用于從蛋白制劑去除內毒素的材料和方法
【專利說明】用于從蛋白制劑去除內毒素的材料和方法
[0001]相關申請的聲明
[0002]本申請要求于2013年2月22日提交的美國臨時申請號61/768，232的優先權，該申請的全部內容通過弓I用整體地結合于本文中。
【背景技術】
[0003]本文公開的實施方案涉及用于減小蛋白制劑中的內毒素水平的方法，所述蛋白制劑包括未純化的、部分純化的、和高度純化的制劑。內毒素是源自革蘭氏陰性細菌的細胞壁的脂多糖。它們是生物制劑中普遍存在的污染物，其造成了嚴重的問題，因為它們是廣譜細胞毒素，能夠混淆研究結果，在診斷測定中得出錯誤結果，并且使得期望的治療性產品不能安全的使用。這使得具有將它們從其駐留的生物制劑中去除的有效材料和方法是重要的。已經開發了許多這樣的材料和方法。已知的實例包括通過陰離子交換色譜處理制劑，在陰離子交換色譜中在許多情況下內毒素比樣品中的所需蛋白更強力的結合(Chen, R.,等，Protein Express1n and Purificat1n 2009,64,76-81)。其他已知的實例包括輕磷灰石色譜(Gagnon, P.，等，B1Process Internat1nal 2006, 4, 50-60),固定化金屬親和色譜(Tan, L.，等，Journal of Chromatography A 2007, 1141, 226-234),利用固定化組氨酸或多粘菌素B的親和色譜(Anspach, F.，等，Journal of ChromatographyA 1995，711，81-92)，利用固定化多粘菌素B的親和色譜，利用固定化的從鱟變形細胞重組得到的內毒素-結合肽的親和色譜(Ding, J.，等，Journal of ChromatographyB 2001，759，237-246)，利用表面活性劑 Triton X-113 的微分萃取(Cotten, M.，等，Gene Therapy 1994，1，239-246)，和大量的專有商業產品和方法(Kang, Y.，等，ProcessB1chemistry 2000,36,85-92) ；Salema, V.,等，Pharmaceutical Technology Europe2009, 21, 36-41) ；Clutterbuck, A.,等，B1pharm Internat1nal 2007, 20, 24-31) 0 所有這些方法利用了內毒素的脂質-A和核心多糖區域的特性，脂質-A和核心多糖區域一起參與了強力的疏水相互作用)，金屬親和相互作用，和/或與帶正電荷的表面的強力的靜電相互作用。已經記載了一種稱為空隙排阻陰離子交換(void exclus1n an1n exchange)的技術用于IgG純化，該技術也減少內毒素含量(Nian, R.,等，J.Chromatography A1282(2013) 127-132)，與許多以前已知的方法相比其實現了較寬的實用性，因為它適應各種樣品，不需要它們提前平衡至特定的色譜條件，以及其實現緩沖液交換與去除內毒素相結合的能力。已經記載了一種采用過飽和尿囊素來從蛋白制劑去除內毒素的技術，其具有耐受寬范圍的化學條件的特性，所述化學條件包括寬范圍的PH、寬范圍的鹽濃度和有機添加劑(包括表面活性劑)的存在(Vagenende, V.,等，ACS.Appl.Mater.1nterfaces5 (2013) 4472-4478 ;Vagenende, V.,等，J.Chromatography A, 1310 (2013) 127-132)。

【發明內容】

