劑作為賦形劑。聚山梨酯80購自Sigma(目錄號P6474)，并且是植物來源和低過氧化物的。制劑下列制劑是通過將賦形劑和活性劑的貯存溶液稀釋至期望濃度而制備的。所有制劑為pH6。表24研究4制劑參數縮寫Ab＝抗體，his＝組氨酸，PS80＝聚山梨酯802.2方法制劑的制備將樣品制劑過濾滅菌并按所示灌裝于無菌玻璃小瓶。用于凍干前分析的所有樣品以0.5mL灌裝于3cc小瓶、加塞并加蓋。要凍干的配方物以4.0mL灌裝于5ccKimble小瓶。凍干循環在冷凍階段過程中，將含有樣品的小瓶首先冷卻至5℃并保持30分鐘。然后在20分鐘內將溫度斜坡下降至-5℃并在-5℃保持60分鐘。對于最后的冷凍階段，在45分鐘內將小瓶溫度斜坡下降至-40℃，在此溫度下保持2小時，其中最后20分鐘應用100mTorr真空。然后執行第一干燥，即在100mTorr真空下在20min內將溫度升至-25℃并保持34小時。在100mTorr下于10小時內將架溫度緩慢地斜坡上升至20℃，以開始第二干燥，然后在20℃保持6小時。研究設置將凍干前液體和凍干的餅狀物的小瓶置于5和40℃。在2、4和8周時測定儲存在40℃下的樣品。在4周和6個月時測定儲存在5℃下的樣品。在4周時間點時，將來自各儲存溫度下的4小瓶重建，之后將2小瓶置于5℃而將2小瓶置于25℃，以獲得1周的重建穩定性。在凍干前和凍干后的零時測定所有制劑。測定樣品通過以下方法測定，并且結果呈現于表27-30。并非在所有時間點執行所有測定。除凍干前和凍干后樣品的零時外，對每種測定取樣兩小瓶。肉眼檢查外觀肉眼檢查所有樣品并記錄其外觀。檢查凍干的餅狀物的顏色、均勻性、強度和回熔跡象。檢查液體和重建樣品的顏色、透明度和顆粒的存在。殘留水分和重建時間使用KarlFischer電量滴定儀在零時測定凍干的餅狀物的殘留水分。通過添加適當體積的DI水、然后輕輕渦旋來測量重建時間。記錄餅狀物完全溶解的時間。濃度測量了所有樣品的濃度，使用那他珠單抗安慰劑將樣品稀釋至1mg/mL。使用VarianCary300Bio和10mm光程比色杯以200nm/min掃描400至250nm的UV吸光度。記錄最大λ下的吸光度，并通過將該值除以1.498(那他珠單抗的吸光系數)和調節適當的稀釋度而確定濃度。濁度使用10mm小體積比色杯(StarnaCellsInc.目錄號16.160-Q-10\Z20)測量純樣品的300至400nm的吸收。報告在360nm下記錄的值。尺寸排阻層析通過尺寸排阻層析確定樣品中單體、高分子量聚集體、二聚體和低分子量物類的量。簡要而言，將樣品上樣至凈柱并調節上樣體積以允許柱上有大約400uμg質量。將參考材料上樣的質量也調節至相當水平。記錄215和280nm二者下的檢測，不過215nm下的主峰超出范圍，所以使用280nm的跡線進行計算。結果呈現于表27-30。結果凍干前制劑表27-30含有所有制劑的記錄結果。經肉眼檢查，所有制劑顯示無色和輕微乳光，沒有任何可見的顆粒。在5℃或40℃下，外觀不隨時間改變。在分析的變化范圍內，沒有樣品顯示蛋白質濃度的變化，并且也沒有觀察到這種趨勢。如360nm下的吸光度所測量的，所有制劑的濁度在5℃下6個月后顯示輕微的增加。對于所有三種制劑，40℃凍干前樣品顯示濁度隨時間的增加。監測了所有制劑的二聚體、高分子量(聚集體)和低分子量物類的形成。結果顯示于表格和圖17-19中。圖17顯示40℃下高分子量物類的形成。在凍干前制劑中，高分子量物類的形成直到儲存4周后才顯示開始。在8周時，高分子量物類的少量增加是明顯的。在5℃下，儲存6個月后沒有任何制劑的高分子量物類水平具有變化。此數據顯示于附錄中，但是沒有在這里制成圖表。圖18顯示40℃下低分子量物類的形成。40℃下的儲存過程中，有低分子量物類形成的明確趨勢。另外，低分子量物類的形成顯示以更快速率領先于高分子量物類的形成，使得這成為液體樣品中的重要降解途徑。對于在5℃下儲存的樣品，6個月時間段內的低分子量物類百分比的變化非常小。此數據顯示于附錄中，但是沒有在這里制成圖表。所有凍干前制劑從大約0.11％的初始水平升至6個月的0.18％。BiogenIdec已顯示此測定的定量下限是0.2％。低于該水平的值的報告僅是為了趨勢信息。