[0004]在一些方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品用于通過柱中正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜進一步純化，所述填充粒子床具有粒子間體積，(iii)將樣品體積施加到所述填充粒子床，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜，并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積，和(iv)洗脫包含所需蛋白和減少量的內毒素的經純化樣品，其中所需蛋白駐留在平衡所述柱的緩沖液中，無論施加至所述柱的緩沖液的成分。
[0005]在其他方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供包含所需蛋白和減少量的內毒素的樣品。
[0006]還在其他方面，本文公開的實施方案涉及這樣的方法，所述方法包括:(i)提供包含所需蛋白的蛋白制劑作為具有樣品體積的樣品，所述樣品適合用于在柱中正電性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色譜，其中所述正電性粒子支持空隙排阻色譜，所述填充粒子床具有粒子間體積，并且其中所述樣品體積不大于所述粒子間體積；(ii)將所述樣品施加至所述填充粒子床，和(iii)洗脫包含所述所需蛋白和減少量的所述內毒素的經純化樣品。
【具體實施方式】
[0007]在一些實施方案中，已經發現與常規處理相比，兩步處理提供更通用和有效的內毒素減少，所述兩步處理包括將內毒素污染的包含所需蛋白的蛋白制劑與處于過飽和濃度的尿囊素孵育，接著以空隙排阻模式在填充的正電性粒子上進行色譜。與已知方法相反，不溶的尿囊素與內毒素共沉淀，顯然兩者通過氫鍵鍵合。不受限于理論，與尿囊素形成氫鍵的那部分內毒素可能包括已知為O-抗原的部分，核心多糖，或脂質A部分。已經指出，由于依賴于氫鍵結合，尿囊素對內毒素的親和力不受PH、鹽濃度的寬范圍變化，或有機溶劑的存在的顯著影響。空隙排阻陰離子交換步驟可以結合內毒素的核心多糖和脂質-A區域。尿囊素親和性和空隙排阻步驟的組合由此潛在地靶向內毒素分子的所有區域，這可能是雙重處理系統的高內毒素去除效率的原因。方法組合還克服了通過尿囊素去除內毒素的潛在缺點，即經處理的樣品含有可溶的殘留尿囊素并且可能含有其他組分，包括鹽和有機添加劑，這可能干擾內毒素減少的樣品的應用。由于空隙排阻步驟支持緩沖液交換的同步功能，并且其效力不受PH、導電率、或施加于其的蛋白制劑的其他性質影響，在去除固體后的經尿囊素處理的樣品可以方便地直接施加至空隙排阻柱，從空隙排阻柱所述經尿囊素處理的樣品在平衡所述柱的緩沖液中洗脫，并且所述緩沖液可以被配制成滿足缺少內毒素的蛋白的預期應用的要求。在許多情況下，空隙排阻步驟提供了實現對所需蛋白的高度純化的額外益處。然而空隙排阻步驟的基本作用仍然是增加由尿囊素所達到的內毒素減少因數。在一些情況下，尿囊素比空隙排阻更有效地去除內毒素；在一些情況下，該種模式是相反的，但在至今觀察到的所有情況下，除了具有上文提及的其他益處外，組合還比任一種單獨情況去除得更多。
[0008]因此，在一些實施方案中，提供了一種方法，其包括:(i)將尿囊素以過飽和量添加至蛋白制劑中，所述蛋白制劑包含所需蛋白和作為污染物的至少一種內毒素，(ii)在所述添加步驟后去除固體以提供樣品用于通過空隙排阻陰離子交換色譜進一步純化，(iii)將樣品體積施加到正電性粒子的填充床，其中所述正電性介質支持空隙排阻色譜，其中所述樣品體積不大于所述填充粒子床的粒子間體積，和(iv)洗脫包含所需蛋白和減少量的內毒素的經純化樣品。這種采用尿囊素接著采用空隙排阻色譜的兩階段方法可以提供去除了大于約99 %內毒素的所需蛋白，在其他實施方案中，去除大于約99.5 %，在其他實施方案中，大于約99.99 %的內毒素。在一些實施方案中，所述方法可以提供沒有可觀察到的、直至檢測限的內毒素雜質的所需蛋白。