圖19顯示40℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。在5℃下，單體百分比幾乎沒有變化。這將表明，在2-8℃下儲存6個月，這些制劑中的任一種作為凍干前制劑具有適當的穩定性。通過陽離子交換層析分析所選的樣品。在所有情況下，結果顯示隨基于時間和溫度的儲存的向更酸性物類的變化(脫酰胺)。各種凍干前制劑之間沒有差異。因為脫酰胺一般受pH、離子強度和某些緩沖劑物類的影響，所以可預期到此結果。此數據顯示于下表中。所有三種凍干前制劑顯示與研究3A和3B中的凍干前制劑相似的結果。凍干制劑下面的表25顯示為了達到150mg/mL的蛋白質濃度所測試的重建體積。然后使用確定為最接近目標濃度的重建體積進行其余的實驗。每種樣品完全溶解后，確認濃度。對4089-1L、4089-1M和4089-1N使用的重建體積分別為0.85、1.0和1.1mL。表25重建體積下面的表26顯示從重建的樣品中取出1mL劑量的能力。僅有4089-1N是可能的，其用1.1mL重建。這些數據表明，為了產生1mL150mg/mL的最終可遞送體積，4mL的灌裝體積和50mg/mL的蛋白質濃度將是必需的。表261mL劑量的評估穩定性經肉眼檢查，所有制劑顯示具有可接受的凍干的餅狀物，證實4mL體積可在5mL小瓶中成功凍干。重建后，所有制劑顯示無色和輕微乳光，沒有任何可見的顆粒。在5℃或40℃下，外觀不隨時間改變。在分析的變化范圍內，沒有樣品顯示蛋白質濃度的變化，并且也沒有觀察到這種趨勢。如360nm下的吸光度所測量的，所有制劑的濁度在5℃下6個月后顯示輕微的增加，從大約0.099-0.104至0.111-0.116。對于所有制劑，40℃凍干前樣品顯示濁度隨時間的增加。凍干的餅狀物的水分百分比在4.3至5.6范圍內，如KarlFischer電量滴定儀所測量的。4089-1L、4089-1M和4089-1N的平均水分百分比分別為4.5、5.2和4.9。這些樣品中的水分相當高。此研究的重建時間全部低于17分鐘。圖4顯示40℃下的重建時間。在40℃下，顯示有隨儲存增加重建時間的輕微趨勢。具有較高起始蛋白質濃度的樣品還顯示更長重建時間的趨勢。在更早的研究(研究A和B)中也注意到了這一點。監測了所有制劑的二聚體、高分子量聚集體和低分子量物類的形成。制成表格的結果顯示于下面的表格中。圖5顯示40℃下高分子量物類的形成。在此溫度下的儲存過程中，有高分子量物類形成的明確趨勢。制劑4089-1L中聚集體的形成速率顯示略慢。不希望受理論的束縛，這可能是由于起始制劑的較低蛋白質濃度或略高的蔗糖與蛋白質的比值。在5℃下，儲存6個月后沒有任何制劑中的高分子量物類水平具有變化，其展示為不同時間的％HMW。圖6顯示40℃下低分子量物類的形成。與展現低分子量物類的形成快速增加的凍干前樣品相反，凍干的樣品在8周內未顯示變化。對于在5℃下儲存的樣品，6個月時間段內的低分子量物類百分比沒有變化。此數據顯示于附錄中，但是沒有在這里制成圖表。圖7顯示40℃下由于高分子量和低分子量兩種物類的形成造成的單體的總損失。在5℃下，單體百分比基本沒有變化。這將表明，在2-8℃下儲存達6個月或更長，這些制劑中的任一種作為凍干制劑具有適當的穩定性。還通過陽離子交換層析分析樣品。在40℃下8周后，所有情況下的結果顯示向更堿性物類的變化。在測定的可變性內，電荷分布的變化非常小。選擇樣品還在該時間點顯示向更酸性物類的輕微轉變。此數據顯示在下表中的最后一列，為％酸性、％主峰和％堿性。重建的穩定性在5℃或40℃下儲存4周后，重建樣品，然后將其置于5℃和25℃下1周以獲得重建的穩定性。測試在初始時間點和1周時執行。附錄中的表格含有所有制劑的所有記錄結果。經肉眼檢查，所有制劑顯示無色和輕微乳光。除了兩種樣品外，所有樣品顯示沒有顆粒。含有“蓬松的”白色顆粒的兩小瓶在重建之前已在40℃下儲存，然后在25℃下儲存1周。分析者可能已在打開這些小瓶用于初始時間點測試時污染了它們。在分析的變化范圍內，沒有樣品顯示蛋白質濃度的變化，并且也沒有觀察到趨勢。在分析的變化范圍內，如360nm下的吸光度所測量的，在5℃或25℃下1周后，所有制劑的濁度未顯示變化。監測了所有制劑的二聚體、高分子量(聚集體)和低分子量物類的形成。結果顯示于下表中。在重建和置于5℃或25℃下1周后，沒有任何制劑中的高分子量物類水平具有變化。在重建后于25℃儲存下，低分子量物類的水平顯示略微增加，并基本保持與5℃重建儲存后的相同。這些結果顯示，如果重建然后置于5℃或25℃下1周，所有制劑將保持穩定。還通過陽離子交換層析分析了在5℃下儲存的樣品的重建穩定性。所有三種制劑的結果顯示1周后更酸性物類的輕微增加，無論重建之前其儲存溫度如何。重建之前已在5℃下儲存的樣品還顯示儲存1周后向更堿性物類的輕微轉變。重建之前在40℃下儲存的樣品在5℃下儲存1周后顯示較少的向更堿性物類的轉變。這些變化非常小，并且可能更多地指示測定的可變性而不是蛋白質的實際變化。結論前述研究4顯示4mL體積可在5mLKimble小瓶中成功凍干并具有可接受的餅狀物結構。確定給出150mg/mL的目標蛋白質濃度的重建體積為4089-1L(40mg/mL凍干前濃度)0.85mL、4089-1M(45mg/mL凍干前濃度)1.0mL和4089-1N(50mg/mL凍干前濃度)1.1mL。4089-1N是能夠遞送1mL劑量的唯一制劑，顯示1.1mL水是需要的最小重建體積。這些結果可用于指導開發的關于灌裝體積、總固體和重建體積的最終表示法(presentation)。一般而言，具有較低初始蛋白質濃度和較高蔗糖與蛋白質的比值的樣品顯示更短的重建時間和就單體損失方面而言略好的穩定性。基于灌裝體積和重建體積，這指示較低的最終蛋白質濃度可給出更需要的產品。重建穩定性顯示，在5℃和25℃下儲存1周，所有制劑是穩定的，沒有單體損失。所有三種凍干前制劑在5℃下保持穩定超過6個月。然而，在40℃下儲存時，所有制劑顯示低分子量物類的量增加的趨勢。鑒于低分子量物類的快速率形成，顯示低分子量物類的形成是液體樣品中重要的降解途徑。還證明凍干制劑在5℃下穩定多達6個月。在40℃下儲存時，有高分子量物類的量增加的明確趨勢，而低分子量物類的量保持相同。這顯示高分子量物類的形成是凍干的樣品中更重要的降解途徑。殘留水分水平和蔗糖與蛋白質的比值的另外優化應改善穩定性。那他珠單抗重制劑開發表37表38實施例4此研究的目的是使用實驗設計來確定最終蛋白質濃度和最優的蛋白質與蔗糖的比值對于那他珠單抗的凍干的效應，以防止和最大限度減少聚集體形成。實驗設計參數檢查了40mg/mL至160mg/mL的最終蛋白質濃度，蛋白質與蔗糖的比值為1∶100至1∶500。聚山梨酯80水平保持恒定為每10mg/mL蛋白質0.01％的量，且組氨酸保持恒定為每40mg/mL蛋白質10mM。起始蛋白質濃度(凍干前)將是40mg/mL。小瓶以2mL灌裝，然后重建至所需的最終蛋白質濃度。檢查了在40攝氏度下0、2、4和6周的短期穩定性。程序1.將當前制劑對下列緩沖液之一滲濾。然后超濾至蛋白質濃度＞40mg/mL。測量蛋白質濃度并稀釋至40mg/mL。a.制劑SA100∶1蔗糖∶蛋白質比-最終制劑7、8、9b.制劑SB300∶1蔗糖∶蛋白質比-最終制劑1、2、5、6、10c.制劑SC500∶1蔗糖∶蛋白質比-最終制劑3、4、112.以2mL/小瓶灌裝20小瓶各種制劑。這允許10小瓶用于40度下的穩定性分析和另外的小瓶用于Tg、水分、FTIR分析、同滲重摩等的分析。需要的量為a.制劑SA120mLb.制劑SB200mLc.制劑SC120mL3.使用保守的循環凍干小瓶以降低水分，并將其重建至期望的蛋白質濃度a.制劑4、6、8-用2mL重建以獲得40mg/mL的最終濃度b.制劑1、2、5、6、10-用0.8mL重建以給出100mg/mL的最終濃度c.制劑1、3、9-用0.5mL重建以給出160mg/mL的最終濃度4.通過濁度、濃度、外觀、SEC檢查在40度下2、4和6周時的穩定性。可在0和6周時運行其他測定，諸如IEX、非還原型SDS-PAGE和氧化。