[0009]在一些實施方案中，過飽和量的尿囊素包括選自由下列各項組成的組的量:(i)約 10%，(ii)約 5%，(ii)約 0.6-約 6%，(iii)約 6% -約 10%，(iv)約 10% -約 15%，(V)約15-約20%，和(vi)大于20%，其中所述量作為重量/體積提供。本領域技術人員將會認識到每一個述及的量和范圍都構成尿囊素的過飽和量。在一些實施方案中，過飽和量可以包括未溶解的尿囊素的量。
[0010]在一些實施方案中，去除固體包括選自由下列各項組成的組的一個:離心、過濾、及其組合。這些和其他去除固體的方法是本領域技術人員所熟知的。過濾可以包括加工所需體積的樣品所需的任何規模的真空、或重力、或栗推動的過濾。
[0011]在一些實施方案中，可以在添加步驟之前、期間或之后調整蛋白制劑的pH或鹽濃度。
[0012]在一些實施方案中，可以在施加步驟之前調整蛋白制劑的pH或鹽濃度。
[0013]在一些實施方案中，施加的樣品體積不超過填充粒子床的粒子體積。在一些實施方案中，樣品體積比填充粒子床的粒子間體積小一定的量，所述量包括選自由下列各項組成的組的一個:(i)小于約40% , (ii)小于床體積的約35%，(iii)小于床體積的約30%，(iv)小于床體積的約20%，(V)小于床體積的約10%，(vi)小于床體積的約5%，(vii)小于床體積的約2%，和(viii)小于床體積的約1%。在一些實施方案中，樣品體積可以小于床體積的約40%。在具體實施方案中，施加最可能大的、同時仍然處在適合于空隙排阻色譜的范圍內的樣品體積可以是有益的，因為它們將支持每次重復的最大體積計容量。在其他具體實施方案中，施加為床體積的約35%的樣品體積可以是有益的。盡管較大的樣品可以是可用的，但與接近于理論限值的工作相比，約35%的體積可以提供對操作誤差的實用安全系數，其中這些誤差可能防止所述方法達到其最大益處。因此原因，在一些實施方案中，提供了成套裝備，其操作說明書可以有利地將樣品體積描述為床體積的約35%，由此提供克服可能的操作誤差的緩沖液。
[0014]在一些實施方案中，在施加步驟前，所述方法還包括利用緩沖液平衡陰離子交換介質的填充粒子床，所述緩沖液被選擇用于防止所需蛋白與陰離子交換介質顯著結合。在一些這樣的實施方案中，防止所需蛋白與正電性介質顯著結合包括提供具有足夠低的PH的緩沖液。在一些這樣的實施方案中，防止所需蛋白與正電性介質顯著結合包括提供具有足夠高的鹽濃度的緩沖液。
[0015]因此，在一些實施方案中，緩沖液可以具有的pH包括選自由下列各項組成的組的一個:⑴約7，(ii)約8，(iii)約6，和(iv)約6-約8的范圍。本領域技術人員將會認識到操作PH可以是較高的值、較低的值或任意的中間值，并且確切的條件將在個例的基礎上通過對特定的所需蛋白的常規優化來確定。因此，在此給出的值僅代表對用于典型的所需蛋白的初步操作條件的初始指導。例如，在具體實施方案中，PH可以包括較高的值諸如9、10、11、12等。同樣，在具體實施方案中，pH可以包括較低的值諸如5、4、3等。在一些實施方案中，鹽濃度可以影響PH的合適范圍，并且反過來pH可以影響鹽濃度的合適范圍。
[0016]在一些實施方案中，緩沖液包含的氯化鈉濃度包括選自由下列各項組成的組的一個:(i)約 OmM, (ii)約 50mM, (iii)約 150mM,和(iv)約 OmM-約 150mM 的范圍。再次，本領域技術人員將認識到較高的或中間的濃度可以達到所需的結果，取決于被純化的特定的所需蛋白的性質。在一些實施方案中，OmM氯化鈉，即，不含氯化鈉可以是足夠的，并且在一些實施方案中，對于特定的所需蛋白是最佳的。
[0017]在一些實施方案中，首先被配制用來防止結合所需蛋白的平衡緩沖液的組合物可以進一步被配制用來促進最大程度的內毒素結合，從而使所公開的方法整體上