表53凍干25C％HMWA1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B1100.500.510.450.440.510.580.790.760.770.520.4641.031.020.700.721.020.922.342.332.381.020.7161.131.120.750.751.121.142.712.692.761.140.7581.251.230.800.801.241.273.203.163.221.240.76121.401.380.820.831.391.393.673.663.731.370.83％LMWA1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B1100.000.000.000.000.000.090.000.000.000.000.0040.070.080.070.060.070.070.090.080.090.070.0660.080.070.070.060.070.070.090.090.090.070.0680.110.090.090.080.100.080.090.110.110.090.10120.080.080.080.070.080.070.100.100.100.080.07％單體A1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B11099.5099.4999.5599.5699.4999.3299.2299.2499.2399.4899.54498.8998.9099.2299.2298.9198.9097.5797.5897.5398.9199.22698.7998.8199.1899.1998.8098.7997.2097.2297.1598.8099.18898.6498.6799.1199.1298.6798.6596.7196.7396.6798.6799.141298.5298.5599.1099.1098.5398.5496.2296.2596.1698.5599.09表54凍干25C％HMWA1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B1100.500.510.450.440.510.580.790.760.770.520.4640.650.650.560.590.660.650.991.011.020.660.5780.680.670.570.580.670.671.101.091.140.680.58120.710.720.600.580.720.691.171.181.210.720.58％LMWA1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B1100.000.000.000.000.000.090.000.000.000.000.0040.070.060.070.060.070.060.070.070.080.060.0680.100.080.100.070.080.070.080.070.080.080.09120.080.070.090.070.060.070.050.070.070.070.08％單體A1A2B3B4A5A6C7C8C9A10B11099.5099.4999.5599.5699.4999.3299.2299.2499.2399.4899.54499.2799.2899.3799.3599.2799.2898.9498.9298.9099.2899.37899.2299.2599.3499.3499.2499.2598.8398.8498.7999.2399.331299.2199.2199.3299.3599.2299.2498.7898.7598.7299.2199.34表57重建穩定性實施例5本文描述的制劑是含有那他珠單抗、蔗糖、組氨酸和聚山梨酯80的凍干的餅狀物。凍干前散裝藥物物質含有40mg/mL抗體、41mg/mL蔗糖、0.04％聚山梨酯80和6mM組氨酸HCl、pH6.0。將此以每小瓶4mL灌裝、凍干、并用1.0mL水重建至120mg/mL、123mg/mL蔗糖、0.12％聚山梨酯80和18mM組氨酸HCl、pH6.0。凍干前的那他珠單抗組合物由BiogenIdec提供。其在磷酸緩沖鹽溶液中配制，并加工為硫酸銨溶液。然后將此材料滲濾至制劑緩沖液(不含聚山梨酯)并濃縮至40mg/mL。然后添加適當量的聚山梨酯80，將所述材料過濾滅菌至聚丙烯瓶，并在灌裝和凍干之前在2-8℃下儲存4周。使用手寫批記錄在非GMP套件(suite)中執行灌裝和凍干。在灌裝之前對套件進行清潔，并且所有灌裝操作在層流柜中執行。凍干使用VirtisGensis25EL冷凍干燥機執行。穩定性研究由三個分部(arm)組成，一個檢查凍干前那他珠單抗組合物在建議的儲存溫度(2-8℃)下多達一年和在25℃的加速的溫度下多達6個月的穩定性。凍干的組合物小瓶在建議的儲存溫度(2-8℃)下儲存12個月、在25℃下6個月和在40℃下3個月。重建來自2-8℃分部的各個時間點的小瓶并在2-8℃(建議的溫度)和25℃(加速的)兩種溫度下儲存1周。執行關于外觀、A280、pH、非還原型和還原型SDS-PAGE、陽離子交換層析和尺寸排阻層析方面的質量控制穩定性測試。材料、方法和測試時間點將測試下列樣品表58.樣品配置表59.研究方法*非破壞型，使用小瓶進行后續測試。**需要對方法進行修改，參見下文的3.3節。表60.研究方法**使用一小瓶進行所有5種測定表61.凍干前散裝物的穩定性測試和時間點權利要求1.一種通過凍干水性制劑制備的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑包含(a)約20mg/ml至約80mg/ml那他珠單抗；(b)具有約5.5至約6.5的pH的緩沖劑；(c)約20mg/ml至約80mg/ml蔗糖；和(d)約0.02至約0.08％聚山梨酯。2.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑包含約30mg/ml至約80mg/ml那他珠單抗。3.根據權利要求2所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑包含約40mg/ml那他珠單抗。4.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述緩沖劑具有約6.0的pH。5.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述緩沖劑是組氨酸。6.根據權利要求5所述的穩定的凍干制劑，其中所述組氨酸以約1mM至約12mM的濃度存在于所述水性制劑。7.根據權利要求6所述的穩定的凍干制劑，其中所述組氨酸以約6mM的濃度存在于所述水性制劑。8.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述蔗糖以約20mg/ml至約80mg/ml的濃度存在于所述水性制劑。9.根據權利要求8所述的穩定的凍干制劑，其中所述蔗糖以約41mg/ml的濃度存在于所述水性制劑。10.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。11.根據權利要求10所述的穩定的凍干制劑，其中所述聚山梨酯80以約0.02％至約0.08％的濃度存在于所述水性制劑。12.根據權利要求11所述的穩定的凍干制劑，其中所述聚山梨酯80以約0.04％的濃度存在于所述水性制劑。13.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑中那他珠單抗與蔗糖的重量比為約0.5∶1至約2∶1。14.根據權利要求13所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑中那他珠單抗與蔗糖的重量比為約1∶1。15.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約300∶1至約500∶1。16.根據權利要求15所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約400∶1至約500∶1。17.根據權利要求16所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約450∶1。18.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑還包含膨脹劑。19.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑還包含張力調節劑。20.根據權利要求1所述的穩定的凍干制劑，其中所述水性制劑包含(a)約40mg/ml那他珠單抗；(b)約6mM組氨酸，pH約6.0；(c)約41mg/ml蔗糖；和(d)約0.04％聚山梨酯80。21.一種穩定的重建制劑，其包含(i)約80至約160mg/ml那他珠單抗；(ii)約18mM組氨酸，pH約6.0；(iii)約123mg/ml蔗糖；和(iv)約0.12％聚山梨酯80；其中所述重建制劑是從穩定的凍干制劑制備的，所述穩定的凍干制劑是通過凍干包含以下的水性制劑制備的(a)約40mg/ml那他珠單抗；(b)約6mM組氨酸，pH約6.0；(c)約41mg/ml蔗糖；和(d)約0.04％聚山梨酯80。22.根據權利要求21所述的穩定的重建制劑，其中所述穩定的重建制劑包含約120mg/ml那他珠單抗。23.一種用于制備穩定的重建制劑的方法，所述方法包括重建凍干的制劑，所述凍干的制劑是通過凍干包含以下的水性制劑制備的(a)約30至約60mg/ml那他珠單抗；(b)具有約5.5至約6.5的pH的緩沖劑；(c)約20至約50mg/ml蔗糖；和(d)約0.02至約0.08％聚山梨酯。24.根據權利要求24所述的方法，其中所述水性制劑包含約40mg/ml至約50mg/ml那他珠單抗。25.根據權利要求25所述的方法，其中所述水性制劑包含約40mg/ml那他珠單抗。26.根據權利要求23所述的方法，其中所述緩沖劑具有約6.0的pH。27.根據權利要求23所述的方法，其中所述緩沖劑是組氨酸。28.根據權利要求28所述的方法，其中所述組氨酸以約1mM至約12mM的濃度存在于所述水性制劑。29.根據權利要求29所述的方法，其中所述組氨酸以約6mM的濃度存在于所述水性制劑。30.根據權利要求23所述的方法，其中所述蔗糖以約20mg/ml至約50mg/ml的濃度存在于所述水性制劑。31.根據權利要求31所述的穩定的凍干制劑，其中所述蔗糖以約40mg/ml的濃度存在于所述水性制劑。32.根據權利要求23所述的方法，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述聚山梨酯80以約0.02％至約0.08％的濃度存在于所述水性制劑。34.根據權利要求33所述的方法，其中所述聚山梨酯80以約0.04％的濃度存在于所述水性制劑。35.根據權利要求23所述的方法，其中所述水性制劑中那他珠單抗與蔗糖的重量比為約0.5∶1至約2∶1。36.根據權利要求35所述的方法，其中所述水性制劑中那他珠單抗與蔗糖的重量比為約1∶1。37.根據權利要求23所述的方法，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約300∶1至約500∶1。38.根據權利要求37所述的方法，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約400∶1至約500∶1。39.根據權利要求38所述的方法，其中所述水性制劑中蔗糖與那他珠單抗的摩爾比為約450∶1。40.根據權利要求23所述的方法，其中所述水性制劑還包含膨脹劑。41.根據權利要求23所述的方法，其中所述水性制劑還包含張力調節劑。42.根據權利要求23所述的方法，其中所述水性制劑包含(a)約40mg/ml那他珠單抗；(b)約6mM組氨酸，pH約6.0；(c)約41mg/ml蔗糖；和(d)約0.04％聚山梨酯80。43.一種用于治療受治療者的方法，所述方法包括向所述受治療者施用治療有效量的根據權利要求23所述的穩定的重建制劑，其中所述受治療者具有可通過施用那他珠單抗治療的病癥。全文摘要本發明總體來說涉及免疫球蛋白的藥物制劑領域。具體地，本發明涉及穩定的、凍干的、高濃度免疫球蛋白制劑。本發明舉例說明了重組人源化抗-α-4整聯蛋白抗體那他珠單抗的穩定化的凍干制劑。文檔編號G01N33/574GK101827608SQ200880102173公開日2010年9月8日申請日期2008年6月13日優先權日2007年6月14日發明者芭芭拉·霍西·奧康納,肖恩·E·巴克利,戴維·J·伯克,舍伍德·拉斯·萊爾曼申請人:伊蘭制藥公司